Cry2A杀虫蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化

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水稻密码子优化的cry2A ＊基因在大肠杆菌中的表达及其表达产物的纯化

ＣｉｇｉｕｕａＵｉｅｓｙＢｉｇ１０８，ｈｎ）ｈｎＡｒｌｒｎｖｒｔ，ｅｉ０３Ｃｉａａｃｔｌｉｊｎ０
Ａｂｔａｔ：ＴｅｃｄｎｅｕｎｅｏｃｒｆｒｂｅｃｄｎｏｔｚｄｃｙＡｇｎｓａｌｅｉｏｙｒｅｈｉａｔｎｓｒｃｈｏｉｇｓｑｅｃｆｅｐｅｅａｌｏｏｐｉｅｒ２ｉｒｍｉｅｅｗａｍｐｉｄｖａｐｌｍｅａａｎｒｃｉｉｆｓｃｅｏ
（中国农业大学食品科学与营养工程学院食品生物技术实验室，北京樯１０８）００３
要：通过ＰＲ从克隆载体ｐＣＵＣ１．ＺＣｙＡ＊８３／ｒ２上扩增水稻偏爱型密码子优化的抗虫基因ｃｙＡ＊ｒ２，经限制性内切
酶Ｎｄ和Ｂｍ双酶切定向插入到原核表达载体ｐＴ２ａ＋，成功构建了在表达蛋白的Ｎ端只带有６个组氨酸标ｅＩａＨＩＥ．８（）
（ＣＲ）ｒｍｒｃｍｂａｔｌｍｉＵＣ１・ＺＣｒ２．ｈｎｈＣＲｐｏｕｔｆｒ２ｇｎＰｆｏｅｏｉｎｐａｄｐｎｓ８３／ｙＡＴｅｔｅＰｒｄｃｓｏｃｙＡｅｅｗｅｉｓｒｄｉｔｘｒｓｉｎｖｃｏｅｒｎｅｔｎｏｅｐｅｓｏｅｔｒｅ
ｒｃｍｂｎｎｒｔｉｓｐｒｆｅｙＮｉｅｏｉａｔｏｅｎｗａｕｉｄｂ — ｐｉＮＴＡｆｎｔｈｏｔｇａｈ，ｄｔｅｐｒｔｓｕｏ９％ａｃｒｉｇｔｉｙｒａｆｉｃｒｍａｏｒｐｙａｕｉｉｐｔ５ｉｙｎｈｙｃｏｄｎｔｎｌｅｏｈａｓａｎｎａｙｉ．ｃｎｉｇａｌｓｓｎ

抗肿瘤新药一豹蛙酶在大肠杆菌中的克隆表达及分离纯化化

抗肿瘤新药一豹蛙酶微生物与生化药学（医）王娜108120105/12/2011随着医学的进步，普通传染病逐渐被控制，恶性肿瘤(癌症)成为目前最为常见且严重威胁人类生命和生活质量的主要疾病之一。

抗肿瘤药物市场近年来呈逐年增长的势头，目前占世界药品市场总销售额的4．2％左右。

份额虽小，但进入20世纪90年代以来，由于肿瘤病人的总体增加趋势和肿瘤发病者的年轻化趋势，临床上对于新型肿瘤治疗药的需求量急剧上升。

豹蛙酶是一种抗肿瘤药物，属于核糖核酸酶A超家族，它的核糖核酸酶活性低，细胞毒性较强，在体内外对多种肿瘤具有显著杀伤作用，是目前全球正在重点研究的100种新药之一。

豹蛙酶英文名称为onconase，最早分离自北极豹蛙的卵母细胞和早期胚胎，属于核糖核酸酶A超家族。

1988年Mikulski等发现蛋白经过纯化和粗提，在体外能有效地抑制人下颚癌细胞株A-253、人白血病细胞HL-60和人腺癌细胞株Colo 320等的生长并能杀死细胞，通过体内实验进一步证明了其抗肿瘤活性，同时并显示出时间剂量依赖效应。

1991年Aldelt等测出了它的全序列，并根据oneology和ribonuelease将其命名为onconase。

1994年Merlino等用1.7AX 射线对其三维结构做了准确的描述，其结构和性质均类似于天然蛋白质。

从1996到2004年Alfacell公司相继开展了豹蛙酶对肺小细胞肺癌、恶性间皮瘤、乳腺癌、胰腺癌、肾癌等临床研究，其中对恶性间皮瘤疗效显著，且副作用小。

一、豹蛙酶抗肿瘤作用机制与细胞膜表面受体结合转入细胞质，破坏细胞膜的整体性，降解胞质中高分子rRNA，抑制蛋白质合成导致减缓细胞增殖和细胞凋亡是豹蛙酶细胞毒性的基本机制，这在目前所有上市药物中是独一无二的。

豹蛙酶与细胞膜受体结合，通过内吞作用转入细胞质，同时破坏细胞膜的整体性，这一过程需要三磷酸腺苷(ATP)，是豹蛙酶细胞毒性作用的关键步骤。

苏云金芽孢杆菌Cry2Aa蛋白的体外表达及纯化

苏云金芽孢杆菌Cry2Aa蛋白的体外表达及纯化高洁荣;何颖;邹泽红;艾云灿【期刊名称】《湖北农业科学》【年(卷),期】2013(052)003【摘要】根据大肠杆菌密码子偏好性对苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)cry2Aa基因进行优化,并合成全长基因,将cry2Aa基因克隆到表达载体pET-44a上,转化到大肠杆菌Rosetta中进行诱导表达,优化表达条件,采用亲和层析和SDS-PAGE胶回收纯化,Western blot鉴定回收产物.结果表明,IPTG浓度为0.50 mmol/L、27℃诱导4h时Cry2Aa蛋白表达量最高,SDS-PAGE胶回收Cry2Aa纯化蛋白所得的产量高于亲和层析法.%cry2Aa gene of Bacillus thuringiensis was optimized according to codon preference of Escherichia coli,which was then synthesized and cloned into expression vector pET44a and transformed into E.coli Rosetta strain.The expression of Cry2Aa protein was induced under optimized conditions.The expressed protein was purified by affinity chromatography and SDS-PAGE gel extraction,and identified by Western blot.The results showed that expression of Cry2Aa protein was the highest when induced by 0.50 mmol/L IPTG at 27 ℃ for 4 h.Yield of purified recombinant protein Cry2Aa obtained by SDSPAGE gel extraction was higher than that of affinity chromatography.【总页数】4页(P702-705)【作者】高洁荣;何颖;邹泽红;艾云灿【作者单位】中山大学生命科学院/有害生物控制与资源利用国家重点实验室,广州510275;广州医学院第二附属医院/呼吸疾病国家重点实验室变态反应研究室/广州市过敏反应与临床免疫重点实验室,广州 510260;广州医学院第二附属医院/呼吸疾病国家重点实验室变态反应研究室/广州市过敏反应与临床免疫重点实验室,广州510260;广州医学院第二附属医院/呼吸疾病国家重点实验室变态反应研究室/广州市过敏反应与临床免疫重点实验室,广州 510260;中山大学生命科学院/有害生物控制与资源利用国家重点实验室,广州510275【正文语种】中文【中图分类】S476+11【相关文献】1.克隆、表达及纯化核糖体蛋白S6用于体外激酶活性检测 [J], 刘安玲;赵莉;贾春宏;李明2.苏云金芽孢杆菌cry2Aa操纵元蛋白对杀虫蛋白晶体形成作用的研究 [J], 姚江;张杰;陈中义;李长友;黄大昉3.二化螟钙黏蛋白CAD1的原核表达及与Cry1Ac、Cry2Aa蛋白的结合 [J], 周浩;李博;牛林;邱林;王永4.苏云金芽孢杆菌Cry2Aa型杀虫晶体蛋白的分类与构效 [J], 施茹玲; 郭幼红5.苏云金芽孢杆菌Cry2Aa型杀虫晶体蛋白的分类与构效 [J], 施茹玲;郭幼红因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

重组蛋白IFNGA在大肠杆菌中的表达与纯化

高中组 11年级生物化学3人项目重组蛋白IFNGA在大肠杆菌中的表达与纯化重组蛋白IFNGA在大肠杆菌中的表达与纯化摘要：干扰素γ（Interferon gamma，IFN-γ）是体内重要的细胞因子，能够通过调控免疫相关基因的转录协调机体的免疫反应，具有抗病毒、抗肿瘤、增强免疫力能功能。

目前对于IFN-α、IFN-β重组表达的较多，而关于IFN-γ 蛋白的纯化表达较少.因此,本研究使用PCR方法扩增IFN-γ基因，将IFN-γ基因分别插入原核表达载体pET-30构建重组表达质粒pET-30--IFN-γ，转化大肠杆菌BL21和Rosetta菌株，在IPTG诱导下表达IFN-γ，SDS-PAGE分析重组表达蛋白。

结果表明：成功构建重组表达质粒pET-30-IFN-γ；表达产物主要以包涵体形式存在；经Ni2+-NTA亲和层析纯化，获得高纯度重组蛋白。

本实验纯化的蛋白有望在今后用于医学和生物学研究中。

关键词：干扰素；IFN-γ 蛋白；大肠杆菌表达系统；重组表达；蛋白纯化；一、研究背景干扰素（IFN）是一种广谱抗病毒剂，并不直接杀伤或抑制病毒，而主要是通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制病毒（比如：乙肝病毒）的复制。

其类型分为三类，α-（白细胞）型、β-（成纤维细胞）型，γ-（淋巴细胞）型；同时还可增强自然杀伤细胞（NK细胞）、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用，并增强抗病毒能力。

干扰素是一组具有多种功能的活性蛋白质（主要是糖蛋白），是一种由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子。

它们在同种细胞上具有广谱的抗病毒、影响细胞生长，以及分化、调节免疫功能等多种生物活性。

其中，IFN-γ是体内重要的免疫调节因子，能通过与细胞表面受体结合，诱导病毒感染细胞产生多种抗病毒蛋白，使细胞内产生抗病毒状态而发挥抗病毒作用。

在诱导效应因子表达的同时，由于IFN-γ能够提高细胞表面MHC分子的表达，增强免疫活性细胞对病原体的杀伤作用，从而协同促进了机体对病毒感染细胞的杀灭，而使机体处于抗病毒状态。

双价苏云金芽孢杆菌cry基因载体构建及其在大肠杆菌中表达杀虫活性

双价苏云金芽孢杆菌cry基因载体构建及其在大肠杆菌中表达杀虫活性陈中义;李丽华;张杰;管宇;吴限;韩岚岚;黄大昉【期刊名称】《农业生物技术学报》【年(卷),期】2002(010)003【摘要】研究和利用不同苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis,Bt)杀虫蛋白之间的增效作用是构建高效遗传工程杀虫剂、预防和延缓害虫抗性的重要途径.BtCry1Ab,Cry1Ac和Cry2Aa蛋白对重要的鳞翅目农业害虫具有高毒力,质粒pHT-BSK含有能在大肠杆菌(Escherichia coli)-枯草芽孢杆菌(B.subtilis)有效表达的生物安全性标记基因卡那霉素抗性基因.将含研cry1Ab,cry1Ac和cry2Aa全长基因的BamH I/PstI、BamH I/XhoI和SmaI(BamH I)/HindⅢDNA片段与pHT-BSK 相应酶切产物连接,获得了单价cry/km1组合的重组质粒pBlue-1Ab-km1、pBlue-1Ab和pHT-2Aa;cry1Ab,cry1Ac DNA片段与pHT-2Aa相应酶切产物相连接获得了Bt双价基因/km1组合重组质粒pBlue-cry1Ab-km1-2Aa和pBlue-cry1Ac-km1-2Aa,重组质粒中所有cry基因与km1均形成特异的BamH I片段.限制酶切电泳分析和特异PCR扩增证实了重组质粒的准确连接.含有重组质粒的大肠杆菌显示了对小菜蛾(Plutellaxylostella)和玉米螟(Ostrinia furnacalis)的杀虫活性,对小菜蛾双价基因毒力高于单价基因,但对玉米螟它们之间没有明显差异.研究为进一步阐明Btcry2Aa与cry1Ab和cry1Ac之间在不同微生物细胞中的共表达及其表达产物之间的相互作用和构建双价基因杀虫工程菌株创造了条件.【总页数】6页(P272-277)【作者】陈中义;李丽华;张杰;管宇;吴限;韩岚岚;黄大昉【作者单位】中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室,北京,100094;中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室,北京,100094;中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室,北京,100094;中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室,北京,100094;中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室,北京,100094;中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室,北京,100094;中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室,北京,100094;中国农业科学院生物技术研究所,北京,100081【正文语种】中文【中图分类】S43【相关文献】1.Cry1Ac基因载体构建及其在枯草芽孢杆菌中的杀虫活性表达 [J], 刘济宁;刘贤进;余向阳;彭正强2.苏云金芽孢杆菌B-Pr-88菌株中cry2Ab4基因的表达和杀虫活性研究 [J], 李长友;张杰;宋福平;韩岚岚;李国勋;黄大昉3.苏云金芽孢杆菌沉默基因cry2Ab3在大肠杆菌中表达及杀虫活性研究 [J], 陈中义;李长友;刘加宝;张杰;黄大昉4.苏云金芽孢杆菌cry1Aa10杀虫晶体蛋白基因的克隆、序列分析以及在大肠杆菌中的表达 [J], 侯丙凯;党本元;章银梅;陈正华5.双价杀虫基因植物表达载体的构建及其在烟草中的表达 [J], 崔洪志;郭三堆因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

大肠杆菌表达纯化蛋白

大肠杆菌表达纯化蛋白大肠杆菌是一种常见的细菌，广泛应用于生物学研究中。

它具有较高的生长速度、易于培养和操作的特点，被广泛用于表达和纯化蛋白。

本文将从大肠杆菌的选择、蛋白表达、纯化等方面介绍如何利用大肠杆菌表达纯化蛋白。

一、大肠杆菌的选择在大肠杆菌中选择合适的表达宿主菌株至关重要。

一般而言，常用的宿主菌株有BL21(DE3)、Rosetta(DE3)、Origami(DE3)等。

这些菌株具有较高的蛋白表达能力和稳定性，适合用于表达多种蛋白。

根据所需表达的蛋白的特点（例如毒性、折叠状态等），选择合适的宿主菌株是必要的。

二、蛋白表达蛋白表达是指通过转化目标基因到大肠杆菌中，使其表达目标蛋白。

一般采用的方法有原核表达和真核表达两种。

原核表达是将目标基因插入表达质粒，然后转化到大肠杆菌中，利用大肠杆菌的细胞机制进行蛋白表达。

真核表达则是将目标基因转化到真核细胞中，利用真核细胞的转录和翻译系统进行蛋白表达。

在大肠杆菌中进行蛋白表达时，需要选择适当的表达质粒。

常用的表达质粒有pET系列、pGEX系列等。

这些质粒通常含有启动子、多克隆位点、选择标记等功能元件，能够实现高效的蛋白表达。

在构建表达质粒时，需要将目标基因插入适当的位点，确保目标蛋白能够被正常表达。

三、蛋白纯化蛋白表达后，需要对目标蛋白进行纯化。

常用的纯化方法包括亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等。

亲和层析是利用蛋白与亲和树脂之间的特异性相互作用进行纯化的方法。

离子交换层析则是利用蛋白与离子交换树脂之间的电荷相互作用进行纯化的方法。

凝胶过滤层析则是利用蛋白在凝胶中的分子大小差异进行纯化的方法。

在进行蛋白纯化时，需要根据目标蛋白的特性选择合适的纯化方法。

不同的纯化方法具有不同的选择条件和操作步骤，需要根据实际情况进行选择。

此外，为了提高纯化效果，还可以采用多步骤的纯化策略，如串联多个纯化方法，以获得更高纯度的蛋白。

四、蛋白质结构分析在蛋白纯化后，可以对目标蛋白进行结构分析。

两类苏云金芽胞杆菌CrylAc蛋白杀玉米螟活性的比较

两类苏云金芽胞杆菌CrylAc蛋白杀玉米螟活性的比较作者：田宇曦，刘晓艳，张志刚，等来源：《湖北农业科学》 2014年第23期田宇曦，刘晓艳，张志刚，杨自文（湖北省农业科学院／湖北省生物农药工程研究中心，武汉４３００６４）摘要：通过ＰＣＲ技术将２种不同来源的苏云金芽胞杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ，简称Ｂｔ）ｃｒｙ１Ａｃ蛋白基因克隆到大肠杆菌ｐＧＥＸ－６Ｐ－１表达载体，并转化到宿主菌ＢＬ２１，采用ＩＰＴＧ进行诱导表达，并用亲和层析法进行融合蛋白的纯化，纯化后的蛋白质进行玉米螟的室内生物测定试验。

结果表明，来自Ｂｔ菌株ＮＢＩＮ－８６６的Ｃｒｙ１Ａｃ蛋白杀玉米螟的ＬＣ５０为６５.３９μｇ／ｍＬ，来自Ｂｔ菌株ＮＢＩＣ－３８０的Ｃｒｙ１Ａｃ蛋白杀玉米螟的ＬＣ５０为１５.０７μｇ／ｍＬ，后者具有更高的杀虫活性。

氨基酸序列比对发现来自菌株ＮＢＩＣ－３８０的Ｃｒｙ１Ａｃ氨基酸序列的７１位和３９３位都为丝氨酸Ｓ，而ＮＢＩＮ－８６６的都为脯氨酸Ｐ，推测这两个位点的氨基酸的变化可能是影响毒性大小的重要因素。

关键词：苏云金芽胞杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）；Ｃｒｙ１Ａｃ；融合蛋白；玉米螟；活性比较中图分类号：Ｓ１８８中图分类号：S476文献标识码：A文章编号：0439－８114（２０14）23－5742-03DOI:10.14088/ki.issn0439-8114.2014.23.029苏云金芽胞杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ，简称Ｂｔ）是一种土壤革兰氏阳性细菌，具有较广的杀虫谱。

其主要的杀虫活性物质是杀虫晶体蛋白（Ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌｃｒｙｓｔａｌｐｒｏｔｅｉｎ，ＩＣＰ）［１］。

苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白对鳞翅目、双翅目、鞘翅目等５００多种昆虫及线虫等原生动物有毒杀活性［２］。

目前关于Ｃｒｙ蛋白中Ｃｒｙ１Ａｃ蛋白结构以及功能方面的研究，国内外均有报道，如在Ｃｒｙ１Ａｃ蛋白末端融合其他蛋白以提高杀虫活性［３－５］或者将另一种蛋白与其一起共表达来提高杀虫活性［６］。

重组蛋白IFNGA在大肠杆菌中的表达与纯化

高中组11年级生物化学3人项目重组蛋白IFNGA在大肠杆菌中的表达与纯化重组蛋白IFNGA在大肠杆菌中的表达与纯化摘要：干扰素γ（Interferon gamma，IFN-γ）是体内重要的细胞因子，能够通过调控免疫相关基因的转录协调机体的免疫反应，具有抗病毒、抗肿瘤、增强免疫力能功能。

结果表明：成功构建重组表达质粒pET-30-IFN-γ；表达产物主要以包涵体形式存在；经Ni2+-NTA亲和层析纯化，获得高纯度重组蛋白。

本实验纯化的蛋白有望在今后用于医学和生物学研究中。

干扰素是一组具有多种功能的活性蛋白质（主要是糖蛋白），是一种由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子。

它们在同种细胞上具有广谱的抗病毒、影响细胞生长，以及分化、调节免疫功能等多种生物活性。

苏云金芽孢杆菌Cry2Aa蛋白的体外表达及纯化

苏云金芽孢杆菌Cry2Aa蛋白的体外表达及纯化摘要：根据大肠杆菌密码子偏好性对苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）cry2Aa基因进行优化，并合成全长基因，将cry2Aa基因克隆到表达载体pET-44a 上，转化到大肠杆菌Rosetta中进行诱导表达，优化表达条件，采用亲和层析和SDS-PAGE胶回收纯化，Western blot鉴定回收产物。

结果表明，IPTG浓度为0.50 mmol/L、27 ℃诱导4 h时Cry2Aa蛋白表达量最高，SDS-PAGE胶回收Cry2Aa 纯化蛋白所得的产量高于亲和层析法。

关键词：苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）；Cry2Aa蛋白；表达；纯化苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是一种能够产生多种杀虫晶体蛋白（Cry）的土壤细菌[1，2]，Bt的cry基因已成功转入很多主要农作物（Bt 农作物），包括玉米、棉花、西红柿等，使它们具有抗虫特性[3-6]。

Cry1类杀虫晶体蛋白对鳞翅目害虫具有特异毒性，在微生物和植物基因工程中得到了广泛的应用，但其存在着杀虫谱狭窄、昆虫产生抗药性等问题[7，8]。

Cry2类蛋白在结构和杀虫机制上不同于Cry1类，如Cry2Aa既对鳞翅目害虫有毒性又能杀害双翅目害虫[9]。

研究显示转cry2Aa基因的鹰嘴豆对豆荚蛀虫有较强的毒性[10]，而转cry2Aa基因的水稻对其传粉昆虫如中华通草蛉无危害性[11]。

本研究合成密码子优化的cry2Aa基因，体外重组表达Cry2Aa蛋白并进行优化，以期为进一步求证Cry2Aa的安全性奠定基础。

1 材料与方法1.1 材料苏云金芽孢杆菌Cry2Aa蛋白序列由华中农业大学林拥军教授提供，与NCBI （http：//）中相关序列（M31738）仅有少数氨基酸不同。

pET-44a 质粒、大肠杆菌TOP10和Rosetta菌株由广州市过敏反应与临床免疫重点实验室保存；Strep Trap HP预装柱和低分子量蛋白Marker购自GE公司；StrepⅡ标签抗体购于Merck公司。

苏云金芽胞杆菌cry2基因的克隆及表达

苏云金芽胞杆菌cry2基因的克隆及表达1黄天培，潘洁茹，黄张敏，陈志，庄浩瀚，关雄福建农林大学生物农药与化学生物学教育部重点实验室，福州 (350002)E-mail：guanxfafu@摘要：WB9是我国分离自武夷山的对多种重要农业害虫具有高毒力的苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)菌株，经PCR-RFLP鉴定含有cry2Ac基因。

根据cry2基因序列设计引物，以WB9质粒为模板扩增cry2Ac全长基因，与大肠杆菌(Escherichia coli)克隆载体pMD18-T连接获得含有cry2Ac全长基因的重组质粒pMD2Ac并测序。

该基因在GenBank上登录号为DQ361267。

通过亚克隆方法将cry2Ac基因插入穿梭表达载体pHT315获得重组表达质粒pHT2Ac，将其转化大肠杆菌SCS110和Bt无晶体突变株HD73 Cry-，得到的工程菌能正常表达70 kD蛋白。

关键词：苏云金芽胞杆菌；cry2Ac基因；克隆；表达中图分类号：S476，Q7851. 引言苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，简称Bt）是一种天然存在的昆虫病原细菌，对无脊椎动物中的4个门和节肢动物门中16个目的3000多种害虫有活性[1-3]。

Bt主要杀虫活性物质为杀虫晶体蛋白(insecticidal crystal proteins, ICPs)，分为Cry和Cyt两类[4-6]。

随着研究的深入，cry1基因在杀虫工程菌和转基因抗虫植物中已得到广泛的应用[7]。

但是，在实验室条件下已经发现了多种昆虫对Bt亚种或单个毒素可以产生抗性，在小菜蛾的田间种群中也已经出现了具有抗性的个体[8]。

因此，筛选和克隆新的毒力高、杀虫谱广、不易产生抗性和交互抗性的cry基因和基因组合是解决这些潜在危机的有效途径之一[7, 9]。

cry2基因在Bt中分布较广泛[5]。

其中，Cry2Aa对鳞翅目、双翅目害虫及直翅目的黄胫小车蝗具有杀虫活性[9-12]；cry2Ab为沉默基因，但在国内外都已实现了有效表达，并发现Cry2Ab对棉铃虫初孵幼虫具有高毒力，能明显抑制二化螟二龄幼虫生长[11-13]； cry2Ac和cry2Ad在Bt中不常见[14]。

重组O_GLcNAc糖基转移酶在昆虫细胞中的表达和纯化

南　通　医　学　院　学　报A cta A cadem iae M edicinae N antong2003∶23(1)[文章编号]1000-2057(2003)01-0016-04重组O-GLcNAc糖基转移酶在昆虫细胞中的表达和纯化钱　慰 ,刘　飞,1龚成新,金淑仪(南通医学院生物化学教研室,南通226001;1美国纽约州立基础研究所)[摘　要]　蛋白质的O-GlcN Ac糖基化修饰是一种细胞核蛋白与细胞浆蛋白的蛋白质翻译后修饰。

不同于膜蛋白和分泌蛋白的糖基化修饰,与蛋白质磷酸化修饰相似。

催化蛋白质O-G lcN A c糖基转移酶(O GT)已被克隆。

用Hi5昆虫细胞系统表达并纯化了具有活性的重组OG T。

在Hi5昆虫细胞中表达的鼠肝O GT带有一His6标记片段。

经镍离子螯合柱纯化后,其比活性达到0.88nmol・min-1・mg-1O GT。

因此本研究为进一步研究蛋白O-GlcNA c糖基化修饰提供重要资源。

[关键词]　蛋白质;O-位N-乙酰葡萄糖胺糖基化修饰;O-位N-乙酰葡萄糖胺糖基转移酶[中图分类号]　Q555+.4　[文献标识码]　AThe expression and purification of rewmbinant O-GLcNAc transferase in insect cells QI A O W ei,L I U Fei,GON G Cheng x in,et al (N ant ong M edical Colleg e,N anto ng226001)[Abstract]　O-GlcN Acy lation of pro teins is a r ecently disco ver ed post-tr anslational mo dification o f nuclear and cy-toplasmic pro teins.T his modificat ion is natur ally similar to pr otein pho spho ry lation rather t han to classical pro teing ly co sylatio n of membra ne and secr eted pr oteins.T he enzy me that catalyzes pro tein O-GlcNA cylation has beenclo ned and named a s O-GlcN A c t ransferase(OG T).In this st udy,r ecombinant OG T has been prepar ed in Hi5insect cells.R eco mbinant r at liv er O GT fused w it h His6t ag was a lso expr essed in Hi5cells a nd purified by Hitr ap N i+-chelating chr omato gr aphy.T he elut ed O GT had a specific enzy matic act ivity of0.88nmo l・min-1・mg-1O GT.Hence,these st udies pro vided impor tant rea gents for further investigat ion o f pr ot ein O-G lcN A cy latio n.[Key words]　P ro tein O-GlcNA cylation;O-GL cN A C t ransfera se 蛋白质的O位N-乙酰葡萄糖胺修饰(O-Glc-NAc糖基化修饰)是一种新近发现的、广泛发生在细胞质与细胞核内的、动态的蛋白质翻译后修饰方式。

大肠杆菌中表达CrylC基因及其重组表达产物的纯化及复性

大肠杆菌中表达CrylC基因及其重组表达产物的纯化及复性曹思硕;许文涛;冉文君;梁立兴;贺晓云;罗云波;元延芳;黄昆仑【期刊名称】《食品科学》【年(卷),期】2011(000)007【摘要】通过PCR方法将苏云金芽孢杆菌CrylC基因从原始质粒中克隆出来.由于CrylC基因携带了大量大肠杆菌稀有密码子,因此用PCR方法对其前86个密码子进行修改,以提高其在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达量.CrylC蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中以包涵体形式大量表达,将包涵体用8mol/L尿素溶解并用His Trap(TM)FF凝胶柱纯化.所得纯化蛋白在复性缓冲液中复性折叠,最终得到可溶并有生物活性(由三化螟活性实验验证)的蛋白.CrylC蛋白纯度可达99.2%.【总页数】5页(P211-215)【作者】曹思硕;许文涛;冉文君;梁立兴;贺晓云;罗云波;元延芳;黄昆仑【作者单位】中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京,100083;中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京,100083;农业部转基因生物食用安全监督检验测试中心,北京,北京,100083;中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京,100083;中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京,100083;农业部转基因生物食用安全监督检验测试中心,北京,北京,100083;中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京,100083;农业部转基因生物食用安全监督检验测试中心,北京,北京,100083;中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京,100083;农业部转基因生物食用安全监督检验测试中心,北京,北京,100083【正文语种】中文【中图分类】Q344.13【相关文献】1.PBP1基因在大肠杆菌中的表达及其表达产物的纯化 [J], 曾青兰;王志勇2.水稻密码子优化的cry2A*基因在大肠杆菌中的表达及其表达产物的纯化 [J], 秦伟;黄昆仑;贺晓云;李欣;许文涛;林希瑾;罗云波3.恶性疟原虫顶端膜抗原-1(P.f AMA-1)基因在大肠杆菌中的表达及表达产物的纯化 [J], 李王旬;薛采芳;王宪锋;刘忠湘;甄荣芬4.旋毛虫Ts87基因在大肠杆菌中的表达及表达产物的纯化 [J], 杨静;诸欣平;杨雅平;詹斌;冯建军;Hotez Peter5.中国明对虾过氧化物还原酶基因在大肠杆菌中的重组表达、产物纯化及活性测定[J], 张庆利;李富花;张继泉;蒋昊;相建海因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

mRuby2在原核细胞中的表达及纯化

mRuby2在原核细胞中的表达及纯化余瑛;刘志云;余磊;鲁秀敏【摘要】The mRuby2 gene was amplified by PCR method and then inserted into prokaryotic expression vector pET30a(+).The recombinant plasmid pET30a(+)-mRuby2 was transferred into BL21 (DE3)to produce recombinant mRuby2 protein.The expression level of recombinant mRuby2 protein was detected by observation of red fluorescence under the fluorescence microscope and SDS-PAGE.The Nickel affinity chromatography was employed to purify the target protein.The results show that the color of fermented liquid was turning to orange red after IPTG inducting,and the precipitated bacteria were deep pink.Under the fluorescent microscope,the bacteria were observed to emit the bright red fluorescence.The level of expression of recombinant protein reached peak value after inducing 5 h.By the Nickel affinity chromatography technology,the recombinant proteins were isolated with purity more than 80%.Conclusion: mRuby2 gene could successfully express in prokaryotic system.The recombinant mRuby2 proteins were high brightness and visible,which was convenient to track the process of experiment.As an excellent experiment resource,mRuby2 gene should be applied to the biochemistry and molecular biology experiment teaching.It would be helpful in students'observation of the experimental phenomenon and better understanding the experimental principle.%采用PCR技术扩增mRuby2,将其插入原核表达载体pET30a(+)中,用pET30a (+)-mRuby2转化BL21 (DE3)并诱导重组蛋白表达,用荧光显微镜及SDS-PAGE 观察、检测目标蛋白的表达情况,以 Ni 亲和层析技术纯化重组蛋白.结果表明:构建的重组表达菌株经IPTG诱导后,发酵液颜色随诱导时间延长逐渐转为橙红,离心后的沉淀菌体为深粉红色,在荧光显微镜下,菌体发出明亮的红色荧光.SDS-PAGE 检测发现,IPTG诱导5 h,重组蛋白表达量达到峰值.采用Ni螯合亲和层析技术从发酵菌体中分离出纯度大于80%的重组蛋白.由此可见:采用DNA重组技术能在原核系统中成功表达mRuby2 编码的荧光蛋白,该重组蛋白亮度高、可视性好,能直观呈现实验结果,便于观察相关实验现象、理解并掌握实验原理,非常适合于生化、分子生物学实验教学.【期刊名称】《重庆理工大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2018(032)006【总页数】6页(P128-133)【关键词】mRuby2;荧光蛋白;重组;表达;纯化【作者】余瑛;刘志云;余磊;鲁秀敏【作者单位】重庆理工大学药学与生物工程学院,重庆 400054;重庆理工大学药学与生物工程学院,重庆 400054;重庆理工大学药学与生物工程学院,重庆 400054;重庆理工大学药学与生物工程学院,重庆 400054【正文语种】中文【中图分类】G64蛋白质是现代分子生物学中最重要的研究对象之一。

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ＢａｎｒＨＩ，ｔｈｕｓｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇｔｈｅｒｅｃｉｏｎｐｌａｓｍｉｄｐＥＴ．３０ａ（＋）／Ｃｒｙ２Ａ．Ｔｈｅ
Ｃｈｉｎａ；ＳｈａｎｇｈａｉＯｃｅａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ２０１３０６，Ｃｈｉｎａ；。ＳｈａｎｇｈａｉＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，
Ｓｈａｎｇｈａｉ２００２３４，Ｃｈｉｎａ；ＳｈａｎｇｈａｉＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＧｅｎｅｔｉｃｓａｎｄＢｒｅｅｄｉｎｇ，
上海农业学报
２０１３，２９（５）：１０—１４
ＡｃｔａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｅＳｈａｎｇｈａｉ
文章编号：１０００ — ３９２４（２叭３）０５ — ０１０ — ０５
Ｃｒｙ２Ａ杀虫蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化
ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌｐｒｏｔｅｉｎｉｎＥ．ｃｏｌｉ
ＹＡＮＧＱｉ～，ＨＡＮＦａｎｇ — ｔｉｎｇ～，ＬＩＵＱｉ — ｗｅｎ～，ＪＩＡＮＧＬｉｎｇ－ｘｉ一，ＴＡＮＦｕ — ｒｏｎｇ一，
关键词：转基因水稻；Ｃｒｙ２Ａ杀虫蛋白；包涵体；表达；纯化
中图分类号：Ｑ７８文献标识码：Ａ
Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉ０ｎｏｆＢａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓＣｒｙ２Ａ
ＷＵＸｉａｏ一，ＺＨＡＯＫａｉ一，ＷＡＮＧＪｉｎ－ｂｉｎ一，ＴＡＮＧＸｕｅ — ｍｉｎｇ ’
（ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＳｈａｎｇｈａｉＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｈａｎｇｈａｉ２０１１０６，
杨奇。，韩芳婷。，刘启文。，蒋玲曦，谭芙蓉，吴潇，
赵凯，王金斌，唐雪明
（上海市农业科学院生物技术研究所，上海２０１１０６；上海海洋大学，上海２０１３０６；。上海师范大学，上海２００２３４４上海市农业遗传育种重点实验室，上海２０１１０６）摘要：通过ＰＣＲ方法从克隆载体上扩增转基因水稻中的抗虫基因ｃｒｙ２Ａ，经限制性内切酶ＥｃｏＲＩ和
ＢａｍＨＩ双酶切定向插入到原核表达载体ｐＥＴ．３０ａ（＋）中，成功构建了蛋白表达载体ｐＥＴ．３０ａ（＋）／Ｃｒｙ２Ａ，并转人大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中进行诱导表达。通过对其表达条件进行优化，发现在ＩＰＴＧ浓度为０．４ｍｍｏｌ／Ｌ、诱导时间为６ｈ、诱导温度为３Ｏ℃ 的表达条件下，目的蛋白表达量最高，大部分以包涵体形式表达。将包涵体裂解并用Ｎｉ－ＮＴＡ亲和柱纯化，所得纯化蛋白在复性缓冲液中复性，最终得到有活性的高纯度目的蛋白。
Ｓｈａｎｇｈａｉ２０１１Ｏ６，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅｉｎｓｅｃｔ．ｒｅｓｉｓｔｉｎｇｃｒｙ２Ａｇｅｎｅｏｆｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｒｉｃｅｆｒｏｍｔｈｅｃｌｏｎｉｎｇｖｅｃｔｏｒｗａｓａｍｐｌｉｆｉｅｄ
ｂｙｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ），ａｎｄｔｈｅｎｔｈｅＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆｃｒｙ２ＡｇｅｎｅｗｅｒｅｉｎｓｅｒｔｅｄｉｎｔｏｔｈｅｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｐＥＴ一３０ａ（＋）ｖｉａｄｉｇｅｓｔｉｏｎｏｆｂｏｔｈｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓＥｃｏＲＩａｎｄ