PCR反应体系
标准的PCR反应体系
标准的PCR反应体系PCR的反应体积一般有：10、20、25、40、50、100μl（一般不要低于10μl，体积过少会影响扩增效率及产物得率）PCR反应体系与反应条件--------------------------------------------------------------------------------标准的PCR反应体系：10×扩增缓冲液10ul4种dNTP混合物各200umolL引物各10～100mol模板DNA 01～2ugTqDNA聚合酶25ug2+ 15mmolL加双或三蒸水至100ulPCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和g2+引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。
理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
设计引物应遵循以下原则：①引物长度：15-30b，常用为20b左右。
②引物扩增跨度：以200-500b为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。
③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。
ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
⑤引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。
引物量：每条引物的浓度01～1umol或10～100mol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
PCR反应体系
反 应 体 系
PCR
镁离子
引物及探针 模板
06
PCR buffer
PCR反应缓冲液的目的是给Taq DNA聚合酶提供一 个最适酶催反应条件。
成分 Tris-HCl KCl NH4+ 小牛血清白蛋白 明胶 Tween 20 二硫苏糖醇（DTT） 浓度 10-50mmol/L ≤50mmol/L 16.6mmol/L 100μg/ml 0.01% 0.05% ～0.1% 5mmol/l 有助于酶的稳定，提高试 剂的稳定性。 作用 平衡ph值 利于引物的退火（产率比 较高） 特异性比较好
的提高了扩增的准确性内参基因是为了平衡不同模板之
间的差异。加入浓度50μ L体系加入0.1μ L 25μ M ROX， 终浓度为versetranscripatase）是以RNA为模板指
导三磷酸脱氧核苷酸合成互补DNA（cDNA）的酶。 ROX（ROX Reference Dye）一般用于ABI、 Stratagene等公司的Real Time PCR扩增仪上。用于消 除信号本底以及效正孔之间产生的荧光信号，最大限度
Taq酶
Taq酶是从水生栖热菌 Thermus Aquaticus （ Taq ）中分 离出的具有热稳定性的DNA聚合酶。
5'到 3'合成 DNA能力 普通Taq酶 有 5'到 3'外 切酶活性 有 3'到 5'外 切酶活性 无 3'端加A
延伸速度
有
2000base/min
热启动Taq酶
有
有
无
有
2000base/min
P C R 反 应 体 系
PCR 原理
PCR（Polymerase Chain Reaction）是指在DNA聚合酶催化下， 以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等 步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。
pcr反应体系成分包括哪些
PCR反应体系成分包括哪些PCR（聚合酶链式反应）是一种在分子生物学研究中广泛使用的技术，用于扩增DNA 片段。
PCR 反应体系是指用于进行 PCR 反应的混合物，包括一系列关键成分，这些成分能够在温度变化下促使 DNA 的复制。
PCR 反应体系的核心成分包括 DNA 模板、引物、聚合酶、dNTPs 和缓冲液。
1. DNA 模板DNA 模板是在 PCR 反应中需要扩增的目标 DNA 片段。
这个片段可以是从细菌、动植物或人类中提取的 DNA。
PCR 的目标是在体系中扩增所需的特定 DNA 片段，因此DNA 模板是非常重要的。
2. 引物引物是两个短的 DNA 片段，它们是针对目标 DNA 片段的起始序列设计的。
引物在PCR 反应中起到了引导 DNA 复制的作用。
引物具有与目标 DNA 片段的两端互补的序列，它们会结合到目标 DNA 上，并作为 DNA 合成的起始点。
在 PCR 反应中，引物存在过量，以确保目标 DNA 片段的扩增。
3. 聚合酶聚合酶是一种酶类，它在 PCR 反应中起到关键的作用。
最常用的聚合酶是来自热泛菌属中的一种酶——特伦酶（Taq DNA polymerase）。
Taq 聚合酶具有耐高温的特性，因此适合在高温下进行 PCR 反应。
其他聚合酶如Pfu聚合酶、Tfl聚合酶也常用于特定的PCR。
聚合酶能够结合引物，从而将新的 DNA 链合成一个完整的双链 DNA。
4. dNTPsdNTPs（脱氧核苷酸三磷酸盐）是 DNA 合成过程中所需的构建块。
它们分别代表脱氧腺苷酸（dATP）、脱氧鸟苷酸（dGTP）、脱氧胞苷酸（dCTP）和脱氧胸苷酸（dTTP）。
在 PCR 反应体系中，dNTPs 以平衡的比例存在，以供 DNA 复制过程中的新链合成。
5. 缓冲液缓冲液是一种溶液，用于保持 PCR 反应的酶和其他组分的稳定性，以及调节反应体系的 pH 值。
缓冲液的成分通常包括一些盐和缓冲剂，如 Tris-HCl 和 KCl。
简述PCR反应所需要的体系及简要过程
简述PCR反应所需要的体系及简要过程引言PCR（聚合酶链式反应）是一种重要的分子生物学技术，可以在体外快速扩增DNA 序列。
它的广泛应用使得PCR成为现代生物科学研究的重要工具。
本文将简要介绍PCR 反应所需的体系以及整个过程。
PCR反应体系PCR反应体系由以下几个关键组分组成：模板DNA模板DNA是PCR反应中的起始物质，它含有我们想要扩增的DNA序列。
模板DNA可以来自多种来源，如基因组DNA、cDNA、病毒DNA等。
引物引物是PCR反应中的两个短寡核苷酸序列，它们与目标DNA序列的两端互补。
引物的设计非常重要，需要确保引物能够特异性地结合目标DNA序列，并且不能与其他非目标DNA序列结合。
反应缓冲液反应缓冲液提供了适宜的环境条件，使PCR反应能够顺利进行。
缓冲液中通常包含一定浓度的镁离子（Mg2+），以促进DNA聚合酶的活性。
dNTPsdNTPs是反应中所需的四种脱氧核苷酸，即dATP、dCTP、dGTP和dTTP。
它们作为DNA合成的原料，与模板DNA中的单链碱基互补结合，参与新DNA链的合成。
DNA聚合酶DNA聚合酶是PCR反应的关键酶类，它负责在反应过程中合成新的DNA链。
常用的PCR反应酶包括Taq DNA聚合酶和Pfu DNA聚合酶等。
PCR反应过程PCR反应经历三个主要的循环步骤：变性、扩增和延伸。
变性反应开始时，PCR反应体系中的DNA双链结构被加热至高温，使其变性成两条单链DNA。
这一步又称为变性步骤，其目的是使DNA解开双链结构，使得引物能够结合到目标序列的起始位点。
扩增在变性步骤之后，PCR反应体系中的温度被降低，使引物能够与目标DNA序列的两端互补结合。
DNA聚合酶沿着引物向3’方向合成新的DNA链，每一个引物结合位点都会产生两条新的DNA链。
这一步又称为扩增步骤，其结果是将目标DNA序列扩增为双数目标序列。
延伸在扩增步骤之后，PCR反应体系中的温度再次升高，以使未完成的DNA链得以延伸。
标准的pcr反应体系
标准的pcr反应体系PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种分子生物学技术，它可以在体外大量复制DNA片段。
PCR反应是在一定的条件下，通过DNA引物和DNA聚合酶，使目标DNA片段在体外迅速扩增，是分子生物学研究中常用的技术手段之一。
标准的PCR反应体系包括以下几个方面：1. DNA模板，PCR反应的第一步是添加待扩增的DNA模板。
这可以是从细胞中提取的基因组DNA，也可以是经过纯化的质粒DNA或PCR产物。
DNA模板的质量和纯度对PCR反应的效果有很大影响，因此在使用之前需要进行质检和定量。
2. 引物，PCR反应需要两个引物，它们分别位于待扩增DNA片段的两端。
引物的设计需要考虑到目标DNA的序列，确保引物能够特异性地结合到目标DNA 上。
此外，引物的长度和碱基组成也需要符合一定的要求，以保证PCR反应的效率和特异性。
3. DNA聚合酶，PCR反应中使用的DNA聚合酶通常是热稳定的，能够在高温下保持活性。
常用的DNA聚合酶有Taq聚合酶和Pfu聚合酶等。
在PCR反应中，DNA聚合酶起着复制DNA的作用，能够在高温下将引物结合到DNA模板上，并在适当的条件下合成新的DNA链。
4. 缓冲液，PCR反应需要在特定的pH和离子浓度条件下进行，因此需要添加合适的缓冲液来维持反应体系的稳定性。
常用的PCR缓冲液包括Tris-HCl缓冲液和KCl缓冲液等。
5. 脱氧核苷酸（dNTPs），PCR反应需要四种脱氧核苷酸作为DNA合成的原料，它们分别是脱氧腺苷酸（dATP）、脱氧鸟苷酸（dGTP）、脱氧胸苷酸（dCTP）和脱氧胸嘧啶酸（dTTP）。
在PCR反应中，这些脱氧核苷酸会被DNA聚合酶利用，与引物结合到DNA模板上，合成新的DNA链。
6. 离子，PCR反应中需要适当的离子浓度来维持DNA聚合酶的活性，通常通过添加Mg2+离子来实现。
Mg2+离子的浓度对PCR反应的效果有很大影响，需要根据具体的引物和DNA模板来进行优化。
标准的PCR反应体系
标准的PCR反应体系PCR反应体系与反应条件标准的PCR反应体系:10X扩增缓冲液10ul4种dNTP混合物各200umolL引物各10〜100mol模板DNA01 〜2ugTqDNA聚合酶25ug2+15mmolL加双或三蒸水至100ulPCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTR模板和g2+引物：引物是PCR寺异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。
理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
设计引物应遵循以下原则：①引物长度：15-30b ，常用为20b 左右。
②引物扩增跨度：以200-500b为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。
③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。
ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
⑤引物3' 端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCF失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。
引物量：每条引物的浓度01〜lumol或10〜100mol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
酶及其浓度目前有两种TqDNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。
催化一典型的PCR反应约需酶量2。
5U（指总反应体积为100ul 时），浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。
PCR反应体系包括哪些成分组成
PCR反应体系包括哪些成分组成引言聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）是一种重要的分子生物学技术，可用于放大DNA序列片段。
PCR在生物医学研究、遗传学分析、病毒检测、法医学等领域具有广泛的应用。
了解PCR反应体系的成分组成对于正确使用和优化PCR实验至关重要。
PCR反应体系成分组成PCR反应体系由若干关键成分组成，包括DNA模板、引物、DNA聚合酶、dNTPs （脱氧核苷酸三磷酸盐）、缓冲液以及水。
下面将逐个介绍这些组成成分。
DNA模板DNA模板是PCR反应的起始物质，它含有待扩增的目标DNA序列。
DNA模板可以是基因组DNA、cDNA（反转录合成的DNA）或已知DNA序列等。
PCR反应通过保温循环中的高温和低温步骤来模拟DNA复制过程，从而使DNA模板得以扩增。
引物引物是PCR反应中的两个短链DNA分子，它们与目标DNA序列的两端互补结合。
引物提供了扩增反应的起始位点，使聚合酶能够在该位点上开始合成DNA链。
引物的选择非常关键，它们的长度、碱基组成和互补性需要经过仔细设计和优化。
DNA聚合酶DNA聚合酶是PCR反应中的关键酶，它能够在合适的反应条件下，以DNA模板为引导，在引物的作用下合成新的DNA链。
常用的DNA聚合酶包括热稳定聚合酶（如Taq聚合酶）和高保真度聚合酶（如Pfu聚合酶）。
这些聚合酶具有耐高温的特性，从而使PCR反应的扩增步骤在高温条件下进行。
dNTPsdNTPs是PCR反应中DNA合成的原料，它们是脱氧核苷酸的三磷酸盐。
dNTPs包括dATP、dCTP、dGTP和dTTP，它们在PCR反应中与DNA聚合酶一起合成新的DNA 链。
dNTPs在PCR过程中为新合成的DNA提供了所需的碱基。
缓冲液缓冲液是PCR反应中的重要成分，它用于调节PCR反应体系的pH值，维持酶的活性，提供适宜的离子环境和缓冲性能。
常用的PCR缓冲液包括Tris-HCl缓冲液、KCl缓冲液等。
pcr反应体系的组成部分有哪些
PCR反应体系的组成部分有哪些PCR（聚合酶链式反应）是一种常用的分子生物学技术，用于扩增目标DNA序列。
PCR反应体系由多个关键组分组成，每个组分都扮演着重要的角色。
下面将介绍PCR反应体系的组成部分。
1. 模板DNA模板DNA是PCR反应的起点，需要扩增的目标DNA序列。
它可以是从生物样本中提取的任何DNA片段，如基因、细菌、病毒等。
PCR反应通过模板DNA的复制，扩增目标序列。
2. 引物引物是PCR反应中的两个短DNA片段，它们与目标DNA序列的两端互补。
引物的作用是提供起始点，让DNA聚合酶能够沿着目标序列合成新的DNA链。
引物的设计是PCR反应成功的关键，需要确保引物与目标序列的互补性。
3. DNA聚合酶DNA聚合酶是PCR反应中的核心酶类。
它能在适当的温度下，根据引物的互补性，在模板DNA上逐渐合成新的DNA链。
常用的DNA聚合酶是来自热液喷泉菌属（Thermus aquaticus）的热稳定酶，例如Taq聚合酶。
4. 反应缓冲液反应缓冲液是PCR反应中的重要组成部分，主要包括缓冲盐和其他稳定物质。
反应缓冲液的作用是维持反应体系的酸碱度和离子平衡，以提供适宜的环境供DNA聚合酶活性，使PCR反应能够进行顺利。
5. 镁离子镁离子（Mg2+）是DNA聚合酶活性所必需的辅助因子。
它参与到DNA链的合成过程中，稳定DNA的结构，调节酶的活性。
镁离子的浓度及其含量对PCR反应的成功与否有重要影响。
6. dNTPsdNTPs是反应体系中的四种脱氧核苷酸，分别是dATP、dCTP、dGTP和dTTP。
它们是DNA合成过程中新链的构建单位。
在PCR反应中，dNTPs提供所需的碱基单元，供DNA聚合酶逐渐合成新的DNA链。
综上所述，PCR反应体系的组成部分包括模板DNA、引物、DNA聚合酶、反应缓冲液、镁离子和dNTPs。
这些组成部分相互配合，共同推动PCR反应的进行，实现对目标DNA序列的扩增，为分子生物学研究和应用提供了强有力的工具。
pcr反应体系的基本构成
pcr反应体系的基本构成PCR（聚合酶链反应）是一种重要的分子生物学技术，它能够在体外迅速扩增特定DNA片段。
PCR反应体系的基本构成包括引物、DNA模板、dNTPs（脱氧核苷酸三磷酸盐）、聚合酶、缓冲液和水。
引物是PCR反应中的关键组成部分，它是DNA的两条链的起始序列，能够指示扩增特定DNA片段的位置。
引物一般由合成寡核苷酸组成，长度通常为18-30个碱基。
在PCR反应中，引物与DNA模板的两个互补序列结合，作为DNA聚合酶的起始点。
DNA模板是PCR反应中的待扩增的DNA片段，可以是从细胞中提取的基因组DNA，也可以是经过特定方法提取和纯化的DNA片段。
DNA 模板的质量和纯度对PCR反应的结果有重要影响，因此在PCR反应前需要对DNA模板进行质检和纯化处理。
dNTPs是PCR反应中的四种脱氧核苷酸三磷酸盐，分别是dATP、dCTP、dGTP和dTTP。
它们是DNA合成的基本单元，在PCR反应中起到提供碱基的作用。
dNTPs的浓度需要适当控制，过高或过低都会影响PCR反应的效果。
聚合酶是PCR反应中的关键酶，它能够在适宜的温度下，在DNA模板和引物的指导下，合成新的DNA链。
常用的聚合酶有Taq聚合酶和Pfu聚合酶，它们具有高度的热稳定性和DNA聚合酶活性，适用于PCR反应的高温环境。
缓冲液是PCR反应中必不可少的成分，它可以维持PCR反应体系的pH值和离子浓度稳定，提供适宜的反应环境。
常用的PCR缓冲液包括Tris-HCl缓冲液和KCl缓冲液。
水是PCR反应体系中的溶剂，它起到稀释其他反应成分和提供体积的作用。
水的质量和纯度对PCR反应的结果有一定影响，因此需要使用去离子水或高纯水。
除了上述基本构成外，PCR反应中还可以添加其他辅助成分，如Mg2+离子、PCR增效剂和引物嵌合物等。
Mg2+离子是聚合酶活性的必需离子，能够稳定DNA双链结构和提供DNA结合的稳定性。
PCR 增效剂可以提高PCR反应的效率和特异性，减少非特异性扩增产物的生成。
标准的PCR反应体系
标准的PCR反应体系PCR反应体系与反应条件--------------------------------------------------------------------------------标准的PCR反应体系：10×扩增缓冲液10ul4种dNTP混合物各200umolL引物各10～100mol模板DNA 01～2ugTqDNA聚合酶25ug2+ 15mmolL加双或三蒸水至100ulPCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和g2+引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。
理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
设计引物应遵循以下原则：①引物长度：15-30b，常用为20b左右。
②引物扩增跨度：以200-500b为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。
③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。
ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
⑤引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。
引物量：每条引物的浓度01～1umol或10～100mol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
酶及其浓度目前有两种TqDNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。
pcr标准反应体系
pcr标准反应体系PCR标准反应体系。
PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种分子生物学技术，用于扩增DNA片段。
PCR标准反应体系是PCR技术中非常重要的一环，它的稳定性和准确性直接影响到PCR扩增的结果。
本文将介绍PCR标准反应体系的组成和影响因素。
PCR标准反应体系由DNA模板、引物、酶、缓冲液、dNTPs和水组成。
其中，DNA模板是待扩增的DNA片段，引物是用于识别目标DNA序列的寡核苷酸片段，酶是用于DNA合成的酶，缓冲液用于维持反应体系的pH值，dNTPs是四种脱氧核苷酸，用于DNA合成，水则是PCR反应的溶剂。
这些组分的比例和质量都会对PCR反应的效果产生影响。
首先，DNA模板的质量和浓度会直接影响到PCR扩增的效果。
如果DNA模板的质量不好或者浓度过低，会导致PCR扩增产物稀少或者根本无法扩增。
因此，在进行PCR反应前，需要对DNA模板进行质量和浓度的检测，以确保PCR反应的准确性和稳定性。
其次，引物的设计和浓度也是影响PCR反应的重要因素。
引物的设计需要考虑到目标DNA序列的特点，如GC含量、碱基序列等，以确保引物能够特异性地识别目标DNA序列。
引物的浓度过高或者过低都会影响到PCR反应的效果，因此需要进行引物的优化实验，确定最佳的引物浓度。
酶是PCR反应中的关键因素之一，不同的酶具有不同的特性，如热稳定性、扩增速率等。
选择合适的酶对PCR反应的效果至关重要。
同时，酶的浓度也需要进行优化实验，以确定最佳的酶浓度。
缓冲液的选择和pH值的调节可以影响PCR反应的特异性和效率。
不同的缓冲液具有不同的缓冲能力和离子强度，因此需要根据实验需求选择合适的缓冲液。
同时，缓冲液的pH值也需要进行调节，以确保PCR反应在最适宜的pH条件下进行。
dNTPs是PCR反应中必不可少的组分，它们是DNA合成的基本原料。
因此，dNTPs的质量和浓度也会对PCR反应产生影响。
需要注意的是，dNTPs的浓度过高或者过低都会影响到PCR反应的效果，因此需要进行优化实验，确定最佳的dNTPs浓度。
什么叫PCR反应体系
什么叫PCR反应体系？多聚酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，它能以极少量的DNA为模板快速复制出上百万份的DNA拷贝，而这一过程的发生和完成需要一系列的物质条件，这些物质条件共同组成了PCR反应体系。
PCR反应体系主要由缓冲液、模板、dNTP，耐热DNA聚合酶、引物及其特定的反应条件。
与细胞内DNA复制相比，PCR反应体系中没有解旋酶，而是通过90～95℃的高温使DNA变性解链；PCR 反应体系中也没有添加A TP，是由dNTP释放外侧的两个磷酸基团而提供能量；PCR反应体系中的引物不是RNA片段，而通常为一段特定的DNA单链；PCR反应体系中的DNA 聚合酶不是常见的普通DNA聚合酶，而是热稳定性很强的耐热DNA聚合酶。
缓冲液除了提供一定的pH缓冲能力外，还有一些有助于反应进行的成分。
PCR反应缓冲液通常采用10mmol/L的Tris-HCl（pH8.3～9.0，室温）缓冲液体系，它是两性离子缓冲剂，其中含有可激活DNA聚合酶活性中心的Mg2＋, Mg2＋浓度高低还可显著影响PCR扩增产物的特异性。
此外，缓冲液中还含有50mmol/L的K＋,有利于引物与模板的退火。
有些缓冲液中还加入明胶或血清蛋白（100μg/mL）及去污剂（如Tween20等），对Taq DNA聚合酶起稳定作用。
模板中含有待扩增的DNA，其数量直接影响扩增效果。
对于一般PCR扩增，104～107个模板分子可以达到满意的效果。
除了模板数量外，模板的纯度也非常重要，不能有其他DNA、太多的蛋白质的污染，特别是其他DNA的污染，即使是痕量DNA，也会导致非特异性产物的产生。
dNTP（脱氧核苷三磷酸）为dA TP、dCTP、dGTP和dTTP4种脱氧核苷三磷酸的混合物。
dNTP溶于pH为7.0的NaOH贮存液中，最初的贮存液可稀释到10mol/L，分装后存放在-20℃冰箱保存中。
PCR反应体系包括哪五种基本类型
PCR反应体系包括哪五种基本类型PCR（聚合酶链反应）是一种广泛应用于分子生物学的技术，可用于扩增DNA片段。
它是一项重要的实验室技术，广泛应用于基因组学、病原学、遗传学和法医学等领域。
PCR反应体系由各种基本组分组成，其中包括五种基本类型。
1. DNA模板PCR反应的第一个基本类型是DNA模板。
DNA模板是PCR反应的起始物，可以是基因组DNA、cDNA或重组DNA等。
PCR反应的目标是通过扩增DNA片段来获取足够的DNA产物用于下一步的分析和应用。
2. 引物PCR反应中的第二个基本类型是引物。
引物是PCR反应的一部分，它们是用于扩增特定DNA区域的短链DNA片段。
引物是PCR反应的关键组成部分，因为它们会与模板DNA特异性地结合，并进行扩增反应。
引物能够绑定到模板DNA的两端，在DNA聚合酶的作用下，使DNA链被扩增。
3. DNA聚合酶PCR反应的第三个基本类型是DNA聚合酶。
DNA聚合酶是PCR反应的关键酶类之一，它能够识别和结合到引物的末端，并将新的DNA合成到模板DNA上。
聚合酶负责从引物的末端开始构建新的DNA链，扩增目标DNA。
4. 反应缓冲液PCR反应的第四个基本类型是反应缓冲液。
反应缓冲液是PCR反应体系中的一种溶液，它提供了DNA聚合酶所需的适宜环境。
反应缓冲液通常包含盐、缓冲剂和其他增强剂，以确保PCR反应的效果和稳定性。
5. 双脱氧核苷酸三磷酸盐（dNTPs）PCR反应的最后一个基本类型是双脱氧核苷酸三磷酸盐（dNTPs）。
dNTPs是PCR 反应中用于合成新DNA链的核苷酸单元。
它们是四种不同的核苷酸单元，包括脱氧腺嘌呤核苷酸（dATP）、脱氧鸟苷酸（dGTP）、脱氧胸腺嘧啶核苷酸（dTTP）和脱氧胞嘧啶核苷酸（dCTP）。
在PCR反应中，这些dNTPs会与DNA聚合酶一起合成新的DNA 链。
综上所述，PCR反应体系由DNA模板、引物、DNA聚合酶、反应缓冲液和dNTPs 等五种基本类型组成。
PCR反应体系与反应条件
标准的PCR反应体系：10×扩增缓冲液 10ul4种dNTP混合物各200umol/L引物各10～100pmol模板DNA 0.1～2ugTaq DNA聚合酶 2.5uMg2+ 1.5mmol/L加双或三蒸水至 100ulPCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。
理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
设计引物应遵循以下原则：①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。
②引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。
③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。
ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
⑤引物3’端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。
引物量：每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
酶及其浓度目前有两种Taq DNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。
催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。
PCR反应体系怎么设置
PCR反应体系怎么设置简介PCR（聚合酶链式反应）是一种快速、高效、特异性很强的体外DNA复制技术，广泛应用于分子生物学和遗传学领域。
而PCR反应体系的正确设置对于保证PCR反应的准确与稳定至关重要。
PCR反应体系的组成PCR反应体系通常由以下几个关键组分组成：1. 模板DNA模板DNA是PCR反应中需要复制的DNA分子，可以是基因组DNA或已知序列的DNA片段。
模板DNA的浓度对PCR反应的成功与否有很大影响，一般浓度应在10ng/μL到100 ng/μL之间。
2. 引物引物是一对短的DNA寡核苷酸序列，分别位于待扩增片段的前后。
它们通过与模板DNA序列特异性结合，指导DNA聚合酶的扩增方向。
引物应具有高特异性、高纯度，并且浓度应在0.1 μM到1 μM之间。
3. dNTPsdNTPs是PCR反应中的四种脱氧核苷酸，包括dATP、dCTP、dGTP和dTTP。
它们是构建新DNA链所需的单体单位。
dNTPs浓度通常在0.2 mM到0.4 mM之间。
4. DNA聚合酶DNA聚合酶是PCR反应中的关键酶，负责在反应过程中合成新的DNA链。
常用的DNA聚合酶有Taq DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶等。
聚合酶的选择应根据反应需要和要扩增的DNA片段的特性而定。
5. 缓冲液缓冲液提供了适宜的pH条件和离子环境，维持PCR反应的稳定性。
通常使用的缓冲液包含Tris-HCl和KCl，并添加MgCl2以提供适宜的反应离子浓度。
PCR反应体系的设置步骤1.准备PCR反应组分的工作液。
根据所需PCR反应的体积，计算并配制相应浓度的引物、dNTPs、缓冲液和DNA聚合酶。
2.合并PCR反应组分。
按照以下顺序将工作液逐一加入PCR试管中：•缓冲液：将合适量的缓冲液加入PCR试管中，确保最终反应体系中缓冲液的最终浓度正确。
•dNTPs：加入适量的dNTPs，确保最终反应体系中每种脱氧核苷酸的浓度正确。
•模板DNA：加入适量的模板DNA，确保最终反应体系中模板DNA的浓度正确。
pcr反应体系
标准的PCR反应体系：10×扩增缓冲液10ul4种dNTP混合物各200umol/L引物各10～100pmol模板DNA 0.1～2ugTaq DNA聚合酶 2.5uMg2+ 1.5mmol/L加双或三蒸水至100ulPCR反应五要素参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。
理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
设计引物应遵循以下原则：①引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。
②引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。
③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。
ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
⑤引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。
引物量：每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
酶及其浓度目前有两种Taq DNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。
催化一典型的PCR 反应约需酶量2。
5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。
PCR反应体系由哪些组成的
PCR反应体系由哪些组成的PCR（聚合酶链式反应）是一种在分子生物学中广泛应用的技术，用于扩增DNA序列。
PCR反应体系由以下几个核心组成部分构成：模板DNAPCR反应的第一个关键组成部分是模板DNA。
模板DNA是待扩增的DNA片段，可以从生物样品中提取得到，如细菌培养物、植物组织或动物细胞等。
PCR的目的是扩增模板DNA中感兴趣的特定序列。
引物引物是PCR反应中的另一个重要组成部分。
引物是短的DNA片段，它们的序列与待扩增的DNA序列的两端互补。
引物通过与模板DNA序列的互补配对，作为PCR反应的起点。
PCR反应过程中，引物会分别结合到模板DNA的两条链上，作为DNA聚合酶的起始点。
DNA聚合酶DNA聚合酶是PCR反应中的关键酶类。
它能够识别引物与模板DNA的互补序列，并在引物的帮助下，在扩增过程中合成新的DNA链。
在PCR反应过程中，DNA聚合酶将引物延伸为新的DNA链，与模板DNA的两条链一起形成双链DNA。
dNTPsdNTPs（脱氧核苷三磷酸）是PCR反应中的四种核苷酸单元，包括脱氧腺嘌呤酸（dATP）、脱氧鸟苷酸（dGTP）、脱氧胞嘧啶酸（dCTP）和脱氧胸腺嘧啶酸（dTTP）。
这些dNTPs是DNA聚合酶在PCR反应中合成新DNA链所需的原料。
缓冲液和盐缓冲液和盐是PCR反应体系中的重要成分。
缓冲液提供了所需的pH条件，以保持PCR反应处于最佳状态。
盐的存在有助于维持PCR反应的离子强度和稳定性。
热稳定性PCR反应体系中还需要热稳定性组分，如热稳定的DNA聚合酶。
由于PCR反应需要多次变温循环，包括高温变性、低温退火和中等温度延伸等步骤。
热稳定性组分可以在高温下保持活性，以确保PCR反应的成功进行。
综上所述，PCR反应体系由模板DNA、引物、DNA聚合酶、dNTPs、缓冲液、盐和热稳定性组分等多个组成部分构成。
这些组成部分相互作用，形成一个复杂但高效的PCR反应体系，用于扩增DNA序列。
pcr反应体系应包含哪些成分及用量的方法
pcr反应体系应包含哪些成分及用量的方法引言聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）是一种常用于扩增DNA片段的技术。
在PCR反应体系中，正确的成分及其用量对于反应的成功和效果至关重要。
本文将介绍PCR反应体系中应包含的成分以及其用量的方法。
PCR反应体系成分下面是PCR反应体系中应包含的主要成分：1.模板DNA（Template DNA）：PCR反应的起点DNA。
可以是基因组DNA、cDNA或任何其他含有待扩增片段的DNA。
通常情况下，将模板DNA浓度控制在1-100ng/μl之间。
2.引物（Primers）：PCR反应需要两个特异性引物，用于定位待扩增片段的起始和终止位点。
引物的长度通常在18-30个碱基对之间，浓度在0.1-1μM范围内。
3.核苷酸三磷酸（dNTPs）：PCR反应需要四种核苷酸三磷酸（dATP、dCTP、dGTP、dTTP），用于DNA链的合成。
每种核苷酸的浓度应为200-400μM。
4.缓冲液（Buffer）：PCR反应需要在特定pH条件下进行，缓冲液用于调节反应体系的pH值。
常用的缓冲液包括Tris-HCl缓冲液、KCl缓冲液等。
5.Mg2+离子：Mg2+离子是DNA聚合酶的必需辅因子，用于维持DNA聚合酶的活性。
通常在反应体系中的Mg2+浓度为1-2.5mM。
6.DNA聚合酶（DNA Polymerase）：PCR反应需要一种高度稳定和高效的DNA聚合酶。
常用的聚合酶包括Taq聚合酶、Pfu聚合酶等。
聚合酶的用量需要根据不同品牌和反应体系进行调整。
除了以上主要成分外，还可以添加一些辅助成分来提高PCR反应的效果，例如：•BSA（Bovine Serum Albumin）：在特定情况下，BSA可以提高PCR反应的特异性和扩增效率。
通常的BSA浓度为0.1-1mg/ml。
•DMSO（Dimethyl Sulfoxide）：DMSO可以降低DNA的熔解温度，使PCR反应在高GC含量的区域更加稳定。
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PCR反应体系2007-07-20 11:04:33PCR反应体系与反应条件标准的PCR反应体系：10×扩增缓冲液 10ul4种dNTP混合物各200umol/L引物各10～100pmol模板DNA 0.1～2ugTaq DNA聚合酶 2.5uMg2+ 1.5mmol/L加双或三蒸水至 100ulPCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。
理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
设计引物应遵循以下原则：①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。
②引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。
③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。
ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
⑤引物3’端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。
引物量：每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
酶及其浓度目前有两种Taq DNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。
催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。
dNTP的质量与浓度dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP 粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。
dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris。
HCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，小量分装， -20℃冰冻保存。
多次冻融会使dNTP降解。
在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。
浓度过低又会降低PCR产物的产量。
dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。
模板(靶基因)核酸模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。
SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。
提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。
一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。
RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。
Mg2+浓度Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。
Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。
PCR反应条件的选择PCR反应条件为温度、时间和循环次数。
温度与时间的设置：基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。
在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40 ～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。
对于较短靶基因(长度为100～300bp 时)可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性)。
①变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。
一般情况下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。
此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。
②退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。
变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。
由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。
退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。
对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。
引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T)复性温度=Tm值-(5～10℃)在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。
复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。
③延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性：70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子70℃ 60核苷酸/S/酶分子55℃ 24核苷酸/S/酶分子高于90℃时， DNA合成几乎不能进行。
PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。
PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。
3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。
延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。
对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。
循环次数循环次数决定PCR扩增程度。
PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。
一般的循环次数选在30～40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。
PCR反应特点特异性强 PCR反应的特异性决定因素为：①引物与模板DNA特异正确的结合；②碱基配对原则；③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；④靶基因的特异性与保守性。
其中引物与模板的正确结合是关键。
引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。
聚合酶合成反应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。
再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。
灵敏度高 PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12g)量级的起始待测模板扩增到微克(ug=10-6g)水平。
能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位)；在细菌学中最小检出率为3个细菌。
简便、快速 PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2～4 小时完成扩增反应。
扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。
对标本的纯度要求低不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板。
可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测。
PCR扩增产物分析PCR产物是否为特异性扩增，其结果是否准确可靠，必须对其进行严格的分析与鉴定，才能得出正确的结论。
PCR产物的分析，可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法。
凝胶电泳分析：PCR产物电泳，EB溴乙锭染色紫外仪下观察，初步判断产物的特异性。
PCR产物片段的大小应与预计的一致，特别是多重PCR，应用多对引物，其产物片断都应符合预讦的大小，这是起码条件。
琼脂糖凝胶电泳：通常应用1～2%的琼脂糖凝胶，供检测用。
聚丙烯酰胺凝胶电泳：6～10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好，条带比较集中，可用于科研及检测分析。
酶切分析：根据PCR产物中限制性内切酶的位点，用相应的酶切、电泳分离后，获得符合理论的片段，此法既能进行产物的鉴定，又能对靶基因分型，还能进行变异性研究。
分子杂交：分子杂交是检测PCR产物特异性的有力证据，也是检测PCR 产物碱基突变的有效方法。
Southern印迹杂交：在两引物之间另合成一条寡核苷酸链(内部寡核苷酸)标记后做探针，与PCR产物杂交。
此法既可作特异性鉴定，又可以提高检测PCR产物的灵敏度，还可知其分子量及条带形状，主要用于科研。
斑点杂交：将PCR产物点在硝酸纤维素膜或尼膜薄膜上，再用内部寡核苷酸探针杂交，观察有无着色斑点，主要用于PCR产物特异性鉴定及变异分析。
核酸序列分析：是检测PCR产物特异性的最可靠方法。
PCR常见问题总结PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。
假阴性，不出现扩增条带PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及活性④PCR循环条件。
寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。
⑤模板核酸变性不彻底。
在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。
酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。
需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。
引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。
有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。
②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。
如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。
③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。