HBx蛋白羧基端缺失对肝癌细胞生物学行为的影响_刘晓红

《癌症》ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＣａｎｃｅｒ，２００５，２４（１０）：１２１３－１２１９・基础研究・第二军医大学长海医院病理科，上海２００４３３ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＰａｔｈｏｌｏｇｙ，ＴｈｅＳｅｃｏｎｄＭｉｌｉｔａｒｙＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ，２００４３３，Ｐ．Ｒ．Ｃｈｉｎａ通讯作者：朱明华Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅｔｏ：ＺＨＵＭｉｎｇ－ＨｕａＴｅｌ：８６－２１－２５０７４６０４Ｆａｘ：８６－２１－２５０７４６０４Ｅ－ｍａｉｌ：ｍｈｚｈｕ２０００＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ基金项目：国家自然科学基金项目（Ｎｏ．３００７０３４４，Ｎｏ．３００７０８３９）Ｇｒａｎｔ：ＮａｔｉｏｎａｌＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＦｏｕｎｄａｔｉｏｎｏｆＣｈｉｎａ（Ｎｏ．３００７０３４４，Ｎｏ．３００７０８３９）收稿日期：２００４－１１－０９修回日期：２００５－０１－１８ＨＢｘ蛋白羧基端缺失对肝癌细胞生物学行为的影响刘晓红，朱明华，曹晓哲，郑建明，陈颖ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＥｆｆｅｃｔｓｏｆＣＯＯＨ－ｔｅｒｍｉｎａｌＡｍｉｎｏＡｃｉｄＤｅｌｅｔｉｏｎｓｏｆＨｅｐａｔｉｔｉｓＢＶｉｒｕｓＸＰｒｏｔｅｉｎｏｎＨｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒＣａｒｃｉｎｏｍａＣｅｌｌＬｉｎｅＨｕｈ７ＬＩＵＸｉａｏ－Ｈｏｎｇ，ＺＨＵＭｉｎｇ－Ｈｕａ，ＣＡＯＸｉａｏ－Ｚｈｅ，ＺＨＥＮＧＪｉａｎ－Ｍｉｎｇ，ＣＨＥＮＹｉｎｇ［ＡＢＳＴＲＡＣＴ］ＢＡＣＫＧＲＯＵＮＤ＆ＯＢＪＥＣＴＩＶＥ：ＴｈｅＣＯＯＨ－ｔｅｒｍｉｎａｌａｍｉｎｏａｃｉｄｄｅｌｅｔｉｏｎｓｏｆｈｅｐａｔｉｔｉｓＢｖｉｒｕｓＸｐｒｏｔｅｉｎ（ＨＢｘ）ｃｏｍｍｏｎｌｙｅｘｉｓｔｉｎｈｕｍａｎｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｃａｒｃｉｎｏｍａ（ＨＣＣ）．ＴｈｉｓｓｔｕｄｙｗａｓｄｅｓｉｇｎｅｄｔｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｅｆｆｅｃｔｓｏｆｔｒｕｎｃａｔｅｄＨＢｘａｎｄｗｉｌｄｔｙｐｅＨＢｘｏｎＨＣＣｃｅｌｌｌｉｎｅＨｕｈ７．ＭＥＴＨＯＤＳ：ＴｈｅｍｕｔａｎｔｓｏｆＨＢｘｗｉｔｈ１０，２０，３０，ｏｒ４０ａｍｉｎｏａｃｉｄｓｄｅｌｅｔｉｏｎａｔＣＯＯＨ－ｔｅｒｍｉｎａｌ（ＨＢｘ３′－１０，－２０，－３０，－４０），ｏｒ３７ａｍｉｎｏａｃｉｄｓｄｅｌｅｔｉｏｎａｔｔｈｅｍｉｄｄｌｅ（ＨＢｘ－ＸＭＲ）ｗｅｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ．ＴｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｔｒｕｎｃａｔｅｄＨＢｘａｎｄｗｉｌｄｔｙｐｅＨＢｘｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｓｗｅｒｅｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｉｎｔｏＨｕｈ７ｃｅｌｌｓ．ＴｈｅｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｅｘｏｇｅｎｏｕｓｖｅｃｔｏｒＤＮＡｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＮｅｏｇｅｎｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）．ＴｈｅｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｐｏｓｉｔｉｖｅｃｌｏｎｅｓｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄｂｙＭＴＴａｓｓａｙ，ｃｏｌｏｎｙｆｏｒｍａｔｉｏｎａｓｓａｙ，ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ（ＦＣＭ），ａｎｄｘｅｎｏｇｒａｆｔｉｎｎｕｄｅｍｉｃｅ．ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＨＢｘ３′－１０，ＨＢｘ３′－２０，ＨＢｘ３′－３０，ＨＢｘ３′－４０，ＨＢｘ－ＸＭＲａｎｄＨＢｘｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉ－ｓｔｒｙ．ＲＥＳＵＬＴＳ：Ｈｕｈ７ｃｅｌｌｓｇｒｅｗｆａｓｔｅｒｉｎＨＢｘ３′－２０ａｎｄＨＢｘ３′－４０ｇｒｏｕｐｓｔｈａｎｉｎＨＢｘ３′－３０ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０５）．ＴｈｅｃｏｌｏｎｙｆｏｒｍａｔｉｏｎｒａｔｅｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｉｎＨＢｘ３′－２０ａｎｄＨＢｘ３′－４０ｇｒｏｕｐｓｔｈａｎｉｎＨＢｘ３′－３０ａｎｄｐｃＤＮＡ３ｇｒｏｕｐｓ［（１７．３４±２．７７）％ａｎｄ（１８．３６±２．６１）％ｖｓ．（７．３１±１．４４）％ａｎｄ（６．８７±２．３８）％，Ｐ＜０．０５］．ＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｗｉｌｄｔｙｐｅＨＢｘ，ＨＢｘ３′－２０ａｎｄＨＢｘ３′－４０ｐｒｏｍｏｔｅｄｍｏｒｅｃｅｌｌｓｆｒｏｍＧ１ｐｈａｓｅｉｎｔｏＳｐｈａｓｅｉｎｃｅｌｌｃｙｃｌｅ［（３６．９６±１．８２）％ｖｓ．（４６．２０±３．２３）％ａｎｄ（５３．９９±４．０２）％ｉｎＳｐｈａｓｅ，Ｐ＜０．０５］，ｗｈｉｌｅＨＢｘ３′－１０ａｎｄＨＢｘ３′－３０ｂｌｏｃｋｅｄｔｈｅｐｒｏｃｅｄｕｒｅｉｎＧ１ｐｈａｓｅ［（３２．３０±４．３２）％ａｎｄ（３０．３４±１．４７）％ｉｎＳｐｈａｓｅ］；ｎｏｏｂｖｉｏｕｓｃｈａｎｇｅｗａｓｆｏｕｎｄｂｅｔｗｅｅｎｗｉｄｅｔｙｐｅＨＢｘｇｒｏｕｐａｎｄｐｃＤＮＡ３ｇｒｏｕｐ［（３８．６０±１．１５）％ｉｎＳｐｈａｓｅ］．ＴｈｅｖｏｌｕｍｅｏｆｘｅｎｏｇｒａｆｔｔｕｍｏｒｉｎｎｕｄｅｍｉｃｅｗａｓｏｂｖｉｏｕｓｌｙｌａｒｇｅｒｉｎＨＢｘ３′－４０ｇｒｏｕｐｔｈａｎｉｎＨＢｘ３′－３０，ｗｉｌｄｔｙｐｅＨＢｘ，ａｎｄｐｃＤＮＡ３ｇｒｏｕｐｓ［（３．１９±０．３４）ｃｍ３ｖｓ．（１．５８±０．２７）ｃｍ３，（１．７５±０．１５）ｃｍ３，ａｎｄ（１．６７±０．１２）ｃｍ３］；ｔｈｅｔｕｍｏｒｗｅｉｇｈｔｓｈｏｗｅｄｔｈｅｓａｍｅｔｒｅｎｄａｍｏｎｇｔｈｅｇｒｏｕｐｓ．ＣＯＮＣＬＵＳＩＯＮＳ：ＣｏｍｐａｒｅｗｉｔｈｗｉｄｅｔｙｐｅＨＢｘ，ＨＢｘ３′－２０ａｎｄＨＢｘ３′－４０ｃｏｕｌｄｐｒｏｍｏｔｅｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆＨｕｈ７ｃｅｌｌｓ，ｂｕｔＨＢｘ３′－３０ｈａｓｔｈｅｃｏｎｔｒａｒｙｅｆｆｅｃｔ．ＨＢｘｍｕｔａｎｔｓｍｉｇｈｔｐｌａｙａｒｏｌｅｉｎｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆＨＣＣｔｈｒｏｕｇｈｍｏｄｉｆｙｉｎｇｔｈｅｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｆｕｎｃｔｉｏｎｓｏｆＨＢｘ．ＫＥＹＷＯＲＤＳ：Ｌｉｖｅｒｎｅｏｐｌａｓｍｓ；Ｈｕｈ７ｃｅｌｌｌｉｎｅ；ＨｅｐａｔｉｔｉｓＢｖｉｒｕｓＸｐｒｏｔｅｉｎ；Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ，ｇｅｎｅｔｉｃ【摘要】背景与目的：肝癌组织内普遍存在着截短表达的ＨＢｘ蛋白，这种蛋白可能与肝癌的发生有关，本研究探讨截短表达的ＨＢｘ蛋白和野生型ＨＢｘ对人肝癌细胞Ｈｕｈ７生物学行为的影响。

方法：脂质体法介导ＨＢｘ突变体和野生型ＨＢｘ重组体转染ＨＢＶ（－）的Ｈｕｈ７细胞。

ＰＣＲ方法扩增Ｎｅｏ基因检测质粒ＤＮＡ片段插入。

通过ＭＴＴ、平板克隆形成实验、流式细胞仪和裸鼠成瘤实验检测稳定转染细胞的生物学活性。

结果：ＨＢｘ３′－２０和ＨＢｘ３′－４０组细胞生长速度较ＨＢｘ３′－３０组明显１２１３刘晓红，等．ＨＢｘ蛋白羧基端缺失对肝癌细胞生物学行为的影响Ｘ基因是一种仅存在于嗜肝乙型肝炎病毒（ｈｅｐａｔｉｔｉｓＢｖｉｒｕｓ，ＨＢＶ）的基因，其编码的Ｘ蛋白不直接结合ＤＮＡ双链，而是通过蛋白－蛋白间的相互作用在ＨＢＶ复制和表达中起重要作用，并广泛参与宿主细胞的基因表达、反式激活和细胞信号转导过程。

日益增多的证据表明它是引起肝癌发生的直接原因，但具体机制不明。

目前一些实验研究的结论倾向于ＨＢｘ具有抗细胞增殖和促细胞凋亡的作用，由于肝癌组织中可能普遍存在着异质的ＨＢｘ碳端缺失突变体，表达截短的ＨＢｘ蛋白（缺失２ａａ～７０ａａ不等），导致ＨＢｘ功能发生变化并极可能参与肝细胞的恶性转化［１～５］。

为此，我们构建了ＨＢｘ碳端分别缺失了１０、２０、３０、４０以及中间３７个氨基酸的质粒，该区域涵盖了已报道的ＨＣＣ中ＨＢｘ蛋白自然发生截短突变的主要位点，并且涉及ＨＢｘ的反式激活域、ＨＢＶ的基本核心启动子和直接重复序列Ⅱ，及与抑癌基因ｐ５３和线粒体的结合位点。

我们通过基因转染和一系列生物学活性的检测，了解碳端缺失的ＨＢｘ突变体对肝癌细胞生物学活性的影响。

１材料与方法１．１实验材料人肝癌细胞株Ｈｕｈ７为本室保存。

脂质体ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２０００转染试剂盒购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；Ｇ４１８、胎牛血清和ＤＭＥＭ培养基购自ＧｉｂｃｏＢＲＬ公司；Ａｎｎｅｘｉｎ－ＶＦＩＴＣ凋亡检测试剂盒购自晶美公司；兔抗人乙肝病毒ＨＢｘ蛋白多克隆抗体由美国Ｆｅｉｔｅｌｓｏｎ教授惠赠［７］；过氧化物酶标记的鼠抗兔ＩｇＧ和ＥＣＬ检测系统为ＳａｎｔａＣｒｕｚ公司产品；ＢＣＡ试剂盒购自Ｂｅｙｏｔｉｍｅ公司；ＥｎＶｉｓｉｏｎＳｙｓｔｅｍＫｉｔ购自ＤＡＫＯ公司；限制性内切酶均为ＴａＫａＲａ公司产品。

ＳＰＦ级４周龄雄性ＢＡＬＢ／ｃ（ＳＣＸＫ２００３－０００３）裸小鼠由中国科学院上海实验动物中心提供，动物实验在ＳＰＦ级动物实验室进行。

１．２方法１．２．１重组表达质粒的构建以ＰＴＫＨＨ２质粒（ＨＢＶａｄｗ型）为ＨＢｘ模板进行ＰＣＲ扩增，ＰＣＲ产物克隆入ｐｃＤＮＡ３．０载体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。

通过转化ＪＭ１０９大肠杆菌，扩增，抽提质粒，经限制性内切酶与ＤＮＡ序列测定重组质粒。

构建的ＨＢｘ缺失突变体的引物序列见表１。

１．２．２细胞培养与转染Ｈｕｈ７细胞在５％ＣＯ２、３７℃条件下培养于含１０％胎牛血清的ＤＭＥＭ中，以每孔１×１０５个接种于６孔板，２４ｈ后分别取１μｇ的ｐｃＤＮＡ３ＨＢｘ、ｐｃＤＮＡ３ＨＢｘ３′－１０、ｐｃＤＮＡ３ＨＢｘ３′－２０、ｐｃＤＮＡ３ＨＢｘ３′－３０、ｐｃＤＮＡ３ＨＢｘ３′－４０、ｐｃＤＮＡ３ＨＢｘ３′－ＸＭＲ和ｐｃＤＮＡ３空载体质粒以Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ法转染增快（Ｐ＜０．０５）；ＨＢｘ３′－２０组［（１７．３４±２．７７）％］和ＨＢｘ３′－４０组［（１８．３６±２．６１）％］克隆形成率明显较ＨＢｘ３′－３０组［（７．３１±１．４４）％］和ｐｃＤＮＡ３组［（６．８７±２．３８）％］高（Ｐ＜０．０５）。

细胞周期检测结果显示，对比于野生型ＨＢｘ组，ＨＢｘ３′－２０组和ＨＢｘ３′－４０组蛋白的表达能加速Ｈｕｈ７细胞由Ｇ０／Ｇ１期到Ｓ期的进程［Ｓ期：（３６．９６±１．８２）％ｖｓ．（４６．２０±３．２３）％，（５３．９９±４．０２）％，Ｐ＜０．０５］，相反，ＨＢｘ３′－１０和ＨＢｘ３′－３０组则出现Ｇ１期阻滞，而ＨＢｘ组与ｐｃＤＮＡ３空载体组间［（３８．６０±１．１５）％］在Ｓ期无明显变化。

裸鼠成瘤实验显示，ＨＢｘ３′－４０组［（３．１９±０．３４）ｃｍ３］成瘤体积明显大于ＨＢｘ３′－３０组［（１．５８±０．２７）ｃｍ３］、ＨＢｘ组［（１．７５±０．１５）ｃｍ３］和ｐｃＤＮＡ３组［（１．６７±０．１２）ｃｍ３］，各组瘤重存在显著性差异（Ｐ＜０．０１）。