(完整版)PCR反应体系组分适合浓度范围
PCR的反应体系主要包括哪些
PCR的反应体系主要包括哪些PCR（聚合酶链式反应）是一种在分子生物学和遗传学研究中广泛应用的技术。
它是通过扩增DNA片段的方法，使得微量的DNA能够在体外得到大量复制。
PCR的反应体系主要包括以下几个关键组分：引物、DNA模板、聚合酶、缓冲溶液和dNTP。
引物PCR反应需要两种引物，称为前向引物和反向引物。
它们是用来定位要扩增的DNA 区域的短链RNA或DNA片段。
引物的设计是PCR反应中非常关键的一步，需要根据DNA序列的特点来选择适当的引物。
合理的引物设计可以提高扩增效率和特异性。
DNA模板PCR反应的DNA模板通常是从细胞或组织中提取出来的DNA。
模板可以是基因组DNA、cDNA或已知序列的DNA片段。
PCR通过基本的核酸配对准则，利用引物将所需的DNA片段扩增出来。
聚合酶PCR反应中所使用的聚合酶是一种特殊的酶，称为DNA聚合酶。
常用的DNA聚合酶有Taq聚合酶和Pfu聚合酶等。
聚合酶能够识别DNA模板上的引物结合位点，并在这个基础上合成新的DNA链。
它具有高度稳定的酶活性和较高的耐热性，使得PCR反应可以在高温条件下进行。
缓冲溶液缓冲溶液是PCR反应中的重要组分之一，它提供了适当的pH值和离子平衡条件，使反应能够在适宜的环境中进行。
缓冲溶液通常含有Tris-HCl、KCl等成分，以维持反应的稳定性和效率。
dNTPPCR反应需要四种脱氧核苷酸三磷酸盐（dNTPs）作为合成新DNA链的原料。
这四种成分分别是脱氧腺嘌呤核苷酸（dATP）、脱氧鸟嘌呤核苷酸（dGTP）、脱氧胸腺嘧啶核苷酸（dTTP）和脱氧胞嘧啶核苷酸（dCTP）。
它们提供了构建新DNA链所需要的碱基。
反应条件PCR反应还需要适当的温度条件下进行。
常见的PCR反应温度是95°C的高温变性步骤、50-60°C的引物结合步骤和72°C的DNA链合成步骤。
这些温度可以使PCR反应能够在合理的时间内完成扩增。
PCR反应程序设置哪些参数最重要
PCR反应程序设置哪些参数最重要PCR（聚合酶链反应）是一种常用的分子生物学技术，用于扩增DNA序列，从而在实验室中大量产生特定的DNA片段。
PCR反应的成功与否，关键在于合理设置PCR反应的各项参数。
本文将讨论PCR反应中最重要的参数设置。
引物设计PCR反应的第一个重要参数是引物设计。
引物是PCR反应中的两个短DNA片段，能够识别并结合到待扩增的目标DNA序列的两端。
引物的序列需要与目标序列高度特异性匹配，避免与其他非目标DNA序列发生非特异性扩增。
合理选择引物还需要考虑引物的长度、GC含量和互补性。
通常来说，引物长度应在18到25个核苷酸之间，GC含量应在40%至60%之间。
此外，引物的互补性也要避免引物之间形成二聚体或异聚体，影响PCR反应的效率和特异性。
温度参数温度是PCR反应中的另一个重要参数，包括Denaturation（变性）、Annealing（退火）和Extension（延伸）三个阶段的温度。
Denaturation阶段通常需要高温（通常为94℃至98℃）来使DNA双链解开成两条单链。
Annealing阶段需要将温度降低到与引物匹配的特定温度，使引物与目标DNA序列结合并引发扩增。
通常，合适的退火温度应在引物的Tm值（熔解温度）附近。
Tm值是指DNA的两个单链在一定条件下解开的温度。
Tm值的计算可以用公式Tm= 4 × (G + C) + 2 × (A + T)，其中A、T、G和C分别表示核苷酸A、T、G和C的数量。
Extension阶段需要较低的温度（通常为68℃至72℃），使DNA聚合酶结合在引物的3’端，并合成新的DNA链。
反应时间反应时间是PCR反应中确定的一个重要参数。
反应时间需要考虑参与PCR扩增的DNA模板的长度以及目标DNA的扩增比例。
通常情况下，PCR反应时间不宜过长也不宜过短。
如果反应时间过长，可能会导致非特异性扩增的发生，产生多个不需要的DNA片段。
pcr反应体系的组成及各组分作用
pcr反应体系的组成及各组分作用
PCR，即链式酶聚合反应，反应管中各组分如下：
1.扩增缓冲液：
缓冲液有助于酶的稳定，是给聚合酶提供一个最适合酶催化反应条件；
2.4种dNTP混合物：
四种脱氧核苷酸，是DNA的原料；
3.引物：
DNA合成不能从零开始，必须要有引物，从引物末端开始延伸，合成整条链；
4.模板：
DNA合成需要模板链；
5.Taq DNA聚合酶：
催化PCR反应，该酶是从Thermus aquaticus细菌中提取的特殊的耐热DNA聚合酶，可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本；
6.Mg2+：
Mg与dNTP以及DNA模板结合形成复合体，只有这种复
合体才能被DNA聚合酶识别；
7.加双或三蒸水：
调节反应体系的浓度用；。
pcr扩增实验步骤
pcr扩增实验步骤PCR（聚合酶链式反应）是一种广泛应用于分子生物学领域的实验技术，可用于扩增DNA片段。
以下是PCR扩增实验的一般步骤：1.收集样本：从所需的生物体中收集样本，例如细胞、组织或血液。
确保样本质量良好，避免污染。
2.DNA提取：使用适当的DNA提取方法从样本中提取DNA。
常见的提取方法包括酚-氯仿法、石蜡片法、辣根酸法等。
3. DNA定量：使用分光光度计或荧光检测仪测量提取的DNA的浓度。
确保DNA浓度适当，通常为50-100 ng/μl。
4.准备PCR反应体系：根据反应所需组分的浓度，将反应体系中的各种试剂和DNA片段以适当比例混合。
一般的PCR反应体系包括DNA模板、引物、dNTPs、聚合酶、缓冲液和水。
5.DNA扩增条件的优化：根据所用DNA片段和引物的长度，调整PCR反应条件，如变性温度（94-98°C）、退火温度（50-68°C）和延伸时间（1-2分钟）。
6.PCR循环：设置PCR仪的循环程序，其中包括变性、退火和延伸的循环。
通常进行25-35个循环。
7.PCR产物分析：使用琼脂糖凝胶电泳或其他适当的方法检测PCR产物。
通过将扩增反应混合物加入琼脂糖凝胶槽中，并在电泳室中施加电场进行游离电泳。
然后，使用紫外线照射仪观察琼脂糖凝胶上的DNA条带。
8. PCR产物与DNA序列分析：将PCR产物纯化并进行测序。
纯化可以使用商业PCR产物纯化试剂盒进行。
测序可以使用Sanger测序或其他高通量测序技术进行。
9.数据分析：通过比较PCR产物与目标序列的DNA序列，确定扩增是否成功。
如果目标序列与PCR产物一致，则证明PCR扩增成功。
10.数据表达与报告：将实验结果整理为数据表和图形，并合理解释实验结果。
最后，撰写实验报告，包括实验目的、方法、结果和结论等。
总结：PCR扩增是一种常用的分子生物学技术，可用于快速、高效地扩增DNA片段。
通过遵循上述步骤，实验人员可以成功进行PCR扩增实验，并用于研究DNA序列、基因表达等各种生物学研究。
PCR反应条件体系总结
PCR反应条件体系总结PCR技术概论聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。
它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。
过去几天几星期才能做到的事情，用PCR几小时便可完成。
PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。
PCR技术简史PCR的最早设想核酸研究已有100多年的历史，本世纪60年代末、70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术，Korana于197 1年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。
PCR的实现 1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mull is等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。
其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供以致一种合适的条件---摸板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA 变性、复性及延伸的温度与时间。
PCR的改进与完善Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段，其缺点是：①Klenow酶不耐高温，90℃会变性失活，每次循环都要重新加。
②引物链延伸反应在37℃下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，其PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。
此种以Klenow酶催化的PCR技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点，但由于Klenow酶不耐热，在D NA模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了不少困难。
这使得PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视。
pcr设计方案
PCR设计方案引言PCR（聚合酶链反应）是一种广泛应用于分子生物学研究和临床诊断的技术。
它能在体外复制DNA序列，并通过放大检测目标DNA的数量。
本文档旨在提供一种PCR设计方案，确保PCR实验的准确性和可靠性。
实验设计此PCR设计方案包括以下步骤：1.靶标选择：选择适合的DNA序列作为PCR反应的靶标。
确保靶标在目标样品中存在且具有生物学意义。
2.引物设计：设计合适的引物，以扩增目标DNA序列。
引物应满足以下要求：–引物长度：一般为18-30个碱基对。
–Tm值：引物的Tm值应接近或略高于PCR反应的最佳温度。
–引物间相互作用：引物对之间不应有明显的互相杂交，以避免产生非特异性扩增产物。
3.杂交温度优化：根据引物的Tm值确定PCR反应的最佳杂交温度。
通常，杂交温度设置为引物Tm值的5°C-10°C。
4.建立PCR反应体系：准备PCR反应体系，包括以下组分：–DNA模板：目标DNA的少量纯化物或DNA提取物。
–引物：前述设计的引物。
–DNA聚合酶：选择具有高稳定性和高扩增效率的DNA聚合酶。
–反应缓冲液：含有适当浓度的Mg^2+离子和其他辅助成分的缓冲液。
–dNTPs：四种单核苷酸。
–模板DNA稀释缓冲液：用于稀释目标DNA的高浓度溶液。
5.PCR扩增条件优化：对PCR扩增条件进行优化，包括：–初始变性步骤：将PCR反应体系加热至94°C-95°C，以解开DNA的双链结构。
–变性步骤：保持高温（94°C-95°C）以保持DNA变性状态。
–环式扩增步骤：设置合适的温度和时间，以使引物与目标DNA杂交并DNA 聚合酶在此温度下进行链延伸。
–末端延伸步骤：进行降温，以使DNA聚合酶完成末端延伸。
6.实验验证：进行PCR扩增并验证扩增产物的特异性。
可通过以下方法进行验证：–凝胶电泳：将PCR反应产物与DNA标准品一同进行凝胶电泳，以确定产物的大小和纯度。
PCR原理和反应体系
PCR原理和反应体系1. 引言核酸聚合酶链式反应（PCR）是一种广泛应用于分子生物学领域的技术。
PCR能够高效地扩增目标DNA序列，以便进行后续的分析和研究。
本文将介绍PCR的原理和反应体系。
2. PCR原理PCR方法是通过反复进行一系列的温度循环来实现DNA的扩增。
它基于DNA聚合酶的酶活性，使得DNA模板序列在体外得以复制，从而得到大量的目标DNA序列。
PCR的循环包括三个基本步骤：变性、退火和延伸。
2.1 变性在PCR的第一个循环中，反应体系被加热至接近100℃，使得DNA双链分离成两条单链。
这一步被称为变性。
变性步骤使得每条DNA链上的碱基相互解离，从而使DNA 模板能够提供单链的模板序列。
2.2 退火在PCR的第二个循环中，反应体系被冷却至合适的温度范围，使引物（primers）能够与模板DNA序列的特定区域发生互补配对。
引物是一段DNA序列，通过核酸序列互补性与目标序列的两端结合。
它定义了扩增的起点和终点。
2.3 延伸在PCR的第三个循环中，反应体系被加热至适宜的温度，使得DNA聚合酶能够沿着模板DNA链延伸引物，合成新的DNA链。
这一步骤使目标DNA序列得以扩增。
PCR的三个步骤会不断重复，以产生大量的目标DNA序列。
3. PCR反应体系PCR反应体系由数个组分构成，每个组分在反应中起着特定的作用。
3.1 DNA模板DNA模板是PCR反应中的起始材料。
它可以是从已知DNA源物提取的基因组DNA，也可以是通过限制性酶切等方法从其他DNA片段中获得的特定序列。
3.2 引物（primers）引物是PCR反应中的两个关键组分，用于定义扩增的起点和终点。
引物的设计应考虑到目标序列的特异性和互补性。
3.3 DNA聚合酶DNA聚合酶是PCR反应体系中的核心酶，它能够读取模板DNA，并配对引物序列，合成新的DNA链。
3.4 反应缓冲液反应缓冲液提供了适宜的pH和离子浓度条件，以维持聚合酶的活性和稳定性。
PCR反应体系中模板DNA推荐使用量
PCR反应体系中模板DNA推荐使用量PCR（Polymerase Chain Reaction）技术是一种用于体外扩增DNA片段的方法，包括三个关键步骤：变性、退火和扩增，其中模板DNA是至关重要的一个组分。
合理的模板DNA用量可以保证PCR反应的高效进行，并得到满意的扩增产物。
在实验设计时，我们通常需要根据所需扩增片段的大小、目标浓度和反应体系进行合理计算和定量。
本文将对PCR反应体系中模板DNA推荐使用量进行讨论和简要介绍。
在PCR反应中，模板DNA是PCR扩增的起始物质，它可以是基因组DNA、载体DNA和PCR扩增产物等。
模板DNA的初始浓度和使用量对PCR反应结果具有重要影响。
模板DNA的初始浓度通常以ng/μL或pg/μL为单位。
通常情况下，较高的模板DNA浓度可以提高PCR反应的效率和产物浓度。
然而，过高的模板DNA浓度可能会引起PCR反应异常或不可预测的结果。
模板DNA的浓度应根据所需扩增片段的大小和目标浓度进行合理调整。
一般情况下，对于小片段的扩增（100-500 bp），初始浓度为10-100 ng/μL；对于大片段的扩增（>1 kb），初始浓度为1-10 ng/μL比较适宜。
需要注意的是，在扩增反应中，模板DNA的浓度会逐渐降低，因为一部分DNA会被扩增为产物。
因此，在同一批次PCR反应中，可以适当提高模板DNA的浓度以确保产物的充分生成。
模板DNA的使用量应根据PCR反应体系的总体积合理确定。
PCR反应体系通常包括模板DNA、引物、酶、缓冲液和dNTPs等组分。
其中，模板DNA应占用反应体系的一个较小比例，以避免核酸的过剩。
为了简化计算，我们一般按照1%的体积比例来添加模板DNA，即PCR反应体系总体积的1%左右。
例如，对于50μL反应体系，可以添加0.5μL-5μL的模板DNA。
当PCR反应体系中的成分发生变化时，模板DNA的使用量也需要相应调整。
例如，如果引物浓度较高或目标片段较短，可以适当降低模板DNA 的使用量。
pcr反应体系包括哪些条件
PCR反应体系包括哪些条件引言PCR（聚合酶链式反应）是一种重要的分子生物学技术，常用于扩增和复制DNA片段。
PCR反应的成功与否与许多条件相关，包括反应体系的组成、温度、时间等因素。
本文将探讨PCR反应体系中需要考虑的关键条件。
PCR反应体系的组成PCR反应体系通常由以下组分组成：1.DNA模板：PCR反应的目的是扩增特定的DNA片段，因此必须提供含有目标DNA序列的DNA模板。
DNA模板可以是基因组DNA、cDNA等。
2.引物（primers）：引物是PCR反应中的两个短小DNA片段，通过与目标DNA序列的两端互补结合，提供扩增的起始点。
引物的设计应考虑目标DNA序列的特异性和长度合适性，以避免非特异性扩增或引物间的二聚体形成。
3.dNTPs（脱氧核苷酸三磷酸盐）：dNTPs是PCR反应中的四种单个核苷酸单元，包括dATP、dCTP、dGTP和dTTP。
它们是DNA聚合酶合成新DNA链所需的原料。
4.缓冲液：PCR反应需要在适当的条件下进行。
缓冲液可调节反应体系的pH值，维持适宜的离子浓度和稳定酶活性。
5.Mg2+离子：Mg2+离子是PCR反应中DNA聚合酶的辅因子之一，它们对酶的活性和特异性都起到重要作用。
反应体系中的Mg2+浓度应根据DNA聚合酶的要求进行优化。
6.DNA聚合酶：PCR反应需要一种高度稳定和高效的DNA聚合酶。
常用的DNA聚合酶有Taq聚合酶、Pfu聚合酶等。
PCR反应体系的关键条件1.反应体系的最终体积：PCR反应体系的最终体积通常在20至100微升之间。
体系体积的选择应基于反应所需的DNA模板量和反应物的浓度。
2.温度：PCR反应需要周期性地在不同温度下进行。
其中，最重要的包括：•脱氧步（denaturation）：在这一步骤中，PCR反应将DNA的双链解开，使其变为单链。
通常在94-98°C的高温下进行。
•连接步（annealing）：在这一步骤中，引物与目标DNA序列的两端互补结合。
qpcrcdna浓度范围 -回复
qpcrcdna浓度范围-回复关于qpcr（定量聚合酶链反应）的浓度范围，这项实验技术在生物医学研究中被广泛应用。
qpcr是一种高灵敏、高选择性的实验方法，用于定量测量目的基因在样本中的丰度。
在进行qpcr实验之前，首先要确定合适的浓度范围，以确保结果的准确性和可靠性。
qpcr实验需要考虑的关键因素之一是DNA或RNA模板的初始浓度。
初始浓度的选择取决于目的基因在样本中的相对丰度以及实验目的。
一般而言，推荐使用初始浓度在10^1到10^7拷贝/μL之间的模板。
这个范围可以满足大多数实验的要求，并提供了足够的信号强度和动态范围。
首先，为了确定合适的初始浓度范围，可以进行预实验。
在预实验中，可以测试一系列不同浓度的样品，以获得相关基因的荧光信号和相对应的Ct 值（荧光信号阈值周期）。
Ct值表示达到荧光信号阈值所需的PCR循环数，其值越小，模板初始浓度越高。
根据这些数据，可以确定最佳初始浓度范围，以确保在实际实验中获得可靠的结果。
一般而言，初始浓度范围应该涵盖相对丰度更高或更低的样本。
如果目的基因在样本中的丰度较低，初始浓度可以选择在10^1到10^4拷贝/μL 之间。
如果目的基因在样本中的丰度较高，初始浓度可以选择在10^4到10^7拷贝/μL之间。
这样可以确保实验中的信号在合适的范围内，避免信号饱和或过低而导致的测量误差。
另一个需要考虑的因素是引物和探针的最佳浓度范围。
引物和探针是用于放大和检测目的基因的关键分子工具。
通常情况下，引物和探针的最佳浓度应该在200到900nM之间。
在确定最佳浓度范围时，可以进行一系列实验，分别使用不同浓度的引物和探针，观察实验结果的效果和信号强度，并根据这些数据确定最佳的引物和探针浓度。
此外，还应该考虑到试剂的扩增效率。
扩增效率是指PCR反应中每一轮扩增的倍增系数，其越接近100，表示扩增效率越高。
一般而言，合适的扩增效率应该在90到110之间。
如果扩增效率过低，可能会导致结果的不准确或不可靠。
PCR反应的主要成份全面阐述
PCR反应的紧要成份全面叙述PCR反应中的紧要成份引物、4种三磷酸脱氧核苷酸（dNTP）、Mg2+、模板、Taq DNA聚合酶、反应缓冲液五部分构成。
各个组份都能影响 PCR 结果的好坏，下面认真分析：1. 引物PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决议。
引物的好坏往往是PCR成败的关键。
引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵奉并服从下列原则：（1）引物长度约为16—30 bp，太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增高。
太长则比较挥霍，且难以合成。
（2）引物中G+C含量通常为40%—60%，可按下式大略估量引物的解链温度 Tm＝4（G+C）+2（A+T）。
（3）四种碱基应随机分布，在3端不存在连续3个G或C，因这样易导致错误引发。
（4）引物3端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应，以减少由于密码子摇摆产生的不配对。
（5）在引物内，尤其在3端应不存在二级结构。
（6）两引物之间尤其在3端不能互补，以防显现引物二聚体，减少产量。
两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补性。
（7）引物5端对扩增特异性影响不大，可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素等。
通常应在5端限制酶位点外再加1—2个保护碱基。
（8）引物不与模板结合位点以外的序列互补。
所扩增产物自身无稳定的二级结构，以免产生非特异性扩增，影响产量。
（9）简并引物应选用简并程度低的密码子，例如选用只有一种密码子的Met， 3端应不存在简并性。
否则可能由于产量低而看不见扩增产物。
（10）一般PCR反应中的引物终浓度为0.2—1.0 μmol/L。
引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体，过低则降低产量。
利用紫外分光光度计，可精准明确计算引物浓度，在1cm光程比色杯中，260nm下，引物浓度可按下式计算：X mol/L＝ OD260/ A（16000）+C（70000）+G（12000）+T （9600）X：引物摩尔浓度，A、C、G、T：引物中4种不同碱基个数。
PCR反应体系
PCR反应体系PCR反应体系与反应条件标准的PCR反应体系：10×扩增缓冲液 10ul4种dNTP混合物各200umol/L 800ul引物各10～100pmol模板DNA 0.1～2ugTaq DNA聚合酶 2.5uMg2+ 1.5mmol/L加双或三蒸水至 100ulPCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。
理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
设计引物应遵循以下原则：①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。
②引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。
③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。
ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
⑤引物3’端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。
引物量：每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
酶及其浓度目前有两种Taq DNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。
催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。
PCR反应
PCR反应体系与反应条件标准的PCR反应体系：10×扩增缓冲液 10ul4种dNTP混合物各200umol/L 800ul引物各10～100pmol模板DNA 0.1～2ugTaq DNA聚合酶 2.5uMg2+ 1.5mmol/L加双或三蒸水至 100ulPCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。
理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
设计引物应遵循以下原则：①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。
②引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。
③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。
ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
⑤引物3’端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。
引物量：每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
酶及其浓度目前有两种Taq DNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。
催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。
pcr金标准
pcr金标准PCR技术是现代生物学和医学研究中最为重要的技术之一。
PCR技术以其高灵敏度、高特异性和高可靠性，已经广泛应用于基因诊断、基因治疗、药物筛选、疾病预后预测等领域。
然而，PCR技术本身的灵敏度、特异性和可靠性却受到了许多因素的影响，如PCR反应条件、试剂质量、样品质量等。
因此，各级标准化机构都出台了相应的PCR金标准，以确保PCR技术的精度、稳定性和可靠性。
以下是PCR金标准的简要介绍。
1.PCR反应条件标准PCR反应条件是影响PCR反应结果的最重要因素之一。
为保证PCR反应条件的准确性和可重复性，PCR金标准规定了PCR反应中的各项参数和标准值。
（1）反应体系：PCR金标准要求PCR反应体系必须包含适当浓度的DNA模板、引物、酶、缓冲液等，其中一些试剂的浓度及质量如下：（a）DNA模板：模板DNA的浓度应该在20-200ng/μl范围内，以避免模板DNA过多或过少导致PCR特异性降低或PCR反应阻碍。
（b）引物：引物的浓度应该在50-200nM之间，过低的引物浓度可能导致PCR反应失败。
（c）酶：PCR反应酶的浓度应该在1单位/50ul-3单位/50ul之间。
过低酶浓度会导致PCR反应时间过长，过高的酶浓度会导致PCR扩增产物异常。
（d）缓冲液：标准PCR缓冲液最常用的成分是Tris-HCl、MgCl2和KCl。
（2）PCR反应温度：PCR金标准规定PCR反应需要分为三个步骤：变性、退火和延伸。
PCR反应温度在不同步骤中的要求如下：（a）变性：反应器应该在95℃左右持续2-5分钟的变性机制使DNA的氢键被打碎，单链DNA得到解离，形成单链模板。
（b）退火：在这个步骤中，引物结合单链模板发生。
引物需要退火至低温，以增强引物与目标序列间的相互作用：退火温度通常在52-60℃之间。
（c）延伸：PCR反应在72℃左右的延伸过程中，DNA聚合酶从引物双端开始在单链模板上合成新的DNA链。
延伸过程的温度通常在68-74℃。
PCR参数
〔PCR的循环参数〕1、预变性（Initial denaturation）．模板DNA完全变性对PCR能否成功至关重要，一般95℃加热3-5分钟。
2、引物退火（Primer annealing）退火温度一般需要凭实验（经验）决定。
退火温度对PCR的特异性有较大影响。
Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T)复性温度=Tm值-(5～10℃)在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。
复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。
3、引物延伸引物延伸一般在72℃进行（Taq酶最适温度）。
延伸时间随扩增片段长短而定。
PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。
PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。
3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。
延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。
对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。
4、循环中的变性步骤循环中一般95℃，30秒足以使各种靶DNA序列完全变性：变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败。
每完成一个循环需2～4分钟5、循环数大多数PCR含25-35循环，过多易产生非特异扩增。
6、最后延伸在最后一个循环后，反应在72℃维持5-15分钟．使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链。
PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。
PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。
3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。
延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。
对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。
PCR反应五要素
PCR反应的五要素1、引物引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。
理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
设计引物应遵循以下原则：①引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。
②引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。
③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。
ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
⑤引物3’端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。
引物量：每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
2、酶目前有两种Taq DNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。
催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul 时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。
3、dNTPdNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。
dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris。
HCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，小量分装，-20℃冰冻保存。
多次冻融会使dNTP 降解。
在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。