七叶亭对巨噬细胞株TNF

七叶亭对巨噬细胞株TNF【摘要】目的：探索七叶亭（esculetin）对巨噬细胞株raw264.7细胞活性及分泌炎性因子tnf-α、il-6和nf-κb表达的影响。

方法：分别加入12.5、25、50μm的esculetin与巨噬细胞raw264.7共培养24h后，mtt观察不同浓度esculetin对细胞活力的影响； elisa检测上清液中tnf-α、il-6含量；western blot 检测nf-κb的表达。

结果：不同浓度的esculetin对raw264.7活力无明显影响；不同浓度的esculetin可抑制巨噬细胞分泌tnf-α、il-6，浓度越高，抑制作用越强；esculetin抑制nf-κb蛋白的活化作用随浓度变化而不同，25μm和50μm对nf-κb活化的抑制作用最强。

结论： esculetin对巨噬细胞株raw264.7的活力无明显影响；esculetin能抑制炎性因子tnf-α、il-6的分泌，并呈剂量依赖关系；能抑制nf-κb蛋白的活化。

其发挥抗炎作用有可能是依赖nf-κb信号通路而完成的。

【关键词】七叶亭；巨噬细胞；tnf-α；il-6；nf-κb【中图分类号】r 【文献标识码】a 【文章编号】1004-7484（2012）12-0013-03动脉粥样硬化（atherosclerosis， as）是缺血性心脑血管病的病理基础，心脑血管病发病率与死亡率近年也明显增加。

as具有慢性炎症反应特征的病理过程[1]，而且as从粥样硬化斑块形成到斑块破裂，导致血栓形成的各个阶段，都有炎症细胞和炎症介质参与。

本研究用七叶亭（esculetin）作用于巨噬细胞 raw264.7，观察巨噬细胞活性、分泌tnf-α、il-6以及对nf-κb活化的影响，探讨七叶亭抑制炎症反应-抗动脉粥样硬化的可能机制。

1 材料与方法1.1 细胞株小鼠单核巨噬细胞株raw264.7购自中科院上海细胞生物学研究所1.2 实验试剂七叶亭（ alfa公司），mtt （ sigma公司），胎牛血清（杭州四季青生物材料有限公司），dmem培养基（南京凯基生物工程有限公司），小鼠tnf-α、il-6 elisa试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司），兔抗nf-κb p65，p-nf-κ b p-p65抗体（cell signaling公司），β-actin蛋白多克隆一抗，山羊抗兔二抗，马抗小鼠二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司）。

1.3 主要仪器与设备低温高速离心机（中国科大创新股份有限公司），电热恒温水浴箱（北京医疗设备厂），olympus荧光倒置显微镜（日本olympus公司），酶标仪bio-rad 550（美国伯乐公司），微型高速离心机（珠江黑马医学仪器有限公司），-80℃超低温冰箱、超净工作台（美国forma公司），co2培养箱（香港力康heal force公司），微量加液器（芬兰biohit公司）。

1.4 实验方法1.4.1 细胞活性的 mtt检测（1）接种细胞：用0.25%胰酶-0.02% edta消化液将培养的第3代raw264.7细胞从细胞培养瓶壁消化下来，再用含10%胎牛血清培养基配成单细胞悬液，调细胞密度2.5×104个/ml，每孔200μl，接种在96孔板中；（2）实验分组：空白对照组，esculetin12.5μm，esculetin25μm，esculetin50μm（见表1）。

每组设4个复孔；（3）细胞培养：37℃、5% co2条件下培养，24h后换无血清dmem 培养液，继续孵育24 h后加入药物干预24h；（4）呈色：分别于药物作用结束前4h，每孔加5mg·ml- 1 mtt 20μl，4h后终止培养，吸弃孔内上清液，每孔加150μl二甲基亚砜（dmso），振荡10min 使结晶充分溶解；（5）比色：在酶标仪上490 nm波长处测定吸光度。

1.4.2 巨噬细胞 raw264.7分泌tnf-α、il-6的检测用含10%胎牛血清培养基培养raw264.7细胞，细胞长满瓶底80%时，弃去培养基，加pbs液漂洗 2次；加入含胰酶和edta的消化液1-2ml，37℃消化约2min，镜下可见细胞基本圆形回缩即中止消化；弃消化液加pbs液漂洗 2次，加入新培养液10 ml，反复吹打混悬细胞，细胞密度调整为1×55/ml；以每孔 1ml细胞悬液将细胞接种到6孔板，每孔再加培养基4ml；然后将6孔板放入 5%co2孵箱37℃培养24h，待细胞长满瓶底80%时（见图1），弃去上清液，分别加入终浓度为0（空白对照），12.5μm，25μm，50μm的含药培养基dmem，继续培养24h。

收集每孔培养基2ml，1000r/min离心20 min，取上清液，放入-20℃保存，留作检测tnf-α、il-6。

tnf-α、il-6的检测分别按tnf-α、il-6elisa试剂盒说明书操作，每组设复孔10个。

1.4.3 巨噬细胞raw264.细胞nf-κb活化水平的检测（1）选择生长良好的巨噬细胞，胰蛋白酶制备细胞悬液，分入6孔板（选用其中4孔），调整细胞密度，待细胞贴壁生长至80-90%汇合时，吸弃原含10%胎牛血清的培养液，换用无血清的dmem培养液继续培养24h，使巨噬细胞同步化，处于g0/g1期。

各实验组加入相应药物干预，对照组不处理，放入培养箱中继续培养，在24h 后结束培养。

取出6孔板，倒掉培养基，预冷的4℃pbs液润洗培养板2次，吸净残液，用细胞刮刀将细胞刮下，离心收集，加入细胞膜裂解液，混匀后冰浴15min，13000g离心15min，上清液作为胞浆蛋白提取物进行蛋白质印迹分析；沉淀用细胞膜裂解液洗涤一次，混悬于细胞核裂解液，混匀后-20℃冷冻过夜，13000g离心15min，上清液作为核蛋白提取物进行蛋白质印迹分析，用于分析nf-κb p65入核；（2）用bca蛋白测定试剂盒说明书分别测定胞浆蛋白和核蛋白浓度；（3）sds-page凝胶电泳分离，电转移蛋白至pvdf膜，用5 %的脱脂奶粉在室温下封闭1h，洗膜后加入一抗在摇床孵育2h，然后4℃过夜，第二天洗膜后加入二抗在室温孵育2h，漂洗去除未结合的二抗，在暗室中进行显色。

1.5 统计学分析使用graphpad prism 5.0分析软件，数据以mean ± s.e.m.表示。

各组间的比较采用单因素方差分析（one-way anova）。

p0.05）2.2 esculetin对巨噬细胞分泌tnf-α、il-6的影响与对照组相比较，不同浓度的esculetin组上清中tnf-α、il-6浓度明显降低（p0.05）。

3 讨论as是一个复杂的慢性炎症性病理过程[1]，它具备组织细胞变性、坏死，单核/淋巴细胞渗出，平滑肌细胞纤维性增殖等经典炎症反应的基本病理学特征[ 2-3]。

同时也存在一般慢性炎症反应所没有的特殊现象，如脂质沉积、钙化和血栓形成等，且有免疫系统参与[4]。

大量的炎症因子对as的形成和发展发挥了至关重要的作用[5]。

而血管壁的炎性反应最初是对血管损伤的保护机制，通过炎性细胞如单核细胞、巨噬细胞增生保持机体内环境的稳定，但如果炎症未能及时消除，则会对组织、血管造成破坏。

抗炎干预是防治as的新的研究方向和途径[6]。

研究炎症反应在as发生、发展和恶化中所起的作用，有助于理解不同的干预措施减少临床事件的机制，本实验将抑制巨噬细胞炎症因子表达作为抑制as发生、发展的重要手段。

很多中药具有抗炎、抗肿瘤和免疫调节等作用，采用具有抗炎作用的中药治疗as可能成为很有希望的研究方向。

esculetin是双香豆素类的衍生物，具有很多生物学活性，具有很强的抗炎作用，临床上有用于对骨关节炎的治疗[7]；其传统功效清热燥湿、平喘止咳、收涩、明目，可用于治疗细菌性痢疾、肠炎和气管炎有很好的效果。

esculetin还是一种脂溶性药物，易穿透细胞膜，并在动脉壁内扩散[8-9]；esculetin能干扰细胞增生周期，有效抑制炎症介导促细胞增殖作用[10]。

目前认为巨噬细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞等炎性细胞的激活是as始动环节，巨噬细胞参与从脂质沉积到斑块破裂的所有过程[11]。

由于巨噬细胞的浸润，进一步引发局部和全身天然的和继发的免疫反应[12]，监测和调控外周血单核和动脉组织巨噬细胞是防治as的首要和关键因素。

raw264.7细胞是来源于小鼠巨噬细胞的细胞系，来源广泛、贴壁易养、性质稳定，具有巨噬细胞的特性，在许多研究形成的通路、抗炎药物的作用机制以及炎症信号传导通路的实验中，很多都以raw264.7巨噬细胞作为研究对象[13-15]。

本实验以巨噬细胞株raw264.7为作用细胞，选用浓度分别为12.5μm、25μm、50μm的esculetin培养24h，并通过mtt 来检测药物对细胞的影响，结果显示不同药物浓度对细胞活力没有影响。

巨噬细胞之所以能在as中发挥作用，与其分泌的多种细胞因子（如il-1β、il-6和tnf-α等）有关[5]。

il- 6、tnf-α通过细胞一系列的信号转导活化nf-κb，使炎症介质和细胞因子的基因转录增强，进一步促使中膜的平滑肌细胞向内膜下迁移、增殖并发生表型转化，还导致更多的炎症介质tnf-α和il-6释放，促使更多的单核细胞聚集、浸润，而tnf-α和il-6又可作为nf-κb的胞外刺激信号，进一步激活nf-κb，导致最初的炎症信号进一步放大，最终导致as 病变的发生发展[16]。

目前人们对于细胞因子间存在着“交叉联系”，其复杂网络中各环节的具体作用及详细机制还了解不足，故尚须进行大量的实验研究过程，来探讨可能从内在的分子机制。

我们的实验以炎性因子tnf-α、il-6的分泌为切入点，证实esculetin能抑制炎性因子tnf-α、il-6的分泌，并呈现明显的剂量依赖性，随着药物浓度的增加，抑制炎症因子分泌的作用也越来越强，通过抑制炎性因子分泌证明esculetin的抗炎作用。

观察不同浓度的esculetin对nf-κb的蛋白活化的影响。

western blot结果证实，与对照组相比，不同浓度的esculetin可抑制nf-κb p65的蛋白表达，从而我们猜想esculetin是通过nf-κb信号通路抑制巨噬细胞发挥抗炎作用。

综上所述，esculetin能够通过nf-κb有效抑制巨噬细胞炎性因子的分泌，从而有效抑制血管炎症反应，发挥抗as的作用。

目前国内外尚鲜有关于此方面的报道，但随着中药日趋受到重视和越来越广泛的心血管临床应用，挑选新的低毒、低廉、高效的心血管药物越发重要，我们认为esculetin这种抗as的中药将可能有效用于心血管疾病的治疗中，本研究初步提供esculetin抗as的理论和实验依据，为日后esculetin在心血管临床的应用奠定基础，相信不久的将来，对esculetin在心血管中应用会有更深层次的了解。