PCR反应体系
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P C R 反 应 体 系
PCR 原理
PCR（Polymerase Chain Reaction）是指在DNA聚合酶催化下， 以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等 步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。
01
PCR buffer
02 Taq酶
03 04 05 dNTPs
反 应 体 系
PCR
镁离子
引物及探针 模板
06
PCR buffer
PCR反应缓冲液的目的是给Taq DNA聚合酶提供一 个最适酶催反应条件。
成分 Tris-HCl KCl NH4+ 小牛血清白蛋白 明胶 Tween 20 二硫苏糖醇（DTT） 浓度 10-50mmol/L ≤50mmol/L 16.6mmol/L 100μg/ml 0.01% 0.05% ～0.1% 5mmol/l 有助于酶的稳定，提高试 剂的稳定性。 作用 平衡ph值 利于引物的退火（产率比 较高） 特异性比较好
高保真Taq酶
有
无
有
无
600base/min
Mg2+和dNTPs
作用 Mg2+ TaqDNA聚合 酶是Mg2+依赖 性酶 浓度 1.5～ 2.0mmol/L 偏高 偏低
非特异性 产物减少 扩增 导致错配 产物减少
dNTPs
DNA合成的原 50～ 200umol/L 料
Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等的 浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。
DNA模板使用量一般为20-200ng。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。 RNA模板注意保证其防止RNA降解。
其他成分
RNasin（RNase Inhibitor）的作用：RNA酶 抑制剂，抑制RNA酶的活性。 UNG酶的作用原理是选择性水解断裂含有dU 的双链或单链DNA中的尿嘧啶糖苷键，形成 的有缺失碱基的DNA链，在碱性介质以及高 温下会进一步水解断裂，从而被消除。UNG 酶的最佳活性温度为50℃，95℃灭活。
引物及探针
引物是人工合成的一段寡核苷酸序列。一般为20 个碱基。 引物的序列与模板结合的特异性是决定PCR反应 结果的关键。 探针是人工合成的在两端分别标记荧光基团的一 段寡核苷酸序列。 探针的特异性及退火温度对反应体系影响很大。
模 板
单、双链DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、 DNA结合蛋白类。
的提高了扩增的准确性内参基因是为了平衡不同模板之
间的差异。加入浓度50μ L体系加入0.1μ L 25μ M ROX， 终浓度为50nM。
Taq酶
Taq酶是从水生栖热菌 Thermus Aquaticus （ Taq ）中分 离出的具有热稳定性的DNA聚合酶。
5'到 3'合成 DNA能力 普通Taq酶 有 5'到 3'外 切酶活性 有 3'到 5'外 切酶活性 无 3'端加A
延伸速度
有
2000base/min
热启动Taq酶
有
有
无
有Байду номын сангаас
2000base/min
其他成分
反转录酶（Reversetranscripatase）是以RNA为模板指
导三磷酸脱氧核苷酸合成互补DNA（cDNA）的酶。 ROX（ROX Reference Dye）一般用于ABI、 Stratagene等公司的Real Time PCR扩增仪上。用于消 除信号本底以及效正孔之间产生的荧光信号，最大限度
PCR 原理
PCR（Polymerase Chain Reaction）是指在DNA聚合酶催化下， 以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等 步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。
01
PCR buffer
02 Taq酶
03 04 05 dNTPs
反 应 体 系
PCR
镁离子
引物及探针 模板
06
PCR buffer
PCR反应缓冲液的目的是给Taq DNA聚合酶提供一 个最适酶催反应条件。
成分 Tris-HCl KCl NH4+ 小牛血清白蛋白 明胶 Tween 20 二硫苏糖醇（DTT） 浓度 10-50mmol/L ≤50mmol/L 16.6mmol/L 100μg/ml 0.01% 0.05% ～0.1% 5mmol/l 有助于酶的稳定，提高试 剂的稳定性。 作用 平衡ph值 利于引物的退火（产率比 较高） 特异性比较好
高保真Taq酶
有
无
有
无
600base/min
Mg2+和dNTPs
作用 Mg2+ TaqDNA聚合 酶是Mg2+依赖 性酶 浓度 1.5～ 2.0mmol/L 偏高 偏低
非特异性 产物减少 扩增 导致错配 产物减少
dNTPs
DNA合成的原 50～ 200umol/L 料
Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等的 浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。
DNA模板使用量一般为20-200ng。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。 RNA模板注意保证其防止RNA降解。
其他成分
RNasin（RNase Inhibitor）的作用：RNA酶 抑制剂，抑制RNA酶的活性。 UNG酶的作用原理是选择性水解断裂含有dU 的双链或单链DNA中的尿嘧啶糖苷键，形成 的有缺失碱基的DNA链，在碱性介质以及高 温下会进一步水解断裂，从而被消除。UNG 酶的最佳活性温度为50℃，95℃灭活。
引物及探针
引物是人工合成的一段寡核苷酸序列。一般为20 个碱基。 引物的序列与模板结合的特异性是决定PCR反应 结果的关键。 探针是人工合成的在两端分别标记荧光基团的一 段寡核苷酸序列。 探针的特异性及退火温度对反应体系影响很大。
模 板
单、双链DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、 DNA结合蛋白类。
的提高了扩增的准确性内参基因是为了平衡不同模板之
间的差异。加入浓度50μ L体系加入0.1μ L 25μ M ROX， 终浓度为50nM。
Taq酶
Taq酶是从水生栖热菌 Thermus Aquaticus （ Taq ）中分 离出的具有热稳定性的DNA聚合酶。
5'到 3'合成 DNA能力 普通Taq酶 有 5'到 3'外 切酶活性 有 3'到 5'外 切酶活性 无 3'端加A
延伸速度
有
2000base/min
热启动Taq酶
有
有
无
有Байду номын сангаас
2000base/min
其他成分
反转录酶（Reversetranscripatase）是以RNA为模板指
导三磷酸脱氧核苷酸合成互补DNA（cDNA）的酶。 ROX（ROX Reference Dye）一般用于ABI、 Stratagene等公司的Real Time PCR扩增仪上。用于消 除信号本底以及效正孔之间产生的荧光信号，最大限度