MTT原理、步骤、结果分析方法及注意事项
MTT法又称MTT比色法
MTT法又称MTT比色法,是一种检测细胞存活和生长的方法。
其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。
二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒,用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值,可间接反映活细胞数量。
在一定细胞数范围内,MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。
它的特点是灵敏度高、经济。
由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水,需被溶解后才能检测。
这不仅使工作量增加,也会对实验结果的准确性产生影响,而且溶解甲瓒的有机溶剂对实验者也有损害。
配制方法:通常,此法中的MTT 浓度为5mg/ml。
因此,可以称取MTT 0.5克,溶于100 ml的磷酸缓冲液(PBS)或无酚红的基培养基中,用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌,放4℃避光保存即可。
在配制和保存的过程中,容器最好用铝箔纸包住。
注意事项:MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力,但不能测定细胞绝对数。
在用酶标仪检测结果的时候,为了保证实验结果的线性,MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。
MTT一般最好现用现配,过滤后4℃避光保存两周内有效,或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存,避免反复冻融,最好小剂量分装,用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。
我一般都把MTT粉分装在EP管里,用的时候现配,直接往培养板中加,没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。
MTT有致癌性,用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的MTT需要无菌,MTT对菌很敏感;往96孔板加时不避光也没有关系,毕竟时间较短,或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉.配制MTT时用用PBS溶解,也有人用生理盐水配,60℃水浴助溶。
MTT配制、原理、操作步骤、结果分析、注意事项
MTT配制、原理、操作步骤、结果分析、注意事项四、实验所需材料1.MTT 溶液的配制通常MTT 配成的终浓度为5mg/ml,须用PBS或生理盐水做溶剂。
市面上一般MTT的包装为100mg,250mg或1g1.1 对于100mg这样的小包装,厂家都是将MTT放入小管中的,个人建议不要再用天平称量分装,而应该一次性将其全配制成溶液,如100mg用20mlPBS来溶解。
具休做法:预先在50ml离心管(没有的话,可用培养瓶替代)加入20ml PBS,从中先吸取500-1000ul PBS装入含MTT的小管中,吹打若干次后将其移入50ml离心管,然后再混匀。
可以重复几次,以使小管中的MTT不残留于管内。
将MTT 完全混匀后,用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌,分装避光(避光袋或是黑纸、锡箔纸包住)可长期保存于-20度。
按细胞培养板每孔需加10ul计算,一般每96孔板约需1ml,所以分装时可考虑每管分装1ml。
1.2 对于大包装,可按上述方法称取一部分溶解,也有人将粉剂分装在EP管里,用的时候现配,直接往培养板中加。
注意事项:l 在配制和保存的过程中,容器最好用铝箔纸包住。
l 配成的MTT需要无菌,MTT对菌很敏感l MTT一般最好现用现配,过滤后4度避光保存两周内(个人曾做过4度避光保存4周的MTT溶液,效果仍然不错)有效,或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存,避免反复冻融,最好小剂量分装,用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。
当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用。
l MTT有致癌性,用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.2.MTT甲瓒溶解液2.1 二甲基亚砜DMSO,可以直接溶解,无需配制,使用方便,溶解速度快,但对人体毒性较大,且需去除原培养液,在去除培养液的过程中,可能会把结晶去掉,导致结果不稳定。
2.2 三联溶解液:SDS10g,异丁醇5ml,10M HCl 0.1ml 用双蒸水溶解配成100ml溶液(文献方法:周建军等,评价抗癌物质活性的改良MTT方法,中国医药工业杂志,1993,24(10):455-457),该溶解液不需去除原培养基,但溶解较慢。
MTT法原理、步骤以及注意事项
MTT法原理、步骤以及注意事项MTT原理MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide,汉语化学名为 3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐,商品名:噻唑蓝。
是一种黄颜色的染料。
MTT比色法,是一种检测细胞存活和生长的方法。
其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。
二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒,用酶联免疫检测仪在490nm波长处(也有用570nm波长的,我目前用的都是570nm)测定其光吸收值,可间接反映活细胞数量。
在一定细胞数范围内,MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。
它的特点是灵敏度高、经济。
缺点:由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水,需被溶解后才能检测。
这不仅使工作量增加,也会对实验结果的准确性产生影响,而且溶解甲的有机溶剂对实验者也有损害。
MTT 溶液的配制方法通常,此法中的MTT 浓度为5mg/ml。
因此,可以称取MTT 0.5克,溶于100 ml 的磷酸缓冲液(PBS)或无酚红的培养基中,用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌,放4℃ 避光保存即可。
在配制和保存的过程中,容器最好用铝箔纸包住。
实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光,觉得这样比较好。
需要注意的是,MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力,但不能测定细胞绝对数。
在用酶标仪检测结果的时候,为了保证实验结果的线性,MTT 吸光度最好在0-0.7范围内。
MTT一般最好现用现配,过滤后4℃避光保存两周内有效,或配制成5mg/ml 保存在-20度长期保存,避免反复冻融,最好小剂量分装,用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。
MTT原理步骤结果分析方法及注意事项(精)
MTT原理、步骤、结果分析方法及注意事项发布日期:2006-12-6 热门指数:2025MTT分析法以活细胞代谢物还原剂3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide, MTT噻唑蓝为基础。
MTT为黄色化合物,是一种接受氢离子的染料,可作用于活细胞线粒体中的呼吸链,在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂,生成蓝色的formazan结晶,formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比(死细胞中琥珀酸脱氢酶消失,不能将MTT还原)。
还原生成的formazan结晶可在含50%的N,N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸钠(pH 4.7)的MTT溶解液中溶解,利用酶标仪测定490 nm处的光密度OD值,以反映出活细胞数目。
也可以用DMSO来溶解。
MTT粉末和溶液保存时都需要避光,用铝箔纸包好就可以。
实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光,觉得这样比较好。
MTT步骤如下:1:接种细胞:用含10%胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液,以每孔1000-10000个细胞接种到96孔板,每孔体积200ul.2:培养细胞:同一般培养条件,培养3-5天(可根据试验目的和要求决定培养时间)。
3:呈色:培养3-5天后,每孔加MTT溶液(5mg/ml用PBS <ph=7.4>配)20ul.继续孵育4小时,终止培养,小心吸弃孔内培养上清液,对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。
每孔加150ul DMSO,振荡10分钟,使结晶物充分融解。
4:比色:选择490nm波长,在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值,记录结果,以时间为横坐标,吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。
注意事项:(1)选择适当得细胞接种浓度。
(2)避免血清干扰:一般选小于10%的胎牛血清的培养液进行试验。
在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液。
MTT实验原理步骤注意事项
MTT实验原理步骤注意事项MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)实验是一种间接法测定细胞的代谢活性的方法。
MTT是一种黄色的溶液,在细胞内会被活细胞的线粒体内还原为紫色的结晶形式。
这些紫色结晶通过一定的溶解步骤转变为紫色的溶液,并使用酶标仪测量其吸光度。
吸光度的变化可以反映细胞的增殖和活性水平,从而评估药物或物质的细胞毒性。
1.细胞培养:选择需要研究的细胞株,并使用细胞培养基将其培养至对数生长期。
2.细胞接种:将对数生长期的细胞用细胞培养基洗涤,获得单细胞悬浮液,并在96孔板中接种相应的细胞密度。
3.处理药物:根据实验需求,选择适当浓度的药物或化合物,并将其加入每个孔中。
4.处理时间:根据需求和实验目的,将药物处理时间设定为不同的时间段。
5.加入MTT溶液:在处理药物和处理时间后,将MTT溶液加入每个孔中,并使其充分与细胞接触。
6.溶解晶体:处理一段时间后,将培养基和MTT溶液完全吸取,然后添加溶解晶体溶液,使晶体溶解。
7.检测吸光度:待溶解晶体完全溶解后,使用酶标仪测量每个孔的吸光度,并将结果记录下来。
8.数据分析:根据吸光度的变化,可以计算得到药物对细胞的毒性,评估药物或物质的效果。
1.培养条件:选择合适的细胞培养基和培养条件,确保细胞能够保持良好的生长状态。
2.细胞密度:将细胞密度恰当控制在合适范围内,避免过度或不足,影响实验结果。
3.药物浓度:选择适当的药物浓度范围,避免浓度过高或过低,影响实验的结果。
4.处理时间:根据需求和实验目的,选择合适的处理时间,使药物对细胞产生明显的影响。
5.溶解晶体溶液:使用溶解晶体溶液时,要充分搅拌使晶体完全溶解,避免气泡产生。
6.数据分析:对实验结果进行正确的数据分析,根据实验的目的和要求进行合理解读。
总结:MTT实验通过将MTT溶液与细胞相互作用,最终通过吸光度的变化来评估药物或物质的细胞毒性。
MTT法原理步骤以及注意事项
MTT法原理步骤以及注意事项MTT法(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide法)是一种常用的细胞活力检测方法。
它通过测量细胞对MTT染料的还原能力来评估细胞的代谢活性和存活率。
MTT法的原理简单,步骤清晰,但也需要注意一些关键点以确保结果的准确性。
下面将详细介绍MTT法的原理、步骤以及注意事项。
1.原理:MTT是一种黄色的可溶性染料,它可以进入活细胞并被还原为紫色的形式,同时在还原过程中生成的产物能够积累在细胞内,形成紫色晶体结构。
这种紫色产物可以通过加入有机溶剂(如二甲基亚砜或二甲基甲酰胺)来溶解,并且通过测量其吸光度,可以对细胞的代谢活性进行定量分析。
2.步骤:MTT法通常包括以下步骤:步骤一:培养细胞首先,需要将细胞培养在含有适当培养基的组织培养皿中,并放置在37°C的恒温培养箱中培养到细胞达到一定密度。
步骤二:接种细胞将需要检测活力的细胞接种在96孔板中,每孔含有适当数量的细胞。
通常每孔含有约1×10^4至5×10^4个细胞。
步骤三:添加MTT染料将MTT染料溶液加入到每孔中,使其与细胞均匀接触。
染料浓度通常为0.5至1mg/mL。
步骤四:孵育细胞将96孔板放回恒温培养箱中,继续孵育细胞。
通常在37℃下孵育2至4小时,使细胞有足够的时间还原MTT染料。
步骤五:加入溶解剂去除培养液后,加入溶剂(如DMSO)溶解产生的紫色晶体。
溶剂的用量通常为100µL至200µL。
步骤六:测量吸光度用多通道酶标仪或分光光度计测量溶液的吸光度。
使用波长为570nm 至650nm的滤光片进行测量,同时使用一个基准波长(例如630nm)来进行校正。
3.注意事项:-MTT染料的浓度和作用时间应根据实验要求进行优化。
过高的浓度可能引起细胞中产生结晶体积过大,影响测量准确性。
-为了确保细胞的一致性和准确性,需要在实验开始前培养细胞的时间和条件相同。
MTT实验原理、步骤、注意事项
(2)设置调零孔(只加培养基100ul、MTT10ul、二甲基亚砜100ul)。
(3)设置空白孔(细胞、药物溶解介质、培养液共100ul、10ulMTT、100ul二甲基亚砜)。
(4) MTT实验吸光度最后要在0-0.7之间,超出这个范围就不是直线关系。
(5) 96孔板边缘32孔用无菌PBS填充,因为边缘的32孔中水分蒸发很快,药物易被浓缩,对实验影响大。同时加入pbs液填充后,可以一定程度上保持中间孔的水分。
(6)防止药物与MTT反应。
如果96孔板中加入了具有氧化还原性的药物,比如谷胱甘肽、Vit E、VitC,那建议你用PBS将细胞洗洗,否则这些药物会将MTT还原成棕褐色沉淀,这种效果可能是你不需要的。
缺点:由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水,需被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加,也会对实验结果的准确性产生影响,而且溶解甲的有机溶剂对实验者也有损害。MTT溶液的配制方法:通常,此法中的MTT浓度为5mg/ml。因此,可以称取MTT0.5克,溶于100 ml的磷酸缓冲液(PBS)或无酚红的培养基中,用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌,放4℃避光保存即可。在配制和保存的过程中,容器最好用铝箔纸包住。实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光,觉得这样比较好。
7:同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜),对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)。
(2)悬浮细胞:
1:收集对数期细胞,调节细胞悬液浓度1×106/ml(细胞浓度的问题见后面的注意事项),按次序将①补足的1640(无血清)培养基40ul;②加Actinomycin D(有毒性)10ul用培养液稀释(储存液100mg/ml,需预试寻找最佳稀释度,1:10-1:20);③需检测物10ul;④细胞悬液50ul(即5×104cell/孔),共100ul加入到96孔板(边缘孔用无菌水填充)。每板设对照(加100ml 1640)
MTT原理、步骤、结果分析方法及注意事项
MTT 原理、步骤、结果分析方法及注意事项一、MTT 原理MTT 全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-2)-3,5-diphenytetrazoliumromide ,汉语化学名为3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐,商品名:噻唑蓝。
是一种黄颜色的染料。
MTT 比色法,是一种检测细胞存活和生长的方法。
其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT 还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan )并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。
二甲基亚砜(DMSO )能溶解细胞中的甲瓒,用酶联免疫检测仪在490 nm 波长处测定其光吸收值,可间接反映活细胞数量。
在一定细胞数范围内,MTT 结晶形成的量与细胞数成正比。
该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。
它的特点是灵敏度高、经济。
缺点:由于MTT 经还原所产生的甲瓒产物不溶于水,须被溶解后才能检测。
这不仅使工作量增加,这不仅使工作量增加,也会对实验结果的准确性产生影响,也会对实验结果的准确性产生影响,也会对实验结果的准确性产生影响,而且溶解甲的有而且溶解甲的有机溶剂对实验者也有损害。
二、MTT 溶液的配制方法通常,此法中的MTT 浓度为5 mg/mL 。
因此,可以称取MTT 0.5 g ,溶于,溶于100 mL 的磷酸缓冲液(PBS )或无酚红的培养基中,用0.22 μm 滤膜过滤以除去溶液里的细菌,放4℃避光保存即可。
在配制和保存的过程中,容器最好用铝箔纸包住。
纸包住。
实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光,实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光,实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光,觉得这样比较好。
觉得这样比较好。
觉得这样比较好。
需需要注意的是,MTT 法只能用来检测细胞相对数和相对活力,但不能测定细胞绝对数。
在用酶标仪检测结果的时候,为了保证实验结果的线性,MTT 吸光度最好在0-0.7范围内。
MTT
·吸光度测定 死细胞中珀酸脱氢酶消失,不能将MTT还原 为蓝紫色结晶。因此,结晶生成量与活细胞 数成正比。用DMSO溶解结晶,利用酶标仪 测定出在490nm处的光吸收值以反映出活细 胞相对数目。
原理
• 一般来讲,活细胞数越多,生成的蓝紫色结晶越多,检测 的OD就越大;活细胞数越少,生成的紫色结晶越少,OD 值越小。来自结果分析结果分析
100
细胞存活率(%)
80 60 40 20 0 0 0.78 1.56 3.12 6.25 12.5 浓度
生存率曲线(量效曲线)
结果分析
100
细胞死亡率(%)
80 60 40 20 0 0 0.78 1.56 3.12 6.25 12.5 浓度
生存率曲线(量效曲线)
结果分析
MTT实验技术介绍
内容
• MTT实验原理
• MTT法应用 • 所需材料和试剂 • 实验步骤 • 结果分析
• 注意事项
原理
MTT法是一种检测细胞存活及增殖的试 验方法。
原理
·活细胞还原 MTT为黄色化合物,是一种接受氢离子的荧 光染料,可被活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢 酶还原为不溶于水的蓝紫色甲瓒 (Formazan)结晶
二甲基亚砜(DMSO)、酶标仪、培养液、胰酶、 二氧化碳培养箱
实验步骤
胰酶消化制成细胞悬液 酶标仪震荡5min,测490nm处OD值
每孔5000个细胞接种于96孔板内
加100μl DMSO溶解颜色结晶
贴壁后加100μl药物溶液孵育24h
每孔加10μl MTT溶液,孵育3h
点板的设计排版
0 1 1 1 1 2 3 3 3 3 4 4 4 4 5 5 5 5 6 6 6 6
• 结论:活细胞数与OD值成正相关。
MTT配制原理操作步骤结果分析注意事项
MTT配制原理操作步骤结果分析注意事项MTT(3-(4,5-二苯基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2H-四唑)是一种常用的细胞增殖试验试剂,用于评估化合物对细胞生长和代谢的影响。
本文将详细介绍MTT配制、原理、操作步骤、结果分析以及注意事项。
一、MTT配制MTT的化学名称为3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,是一种黄色的晶体粉末。
配制MTT试剂的步骤如下:1.称取适量的MTT粉末,并通过过滤器将其溶解于生理盐水或无菌培养基中。
溶液应均匀搅拌,直至溶解完全。
2.过滤清洁,并将溶液分装至无菌试管中。
可以根据实验需要制备不同浓度的MTT溶液。
3.将试管密封,并在4°C保存。
二、MTT原理MTT试验是通过测定细胞内线粒体的还原能力来评估细胞代谢和活力。
MTT溶液可以被细胞内的还原酶(如线粒体呼吸链酶)还原为紫色的形式中间产物,称为甲基紫(formazan)。
甲基紫是水不溶性的,需要使用溶解剂(如二甲基亚砜)将其溶解后,通过分光光度计测量吸光度来反映细胞数量和代谢活力。
三、MTT操作步骤MTT实验的主要操作步骤如下:1.细胞培养:将需要进行实验的细胞培养至对数生长期,保证细胞状态良好。
2.细胞处理:将细胞按照需要的实验条件进行处理,例如不同浓度的化合物处理、不同时间的处理等。
3. MTT加入:将细胞处理完后,向培养基中加入适量的MTT溶液,使其终浓度为0.5mg/mL。
将培养皿放入细胞培养箱,继续培养一段时间(一般为3-4小时)。
4.MTT溶解:MTT溶液和培养基混合后形成甲基紫,需要加入适量的溶解剂(如二甲基亚砜)进行溶解,使甲基紫完全溶解。
5. 吸光度测定:使用分光光度计在570nm波长下测量甲基紫的吸光度。
吸光度值越高,表示细胞生长和代谢活力越强。
四、MTT结果分析MTT实验的结果分析主要根据细胞的吸光度值来评估细胞的代谢和增殖能力。
MTT分析法原理步骤结构分析及注意事项
MTT分析法原理步骤结构分析及注意事项MTT分析法(Mahalanobis-Taguchi-Teager)是一种多变量故障诊断方法,通过分析系统故障特征信号的高阶统计量,实现对系统故障的检测和定位。
MTT分析法主要基于马氏距离和Taguchi法则,结合Teager运算来确定系统的故障特征,可以在低信噪比环境下有效地进行故障诊断。
1. 马氏距离(Mahalanobis distance)是一种基于多维空间中点到点之间距离的度量方式,可以反映样本之间的相关性和相似性。
在MTT分析法中,通过计算故障特征信号与正常情况下的特征信号之间的马氏距离,来判断系统是否存在故障。
2. Taguchi法则是由日本的统计学家田口玛丽诺(Genichi Taguchi)提出的,主要用于优化产品和过程设计。
在MTT分析法中,通过Taguchi法则的最小二乘回归分析,得到对系统故障有显著影响的故障特征。
3. Teager运算是一种对非线性信号进行滤波和特征提取的方法,可以在信号中提取出非线性特征。
在MTT分析法中,通过Teager运算将原始信号转化为具有非线性特征的中间信号,提高了故障特征的鲁棒性。
1.数据采集:在系统正常运行时,采集系统故障特征信号的样本数据。
样本数据可以包括各种传感器的读数、振动信号、声音信号等。
2. 特征提取:利用Teager运算对采集到的原始信号进行滤波和特征提取,得到具有非线性特征的中间信号。
3. 特征选择:通过Taguchi法则的最小二乘回归分析,选取对系统故障有显著影响的故障特征。
4.马氏距离计算:在系统正常运行状态下,计算系统故障特征与正常特征之间的马氏距离。
如果马氏距离超过一些阈值,则判断系统存在故障。
5.故障定位:通过分析马氏距离的变化情况,确定系统故障的位置。
MTT分析法主要包括数据采集、特征提取、特征选择、距离计算和故障定位等步骤,其中特征提取是通过Teager运算将原始信号转化为具有非线性特征的中间信号,特征选择则通过Taguchi法则的最小二乘回归分析来选取对系统故障有显著影响的故障特征。
细胞实验-MTT法原理、操作方法步骤与注意事项
MTT原理、操作方法步骤与注意事项目录MTT原理 (1)简介 (1)MTT 溶液的配制方法 (2)普通MTT法实验步骤: (2)药物MTT法实验步骤 (2)注意事项: (3)简介MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide,汉语化学名为 3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐,商品名:噻唑蓝。
是一种黄颜色的染料。
MTT比色法,是一种检测细胞存活和生长的方法。
其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。
二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒,用酶联免疫检测仪在490nm 波长处(也有用570nm波长的,我目前用的都是570nm)测定其光吸收值,可间接反映活细胞数量。
在一定细胞数范围内,MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。
它的特点是灵敏度高、经济。
缺点:由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水,需被溶解后才能检测。
这不仅使工作量增加,也会对实验结果的准确性产生影响,而且溶解甲的有机溶剂对实验者也有损害。
MTT 溶液的配制方法通常,此法中的MTT 浓度为5mg/ml。
因此,可以称取MTT 0.5克,溶于100 ml的磷酸缓冲液(PBS)或无酚红的培养基中,用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌,放4℃ 避光保存即可。
在配制和保存的过程中,容器最好用铝箔纸包住。
实验的时候一般关闭超净台上的日光灯来避光。
需要注意的是,MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力,但不能测定细胞绝对数。
在用酶标仪检测结果的时候,为了保证实验结果的线性,MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。
MTT一般最好现用现配,过滤后4℃避光保存两周内有效,或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存,避免反复冻融,最好小剂量分装,用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。
MTT原理方法及操作步骤
MTT原理、步骤、结果分析方法及注意事项MTT原理MTT全称为3-4;5-dimethylthiahiazo -z-y1-3;5-di- phenytetrazoliumromide;汉语化学名为 3-4;5-二甲基噻唑-2-2;5-二苯基四氮唑溴盐;商品名:噻唑蓝..是一种黄颜色的染料..MTT比色法;是一种检测细胞存活和生长的方法..其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒Formazan并沉积在细胞中;而死细胞无此功能..二甲基亚砜DMSO能溶解细胞中的甲瓒;用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值;可间接反映活细胞数量..在一定细胞数范围内;MTT结晶形成的量与细胞数成正比..该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等..它的特点是灵敏度高、经济..缺点:由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水;需被溶解后才能检测..这不仅使工作量增加;也会对实验结果的准确性产生影响;而且溶解甲的有机溶剂对实验者也有损害..MTT 溶液的配制方法通常;此法中的MTT 浓度为5mg/ml..因此;可以称取MTT 0.5克;溶于100 ml的磷酸缓冲液PBS或无酚红的培养基中;用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌;放4℃避光保存即可..在配制和保存的过程中;容器最好用铝箔纸包住..实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光;觉得这样比较好.. 需要注意的是;MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力;但不能测定细胞绝对数..在用酶标仪检测结果的时候;为了保证实验结果的线性;MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内..MTT一般最好现用现配;过滤后4ºC避光保存两周内有效;或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存;避免反复冻融;最好小剂量分装;用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解..我一般都把MTT粉分装在EP管里;用的时候现配;直接往培养板中加;没必要一下子配那么多;尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了..MTT有致癌性;用的时候小心;有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的MTT需要无菌;MTT对菌很敏感;往96孔板加时不避光也没有关系;毕竟时间较短;或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉.配制MTT时用PBSph=7.4溶解..PBS配方:Nacl 8g + Kcl 0.2g + Na2HPO4 1.44g + KH2PO4 0.24g调pH 7.4;定容1L..普通MTT法实验步骤:1:接种细胞:用含10%胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液;以每孔1000-10000个细胞接种到96孔板;每孔体积200ul.2: 培养细胞:同一般培养条件;培养3-5天可根据试验目的和要求决定培养时间..3:呈色:培养3-5天后;每孔加MTT溶液5mg/ml用PBS配制;pH=7.420ul.继续孵育4 h;终止培养;小心吸弃孔内培养上清液;对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液..每孔加150ul DMSO;振荡10min;使结晶物充分融解..4:比色:选择490nm波长;在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值;记录结果;以时间为横坐标;吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线..药物MTT法实验步骤贴壁细胞:1: 收集对数期细胞;调整细胞悬液浓度;每孔加入100ul;铺板使待测细胞调密度 1000- 10000 孔;边缘孔用无菌PBS填充..2: 5%CO2;37℃孵育;至细胞单层铺满孔底96孔平底板;加入浓度梯度的药物;原则上;细胞贴壁后即可加药;或两小时;或半天时间;但我们常在前一天下午铺板;次日上午加药.一般5-7个梯度;每孔100ul;设3-5个复孔.建议设5个;否则难以反应真实情况3: 5%CO2;37℃孵育16-48小时;倒置显微镜下观察..4: 每孔加入20ulMTT溶液5mg/ml;即0.5%MTT;继续培养4h..若药物与MTT能够反应;可先离心后弃去培养液;小心用PBS冲2-3遍后;再加入含MTT的培养液..5: 终止培养;小心吸去孔内培养液..6: 每孔加入150ul二甲基亚砜;置摇床上低速振荡10min;使结晶物充分溶解..在酶联免疫检测仪OD490nm 处测量各孔的吸光值..7: 同时设置调零孔培养基、MTT、二甲基亚砜;对照孔细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜..悬浮细胞:1: 收集对数期细胞;调节细胞悬液浓度1×106/ml;按次序将①补足的1640无血清培养基40ul ;②加Actinomycin D有毒性10ul用培养液稀释储存液100mg/ml;需预试寻找最佳稀释度;1:10-1:20;③需检测物10ul;④细胞悬液50ul即5×104cell/孔;共100ul加入到96孔板边缘孔用无菌水填充..每板设对照加100ml 16402: 置37℃;5%CO2孵育16-48小时;倒置显微镜下观察..3: 每孔加入10 ul MTT溶液5 mg/ml;即0.5%MTT;继续培养4 h..悬浮细胞推荐使用WST-1;培养4 h后可跳过步骤4;直接酶联免疫检测仪OD570nm630nm校准测量各孔的吸光值4、离心1000转x10min;小心吸掉上清;每孔加入100 ul二甲基亚砜;置摇床上低速振荡10 min;使结晶物充分溶解..在酶联免疫检测仪OD570nm630nm校准测量各孔的吸光值..5、同时设置调零孔培养基、MTT、二甲基亚砜;对照孔细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜;每组设定3复孔..注意事项:1 选择适当得细胞接种浓度..2 避免血清干扰:一般选小于10%的胎牛血清的培养液进行试验..在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液..3 设空白对照:与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照..其他试验步骤保持一致;最后比色以空白调零..4 MTT实验吸光度最后要在0-0.7之间;超出这个范围就不是直线关系..5 用96孔板培养细胞做MTT测细胞活力;应该加多少1640培养基;多少MTT和DMSO合适根据书上说的加200ul1640;20ulMTT;150ulDMSO 加DMSO之前要尽量去掉培养液;便于DMSO溶解甲臜颗粒进行比色测定6 一般每孔4000个细胞为宜;既细胞浓度在20000个/ml;MTT加20ul;作用四小时后洗掉上清液;注意不要将甲瓉洗掉;然后每孔加150ul DMSO;在脱色摇床上振荡10分钟;然后测吸光值..转~MTT法原理、步骤以及注意事项MTT原理MTT全称为3-4;5-dimethylthiahiazo -z-y1-3;5-di- phenytetrazoliumromide;汉语化学名为 3-4;5-二甲基噻唑-2-2;5-二苯基四氮唑溴盐;商品名:噻唑蓝..是一种黄颜色的染料..MTT比色法;是一种检测细胞存活和生长的方法..其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒Formazan并沉积在细胞中;而死细胞无此功能..二甲基亚砜DMSO能溶解细胞中的甲瓒;用酶联免疫检测仪在490nm波长处也有用570nm波长的;我目前用的都是570nm测定其光吸收值;可间接反映活细胞数量..在一定细胞数范围内;MTT结晶形成的量与细胞数成正比..该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等..它的特点是灵敏度高、经济..缺点:由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水;需被溶解后才能检测..这不仅使工作量增加;也会对实验结果的准确性产生影响;而且溶解甲的有机溶剂对实验者也有损害..MTT 溶液的配制方法通常;此法中的MTT 浓度为5mg/ml..因此;可以称取MTT 0.5克;溶于100 ml的磷酸缓冲液PBS或无酚红的培养基中;用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌;放4℃ 避光保存即可..在配制和保存的过程中;容器最好用铝箔纸包住..实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光;觉得这样比较好..需要注意的是;MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力;但不能测定细胞绝对数..在用酶标仪检测结果的时候;为了保证实验结果的线性;MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内..MTT一般最好现用现配;过滤后4℃避光保存两周内有效;或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存;避免反复冻融;最好小剂量分装;用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解..我一般都把MTT粉分装在EP管里;用的时候现配;直接往培养板中加;没必要一下子配那么多;尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了..我自己操作一般是每次配制15ml;过滤后4℃避光保存;在两周内用完..MTT有致癌性;用的时候小心;有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的MTT需要无菌;MTT对菌很敏感;往96孔板加时不避光也没有关系;毕竟时间较短;或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉.配制MTT时用PBSph=7.4溶解..PBS配方:Nacl 8g + Kcl 0.2g + Na2HPO41.44g+ KH2PO40.24g调pH 7.4;定容1L..普通MTT法实验步骤:1:接种细胞:用含10%胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液;以每孔1000-10000个细胞接种到96孔板;每孔体积200ul.2: 培养细胞:同一般培养条件;培养3-5天可根据试验目的和要求决定培养时间..3:呈色:培养3-5天后;每孔加MTT溶液5mg/ml用PBS配制;pH=7.420ul.继续孵育4 h;终止培养;小心吸弃孔内培养上清液;对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液..每孔加150ul DMSO;脱色摇床振荡10min;使结晶物充分融解..4:比色:选择490nm570nm波长;在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值;记录结果;以时间为横坐标;吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线..药物MTT法实验步骤贴壁细胞:我的主要操作是贴壁细胞1: 收集对数期细胞;调整细胞悬液浓度;每孔加入100ul;铺板使待测细胞调密度 1000-10000 孔;边缘孔用无菌PBS填充..2: 5%CO;37℃孵育;至细胞贴壁;加入浓度梯度的药物;原则上;细胞贴壁后即可2加药;或两小时;或半天时间;但我们常在前一天下午铺板;次日上午加药.一般5-7个梯度;每孔100ul;设3-5个复孔.建议设5个;否则难以反应真实情况.. 3: 5%CO2;37℃孵育24-72小时;倒置显微镜下观察..4: 每孔加入20ulMTT溶液5mg/ml;即0.5%MTT;继续培养4h..若药物与MTT能够反应;可先离心后弃去培养液;小心用PBS冲2-3遍后;再加入含MTT的培养液..5: 终止培养;小心吸去孔内培养液..6: 每孔加入150ul二甲基亚砜;置摇床上低速振荡10min;使结晶物充分溶解..在酶联免疫检测仪OD490nm570nm处测量各孔的吸光值..7: 同时设置调零孔即空白组培养基、MTT、二甲基亚砜;对照孔细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜..悬浮细胞:1: 收集对数期细胞;调节细胞悬液浓度1×106/ml;按次序将①补足的1640无血清培养基40ul ;②加Actinomycin D有毒性10ul用培养液稀释储存液100mg/ml;需预试寻找最佳稀释度;1:10-1:20;③需检测物10ul;④细胞悬液50ul即5×104cell/孔;共100ul加入到96孔板边缘孔用无菌水填充..每板设对照加100ml 1640..2: 置37℃;5%CO2孵育16-48小时;倒置显微镜下观察..3: 每孔加入10 ul MTT溶液5 mg/ml;即0.5%MTT;继续培养4 h..悬浮细胞推荐使用WST-1;培养4 h后可跳过步骤4;直接酶联免疫检测仪OD570nm630nm校准测量各孔的吸光值4、离心1000转x10min;小心吸掉上清;每孔加入100 ul二甲基亚砜;置摇床上低速振荡10 min;使结晶物充分溶解..在酶联免疫检测仪OD570nm630nm校准测量各孔的吸光值..5、同时设置调零孔培养基、MTT、二甲基亚砜;对照孔细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜;每组设定3复孔..注意事项:1选择适当得细胞接种浓度..每孔1000-10000个;但是也要看细胞种类和状态..我做的是药物抑制肿瘤细胞生长和增殖;铺过2000至8000个每孔..2000太低;8000过高;对于阴性组高于5000个吸光值就很大;大于1.5..所以对于我自己的A549实验一般选用3000-5000..一般每孔4000个细胞为宜2 避免血清干扰:一般选小于10%的胎牛血清的培养液进行试验..在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液..3 设空白对照:与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照..其他试验步骤保持一致;最后比色以空白调零..4 MTT实验吸光度最后要在0-0.7之间;超出这个范围就不是直线关系..阴性组在0.8-1.2;加药组在0-0.7.5 用96孔板培养细胞做MTT测细胞活力;应该加多少1640培养基;多少MTT和DMSO合适根据书上说的加200ul1640;20ulMTT;150ulDMSO..加DMSO之前要尽量去掉培养液;便于DMSO溶解甲臜颗粒进行比色测定6 MTT加20ul;作用四小时后洗掉上清液;注意不要将甲瓉洗掉;然后每孔加150ul DMSO;在脱色摇床上振荡10分钟;然后测吸光值..7 铺板时要保证每孔铺的细胞数目均匀一致;一般每加几孔就混匀一下..我一般是加完一排复孔就混匀一次。
MTT实验原理、步骤、注意事项
MTT实验原理;步骤;注意事项;一、原理MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide,汉语化学名为3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐,商品名:噻唑蓝。
是一种黄颜色的染料。
MTT比色法,是一种检测细胞存活和生长的方法。
其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。
二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒,用酶联免疫检测仪在490nm 波长处测定其光吸收值,可间接反映活细胞数量。
在一定细胞数范围内,MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。
它的特点是灵敏度高、经济。
缺点:由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水,需被溶解后才能检测。
这不仅使工作量增加,也会对实验结果的准确性产生影响,而且溶解甲的有机溶剂对实验者也有损害。
MTT 溶液的配制方法:通常,此法中的MTT 浓度为5mg/ml。
因此,可以称取MTT 0.5克,溶于100 ml的磷酸缓冲液(PBS)或无酚红的培养基中,用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌,放4℃避光保存即可。
在配制和保存的过程中,容器最好用铝箔纸包住。
实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光,觉得这样比较好。
需要注意的是,MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力,但不能测定细胞绝对数。
在用酶标仪检测结果的时候,为了保证实验结果的线性,MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。
MTT一般最好现用现配,过滤后4ºC避光保存两周内有效,或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存,避免反复冻融,最好小剂量分装,用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。
我一般都把MTT粉分装在EP管里,用的时候现配,直接往培养板中加,没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。
MTT原理、步骤、结果分析方法及注意事项
MTT原理、步骤、结果分析方法及注意事项MTT分析法以活细胞代谢物还原剂3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide, MTT噻唑蓝为基础。
MTT为黄色化合物,是一种接受氢离子的染料,可作用于活细胞线粒体中的呼吸链,在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂,生成蓝色的formazan结晶,formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比(死细胞中琥珀酸脱氢酶消失,不能将MTT还原)。
还原生成的formazan结晶可在含50%的N,N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸钠(pH 4.7)的MTT溶解液中溶解,利用酶标仪测定490 nm处的光密度OD值,以反映出活细胞数目。
也可以用DMSO来溶解。
MTT粉末和溶液保存时都需要避光,用铝箔纸包好就可以。
实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光,觉得这样比较好。
MTT步骤如下:1:接种细胞:用含10%胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液,以每孔1000-10000个细胞接种到96孔板,每孔体积200ul.2:培养细胞:同一般培养条件,培养3-5天(可根据试验目的和要求决定培养时间)。
3:呈色:培养3-5天后,每孔加MTT溶液(5mg/ml用PBS <ph=7.4>配)20ul.继续孵育4小时,终止培养,小心吸弃孔内培养上清液,对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。
每孔加150ul DMSO,振荡10分钟,使结晶物充分融解。
4:比色:选择490nm波长,在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值,记录结果,以时间为横坐标,吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。
注意事项:(1)选择适当得细胞接种浓度。
(2)避免血清干扰:一般选小于10%的胎牛血清的培养液进行试验。
在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液。
(3)设空白对照:与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。
mtt实验方法
mtt实验方法MTT实验方法引言MTT实验方法是一种常用的细胞代谢活性测定方法,通过测定细胞的还原型三甲基四氮唑盐(MTT)的代谢能力来评估细胞的活力和增殖能力。
本文将介绍MTT实验方法的原理、步骤和注意事项。
一、原理MTT(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)是一种黄色化合物,能够被细胞内的还原酶还原为紫色的可溶性晶体。
MTT实验利用细胞的代谢活性将MTT还原为紫色产物,通过测量产物的光密度来评估细胞的活力和增殖能力。
二、步骤1. 培养细胞将待测细胞种植在适当的培养基中,并在37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中培养至细胞密度达到要求。
2. 处理样本根据实验需要,给予细胞不同的处理,如药物处理、基因沉默、过表达等。
3. 添加MTT试剂将培养基中的MTT试剂按照一定比例(一般为0.5mg/mL)加入到培养皿中,使细胞与MTT试剂充分接触。
4. 孵育细胞将培养皿放回培养箱中,孵育一定时间(一般为2-4小时),使细胞内的还原酶将MTT还原为可溶性晶体。
5. 溶解晶体将培养皿中的培养基倒掉,加入适量的溶解剂(如DMSO)将晶体溶解,形成紫色液体。
6. 测量光密度将溶解后的液体转移到96孔板中,使用酶标仪或分光光度计测量其光密度(一般在570nm波长下),光密度值越高,代表细胞活力越高。
三、注意事项1. MTT试剂需避光保存,使用前需保持干燥。
2. 实验过程中需严格遵守无菌操作,避免细胞污染。
3. 孵育时间需根据实验需要进行调整,过短的时间可能导致MTT 还原不完全,过长的时间可能导致背景干扰增加。
4. 为减少实验误差,建议设置空白对照组和阴性对照组。
5. 在测量光密度前,需确保晶体完全溶解,否则会出现误差。
结论MTT实验方法是一种简便、可靠的细胞代谢活性测定方法。
通过测量细胞对MTT试剂的还原能力,可以评估细胞的活力和增殖能力。
MTT原理步骤结果分析方法及注意事项
MTT原理步骤结果分析方法及注意事项MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴化物)是一种常用的细胞增殖和存活试剂,用于评价细胞对药物、毒物和其他因素的影响。
MTT法通过检测细胞色素C还原酶的活性来间接测定细胞数量或细胞增殖情况。
下面将详细介绍MTT法的原理、步骤、结果分析方法及注意事项。
1.MTT法的原理:MTT法的基本原理是细胞内的色素C还原酶(mitochondrial dehydrogenase)能够将易溶性的MTT(黄色体层)还原成形成紫色的难溶性甲基紫晶体(formazan)。
甲基紫晶体会沉积在细胞内部,形成紫色的染色体层。
细胞数量或细胞增殖情况与形成的紫色染色体层的光密度成正比。
2.MTT法的步骤:步骤一:细胞培养:将待测的细胞分装到孔板中,根据实验需要,每口孔中大约加入1-2×104个细胞。
步骤二:细胞处理:给予相应的药物处理,并培养合适的时间。
步骤三:MTT染色:在每口孔中加入MTT溶液,使其浓度为0.5mg/ml,离心培养盘,孔中细胞会吸收MTT溶液。
步骤四:MTT溶解:将上一步中吸收MTT溶液的细胞加入DMSO中,溶解甲基紫晶体,使之溶于溶剂中。
步骤五:测量吸光度:将溶解后的MTT溶液转移到96孔板中,使用酶标仪测量在570nm波长下所吸光度来反映细胞存活情况,光密度越高,细胞数量越多或细胞增殖情况越好。
3.MTT法的结果分析方法:三个相邻的实验孔之间的平均值将被视为一个的A值,用于比较不同处理的细胞存活情况。
根据实验设计,可以计算药物对细胞的抑制率、活化率、半抑制浓度(IC50)等参数。
常见的结果分析方法包括:(1)药物对细胞的抑制率计算公式:抑制率(%)=(A值(对照)-A值(药物处理))/A值(对照)×100%(2)药物对细胞的活化率计算公式:活化率(%)=(A值(药物处理)-A值(对照))/A值(对照)×100%(3)IC50计算公式:以药物浓度为自变量,细胞存活率为因变量,绘制药物浓度-细胞存活率曲线,通过拟合直线或曲线来计算药物半抑制浓度,即细胞存活率为50%时的药物浓度。
MTT法原理步骤
细胞的增殖检测(MTT法)MTT法又称MTT比色法,是一种检测细胞存活和生长的方法,该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。
它的特点是灵敏度高、经济,但由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水,需被溶解后才能检测,这不仅使工作量增加,也会对实验结果的准确性产生影响,而且溶解甲瓒的有机溶剂对实验者也有损害。
一、检测原理MTT全称为3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide,汉语化学名为3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(商品名:噻唑蓝),是一种黄颜色的染料。
活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。
二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒,用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值(也有用570nm波长),可间接反映活细胞数量。
在一定细胞数范围内,MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
二、试剂材料准备与实验仪器1、对数生长期细胞2、受试因素(药物)3、5mg.mL-1MTT溶液:称取MTT 0.5克,溶于100 ml的磷酸缓冲液(PBS)或无酚红的培养基中(60℃水浴助溶),用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌,放4℃避光保存即可,在配制和保存的过程中,容器最好用铝箔纸包住。
(PBS配方:NaCl 8g,KCl 0.2g,Na2HPO4 1.44g,KH2PO4 0.24g,调pH 7.4 ,定容1L)4、DMSO(二甲基亚砜)5、96孔板6、酶联免疫检测仪7、细胞培养箱三、MTT法实验步骤(一)普通MTT法实验步骤1、接种细胞:用含10%胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液,以每孔1000-10000个细胞接种到96孔板,每孔体积200ul.2、培养细胞:同一般培养条件,培养3-5天(可根据试验目的和要求决定培养时间)。
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MTT原理
MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide,汉语化学名为 3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐,商品名:噻唑蓝。
是一种黄颜色的染料。
MTT比色法,是一种检测细胞存活和生长的方法。
其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的
蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。
二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒,用酶联免疫检测仪在490nm 波长处测定其光吸收值,可间接反映活细胞数量。
在一定细胞数范围内,MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。
它的特点是灵敏度高、经济。
缺点:由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水,需被溶解后才能检测。
这不仅使工作量增加,也会对实验结果的准确性产生影响,而且溶解甲的有机溶剂对实验者也有损害。
MTT溶液的配制方法
通常,此法中的MTT 浓度为5mg/ml。
因此,可以称取MTT 0.5克,溶于100 ml的磷酸缓冲液(PBS)或无酚红的培养基中,用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌,放4℃避光保存即可。
在配制和保存的过程中,容器最好用铝箔纸包住。
实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光,觉得这样比较好。
需要注意的是,MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力,但
不能测定细胞绝对数。
在用酶标仪检测结果的时候,为了保证实验结果的线性,MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。
MTT一般最好现用现配,过滤后4ºC避光保存两周内有效,或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存,避免反复冻融,最好小剂量分装,用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。
我一般都把MTT粉分装在EP管里,用的时候现配,直接往培养板中加,没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。
MTT有致癌性,用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的MTT需要无菌,MTT对菌很敏感;往96孔板加时不避光也没有关系,毕竟时间较短,或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉.
配制MTT时用PBS(ph=7.4)溶解。
PBS配方:Nacl 8g + Kcl 0.2g + Na2HPO4 1.44g + KH2PO4 0.24g调pH 7.4,定容1L。
普通MTT法实验步骤:
1:接种细胞:用含10%胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液,以每孔1000-10000个细
胞接种到96孔板,每孔体积200ul.
2: 培养细胞:同一般培养条件,培养3-5天(可根据试验目的和要求决定培养时间)。
3:呈色:培养3-5天后,每孔加MTT溶液(5mg/ml用PBS配制,pH=7.4)20ul.继续孵育4 h,
终止培养,小心吸弃孔内培养上清液,对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。
每孔加150ul DMSO,振荡10min,使结晶物充分融解。
4:比色:选择490nm波长,在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值,记录结果,以时间为
横坐标,吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。
药物MTT法实验步骤
贴壁细胞:
1: 收集对数期细胞,调整细胞悬液浓度,每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度 1000-
10000 孔,(边缘孔用无菌PBS填充)。
2: 5%CO2,37℃孵育,至细胞单层铺满孔底(96孔平底板),加入浓度梯度的药物,原则上,
细胞贴壁后即可加药,或两小时,或半天时间,但我们常在前一天下午铺板,次日上午
加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设5个,否则难以反应真实情况
3: 5%CO2,37℃孵育16-48小时,倒置显微镜下观察。
4: 每孔加入20ulMTT溶液(5mg/ml,即0.5%MTT),继续培养4h。
若药物与MTT能够反应,
可先离心后弃去培养液,小心用PBS冲2-3遍后,再加入含MTT 的培养液。
5: 终止培养,小心吸去孔内培养液。
6: 每孔加入150ul二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10min,使结晶物充分溶解。
在酶联免
疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。
7: 同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜),对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介
质、培养液、MTT、二甲基亚砜)。
悬浮细胞:
1: 收集对数期细胞,调节细胞悬液浓度1×106/ml,按次序将①补足的1640(无血清)培
养基40ul ;②加Actinomycin D(有毒性)10ul用培养液稀释 (储存液100μg/ml,需预试寻找最佳稀释度,1:10-1:20);③需检测物10ul;④细胞悬液50ul(即5×104cell/孔),共100ul加入到96孔板(边缘孔用无菌水填充)。
每板设对照(加100μl 1640)2: 置37℃,5%CO2孵育16-48小时,倒置显微镜下观察。
3: 每孔加入10 ul MTT溶液(5 mg/ml,即0.5%MTT),继续培养4 h。
(悬浮细胞推荐使用
WST-1,培养4 h后可跳过步骤4),直接酶联免疫检测仪OD570nm (630nm校准)测量各孔的吸光值)
4、离心(1000转x10min),小心吸掉上清,每孔加入100 ul二甲
基亚砜,置摇床上低速振荡10 min,使结晶物充分溶解。
在酶联免疫检测仪OD570nm(630nm校准)测量各孔的吸光值。
5、同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜),对照孔(细胞、
相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜),每组设定3复孔。
注意事项:
(1)选择适当得细胞接种浓度。
(2) 避免血清干扰:一般选小于10%的胎牛血清的培养液进行试验。
在呈色后尽量吸尽孔
内残余培养液。
(3) 设空白对照:与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。
其他试验步骤保持一致,
最后比色以空白调零。
(4) MTT实验吸光度最后要在0-0.7之间,超出这个范围就不是直线关系。
(5)用96孔板培养细胞做MTT测细胞活力,应该加多少1640培养基,
多少MTT和DMSO合适
根据书上说的加200ul1640,20ulMTT,150ulDMSO 加DMSO之前要尽量去掉培养液,便于
DMSO溶解甲臜颗粒进行比色测定
(6)一般每孔4000个细胞为宜,既细胞浓度在20000个/ml,MTT加
20ul,作用四小时后洗掉上清液,注意不要将甲瓉洗掉,然后每孔加150ul DMSO,在脱色摇床上振荡10分钟,然后测吸光值。