流式细胞术FlowCytometryFCM
细菌学检验-13-流式细胞技术
液流系统（流动室、液流驱动系统）示意图
流动室
鞘液
进样孔
喷嘴
荧光信号
Fluorescence signals
激光束
Focused laser beam
FCM的液流系统（如 何形成单个细胞流）
样本管
鞘液管
液流中心由单列匀速运动颗粒组成的液柱
（2）光学系统：激光光源、光收集系统
激光光源：气冷式氩离子激光器 分色反光镜：反射较长波长的光，通过较
BD LSR
FACS Vantage DiVa
科研型（大型机）
特点： 多数字化 适用用各类细胞分选 4路分选
FACSAria
科研型
特点： 分辨率高
选配多种波长和 类型激光器
可把感兴趣细胞 分选到特定培养孔 或板上（4路和24 孔板）
适用于高速分选 和多色分析
（4）分选系统
配有分选装置，分选带有某 种特性的细胞
单波长、高强度、高稳定性
多采用氩离子激光器或氦氖激光器
一般选配2~4根激光，488nm 、633nm和 355nm、407nmUV激光
最多检测13个荧光参数
光收集系统：滤光片
Longpass
460 500 540
Shortpass
460 500 540
Bandpass
460 500 540
• 选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的 多个不同特征。
• 线性放大器和对数放大器
流式细胞术的特点
流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及 细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下， 通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种 信号对细胞进行定量分析或纯化分选。
细胞不被破坏，单个细胞，测量快速、大量、多参数、 准确、灵敏、定量
FCM(流式细胞术检测)原理及临床应用
流式细胞术(flow cytometry FCM)是利用流式细 胞仪对单个生物颗粒(红细胞、白细胞、各类组织细 胞、血小板、微生物等)以及人工合成微球的物理和 生物学特性进行多参数定量分析，并能对特定细胞 群体加以分选的分析技术。
FCM的工作原理
流式细胞仪组成：
1.液流系统 2.光学系统 3.数据处理系统
双标记或多标记分析：目前使用的流式细胞仪 能用一个激光束激发检测三色甚至四色荧光信 号。检测时需注意荧光补偿。
常用免疫荧光染料组合
荧光染料 FITC+PE
激发波长 （nm）
488
发射波长（nm） 525、575
颜色 绿色、橙色
FITC+PeCy5
488
525、675
绿色、红色
FITC+ECD
488
实体瘤以多倍体居多；
G0 期：DNA 合成静止期 G1 期：DNA 合成前期 S 期： DNA 合成期 G2 期：DNA 合成后期 M 期： 细胞分裂期
DNA 倍体 2N 2N
2N-4N 4N 4N
DNA非2倍体出现是鉴别良性与恶性肿瘤的特异性指 标:
良性肿瘤和正常组织良性增生不出现DNA非2倍体细 胞而恶性肿瘤常可出现异倍体细胞；
过去认为 FCM测定残存白血病细胞不可靠， 因为现用的 McAb不能鉴别正常血细胞与白血 病细胞。虽然至今尚未发现白血病细胞特异抗 原，但近来有人提出根据白血病细胞的以下特 征， FCM检测的敏感度可明显提高
白血病细胞的某些抗原表达量明显高于相应 的正常血细胞
如小儿ALL，其CDl0+细胞的荧光强度可 高达3-4个对数值，而其 CD45则为弱阳性或 阴性。
525、625
流式细胞仪(FlowCytometer)基本原理汇总.
散射光的作用
实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组合，区分不同的细 胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。
红细胞、死细胞和碎片
粒细胞 单核细胞 淋巴细胞
通过FSC/SSC散点图，gate出目标细胞进行分析。
1、流式细胞术简介
流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是以流式细胞仪为检 测手段的一项能快速、精确的对单个细胞(或生物学颗粒)的 理化特性进行多参数定量分析和分选的技术。
流式细胞仪（Flow Cytometer ）是集细胞与分子生物学、 流体力学、激光技术、光电子技术、计算机技术、细胞荧光 化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种高科技仪器。
FL1
5% 默认阈值
32% 升高阈值后
荧光素和荧光信号
荧光： 荧光素的电子吸收光的能量由低能态转变为高能态， 再回到低能态时释放出的光。
＜ 激发波长
Excitation wavelength
发射波长(荧光波长) Emission wavelength
常用荧光素
<499nm ：蓝色荧光（Blue）；
流式细胞术的特点
检测对象：单细胞悬液或生物颗粒； 检测参数：多参数； 检测特点：单细胞水平分析； 检测速度：高速，最高达上万个细胞/秒； 检测结果：精度高、准确性好； 可对目标细胞进行分选；
2、流式细胞术光信号检测
光信号的类型 散射光信号：与标记荧光素无关，
是细胞的固有参数。 前向散射光(forward scatter, FSC)； 侧向散射光(side scatter, SSC)。
流式细胞术简介 一、流式细胞术发展简史 流式细胞术(Flow Cytometry
流式细胞术简介一、流式细胞术发展简史流式细胞术（Flow Cytometry, FCM）是一种可以对细胞或亚细胞结构进行快速测量的新型分析技术和分选技术。
其特点是：①测量速度快，最快可在1秒种内计测数万个细胞；②可进行多参数测量，可以对同一个细胞做有关物理、化学特性的多参数测量，并具有明显的统计学意义；③是一门综合性的高科技方法，它综合了激光技术、计算机技术、流体力学、细胞化学、图像技术等从多领域的知识和成果；④既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。
概要说来，流式细胞术主要包括了样品的液流技术、细胞的分选和计数技术，以及数据的采集和分析技术等。
FCM目前发展的水平凝聚了半个世纪以来人们在这方面的心血和成果。
1934年，Moldavan1首次提出了使悬浮的单个血红细胞等流过玻璃毛细管，在亮视野下用显微镜进行计数，并用光电记录装置计测的设想，在此之前，人们还习惯于测量静止的细胞，因为要使单个细胞顺次流过狭窄管道容易造成较大的细胞和细胞团块的淤阻。
1953年Crosland –Taylor根据雷诺对牛顿流体在圆形管中流动规律的研究认识到：管中轴线流过的鞘液流速越快，载物通过的能力越强，并具有较强的流体动力聚集作用。
于是设计了一个流动室，使待分析的细胞悬浮液都集聚在圆管轴线附近流过，外层包围着鞘液；细胞悬浮液和鞘液都在作层液。
这就奠定了现代流式细胞术中的液流技术基础。
1956年，Coulter在多年研究的基础上利用Coulter效应生产了Coulter 计数器。
其基本原理是：使细胞通过一个小孔，只在细胞与悬浮的介质之间存在着导电性上的差异，便会影响小孔道的电阻特性，从而形成电脉冲信号，测量电脉冲的强度和个数则可获得有关细胞大小和数目方面的信息。
1967年Holm等设计了通过汞弧光灯激发荧光染色的细胞，再由光电检测设备计数的装置。
1973年Steinkamp设计了一种利用激光激发双色荧光色素标记的细胞，既能分析计数，又能进行细胞分选的装置。
流式细胞仪
Th1细胞主要是CD4+细胞分泌IL-2、IL-12、IFN-g和TNFb/a等，主要介导细胞免疫应答。
Th2细胞主要是CD4+细胞分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10等， 主要介导体液免疫应答。
Tc1细胞主要是CD8+细胞分泌IFN-g、 IL-2、 IL-6和IL-10 等。
Tc2细胞主要是CD8+细胞分泌IL-2、 IL-4、IL-5、 IL-6和 IL-10等。
工作原理
•将经特异性荧光染料染色后的细胞放入样品管中， 细胞在气体的压力下进入充满鞘液的流动室, 在鞘 液的约束下细胞排成单列，并由流动室的喷嘴喷 出，形成细胞柱，通过激光器的照射激发出散射 光信号和荧光信号, 再由各自的激光检测器收集信 号, 经光电倍增管(PMT) 将信号放大, 转变为电信 号后由计算机系统进行分析.
BrdU细胞增殖检测
BrdU是胸腺嘧啶的衍生物，常用于标记活 细胞中新合成的DNA，可代替胸腺嘧啶选 择性整合到复制细胞中新合成的DNA中 （细胞周期S期）。这种掺入可以稳定存 在，随DNA复制进入子细胞中。BrdU 特 异性抗体可以用于检测BrdU的掺入，从而 判断细胞的增殖能力。
树突状细胞检测:
自然杀伤细胞 （NK细胞）
淋巴细胞免疫表型分析
• 根据淋巴细胞的功能及膜表面标记，主要分 为T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK细胞三个亚 群，但三者在普通光学显微镜下不能区分， 血细胞分析仪也无法鉴别，只有用流式细胞 仪结合单克隆抗体技术才能准确分类计数淋 巴细胞亚群。
经常测定的淋巴细胞免疫标记包括： T淋巴细胞 ：CD3、CD4、CD8,
ELISA一次反应只检测一个指标。而CBA一次可 同时检测6-7个指标。
• CBA （Cytometric Bead Array)是利用一系 列荧光强度不同的微球，同时分析样本中 多种可溶成分的流式检测方法。
流式细胞术
流式细胞术（Flow Cytometry, FCM）是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，与传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点，成为当代最先进的细胞定量分析技术。
一种在液流系统中，快速测定单个细胞或细胞器的生物学性质，并把特定的细胞或细胞器从群体中加以分类收集的技术。
其特点是通过快速测定库尔特电阻、荧光、光散射和光吸收来定量测定细胞 DNA含量、细胞体积、蛋白质含量、酶活性、细胞膜受体和表面抗原等许多重要参数。
根据这些参数将不同性质的细胞分开，以获得供生物学和医学研究用的纯细胞群体。
目前最高分选速度已达到每秒钟3万个细胞工作原理将待测细胞染色后制成单细胞悬液。
用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。
流式细胞仪通常以激光作为发光源。
经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。
这两种信号同时被前向光电二极管和90°方向的光电倍增管接收。
光散射信号在前向小角度进行检测，这种信号基本上反映了细胞体积的大小；荧光信号的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号。
这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度，经光电倍增管接收后可转换为电信号，再通过模/数转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。
计算机把所测量到的各种信号进行计算机处理，将分析结果显示在计算机屏幕上，也可以打印出来，还可以数据文件的形式存储在硬盘上以备日后的查询或进一步分析。
检测数据的显示视测量参数的不同由多种形式可供选择。
流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)
第三节 流式细胞术的临床应用
白血病免疫分型 HLA-B27: 强直性脊柱炎 淋巴细胞亚群 造血干细胞计数：造血干细胞移植 网织红细胞 PNH诊断（CD55、CD59） 血小板活化试验
流式细胞白血病免疫分型
流式细胞的免疫分型
是白血病分型的重要指标 FAB标准，形态学和免疫表型结合 适合于白血病的分型诊断，但不适合用 于确诊是不是白血病。 Minimal residual diseases (MRD)
阳性对照：检测阴性时
空白对照和阴性对照的比较：
实验标本的处理
单细胞悬液的制备：胰酶消化 抗体或标记分子的染色：抗原抗体反应 非特异结合的去除：洗涤和封闭 封闭：血清和同型抗体
流式检测应用实例
凋亡 细胞内分子检测
凋亡检测-每一步都有检测试剂盒
细胞周期
G2
M
S
G1
G0 Quiescent cells
5）网织红细胞计数 6）白细胞分类计数
第七节 其他应用
溶液中细胞因子的测量: 利用吸附有特异性抗体的微球，与溶液 中的细胞因子结合，而检测溶液中是否 存在该种因子 HLA-B27的检测：用于诊断强直性脊柱炎。
第八节 细胞分选
FCM可将样本中所需要的细胞亚群从群体细胞 中分离出来，即所谓分选(Sorting)。被测细胞 的任何参数均可作为分选的依据。分选的方式 一般有静电分选和捕获管分选，分选方式不同 则决定分选的速度，分选纯度一般可达99%以 上。除细胞分选外还可进行染色体分选。 分选的细胞可用于克隆化培养、原位杂交、 分子生物学研究等。从孕妇外周血中分离富集 胎儿有核红细胞用于产前诊断，染色体分选可 用于基因诊断。
SORTING（细胞分选）
DIMER X antigen specific T cell assay method for monitoring cellular response
分子医学技能：流式细胞仪(FLOW CYTOMETER,FCM)
8.23
0.26
左图显示在抗原刺激前，CD4+和CD4-细胞中能产生IFN-γ的细胞占PBMC的 0.25%和1.56%
右图显示在抗原刺激后，CD4-细胞中能产生IFN-γ的增加到8.23%，提示该 抗原能促进CD4-细胞分泌IFN-γ
流式细胞仪（FLOW CYTOMETER，FCM）
对于处在流动状态的细胞或生物颗粒进 行多参数的快速的定量和分析的技术。
检测仪器：流 式 细 胞 记 数 仪
FCM 是诸多技术的结晶:
• 激光技术
• 电子物理技术 • 光电测量技术 • 计算机技术 • 细胞荧光化学技术 • 单克隆抗体技术
FCM结构组成部分
液流系统;
将细胞引导至检测位点
光学系统;
产生并收集光学信号
电子系统;
将光信号转换成电信号,使之数字化,输入计算机并分 析。
细胞分选系统。
FLOW CELL(流动室)
Injector Tip
鞘液
荧光信号 聚焦的激光光束
荧光信号
每种荧光染料均有特定的激发波长, 并激发后 会有发射波长,流式细胞仪检测的即是它特定 的发射波长.
检测器
Photomultiplier tube (PMT)
将光学信号转变为电脉冲(数字数据)信号
双参数点图
1. FSC,与细胞直径平分正相关 2. SSC, 指与激光束正交90度方向的散射信号，它对细胞膜、 胞质、核膜的折射率更敏感，可以提供细胞内结构及颗粒 性质的信息
结果示范
1.56
0.25
Fluorescence
Fluorescence detector ( FL1,FL2,FL3,FL4)
检测信号
电子系统
流式细胞术(免疫学检验课件)
Region设置 Gate设置
第四节 FCM的临床应用
一、淋巴细胞亚群分析
淋巴细胞是机体免疫系统中的一群重要细胞群， 是执行免疫功能和参与免疫调节的免疫活性细胞， 主要分为T细胞、B细胞和NK细胞3大类。
不同淋巴细胞表达的CD抗原都有独自的抗原特性， 在临床疾病发生过程中对各淋巴细胞的CD抗原进 行测定，对于判断机体免疫功能状态、了解免疫 相关疾病的发病机制具有十分重要的意义。
最常用的方法是酶消化法、机械法、化学处理法 和表面活性剂处理法等。
（四）石蜡包埋组织单细胞悬液制备
该制备方法的建立扩大了流式细胞术的应用范围， 有利于进行临床回顾性研究和利用。
常用的方法有二甲苯脱蜡法、组织清洁剂脱蜡法和 甲氧-双氧水处理法。
石蜡切片一般适宜厚度是40μm~50μm，脱蜡须彻底， 获取组织后，用酶进行消化处理，消化时间不宜过 长，以免细胞核被消化溶解，经过滤、漂洗后即可 获得单细胞悬液。
三、三参数直方图
三维坐标均为参数 （散射光或荧光）而 非细胞数
对复杂的细胞亚群观 察更为直观、准确， 但对其数据的统计分 析较难
四、多参数组合分析
FCM常常需要分析三个以上的参数，但软件技术 能够无法显示四维空间结构。
随着FCM多色荧光信号检测的发展，所得到的荧 光信号和散射光信号需根据需要进行组合分析以 获得所需的信息。
SSC信号的强弱与 细胞内颗粒结构的 质量成正比，用于 检测细胞内部结构 属性
前向散射光示意图 细胞大小
结构复杂程度
侧向散射光示意图
血
液
白
细
胞
粒细胞
散
点
单核细胞
图
淋巴细胞
荧光信号：由待检细胞上标记的特异性荧光染料 受激光激发后产生。
流式细胞术FCM概述
FCM基本知识概述一. 流式细胞术流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)是七十年代发展起来的高科学技术,•它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体, 同时具有分析和分选细胞功能。
它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状,还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等,可对群体细胞在单细胞水平上进行分析, 在短时间内检测分析大量细胞,并收集、储存和处理数据,进行多参数定量分析; 能够分类收集(分选)某一亚群细胞,分选纯度＞95%。
在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。
国内使用的流式细胞仪主要由美国的两个厂家生产:BECKMAN- COULTER公司和Becton-Dickinson公司(简称B-D公司)。
流式细胞仪主要有两型:临床型（又称小型机、台式机）和综合型（又称大型机、分析型）。
BECKMAN-COULTER公司最新产品为EPICS ALTRA和EPICS XL/XL-MCL, B-D•公司最新产品为FACS Vantage和FACS Calibur。
EPICS XL/XL-MCL和FACS Calibur是临床型;EPICS ALTRA和 FACS Vantage是综合型，除具备检测分析功能外,还具有细胞分选功能,•多用于科学研究。
二.流式细胞仪主要技术指标1．流式细胞仪的分析速度：一般流式细胞仪每秒检测1000～ 5000个细胞,大型机可达每秒上万个细胞。
2．流式细胞仪的荧光检测灵敏度：一般能测出单个细胞上<600个荧光分子,两个细胞间的荧光差＞5%即可区分。
3．前向角散射（FSC）光检测灵敏度：前向角散射（FSC）反映被测细胞的大小,一般流式细胞仪能够测量到0.2μm～０.5μm。
4．流式细胞仪的分辨率：通常用变异系数CV值来表示，,一般流式细胞仪能够达到<2.0%,这也是测量标本前用荧光微球调整仪器时要求必须达到的。
流式细胞术
流式细胞术科技名词定义中文名称：流式细胞术英文名称：flow cytometry assay;flow cytometry;FCM其他名称：荧光激活细胞分选法(fluorescence-activated cell sorting,FACS)定义1：一种细胞分选或分析技术。
即以荧光素标记抗体结合相应细胞，用激光束激发单行流动的细胞，根据细胞所携带荧光(强度或类别)进行分选或分析。
测和诊断（三级学科）定义2：一种对悬液中细胞、微生物或细胞器等进行单个快速识别、分析和分离的技术。
用以分析细胞大小、细胞周期、DNA含量、细胞表面分子以及进行细胞分选等。
应用学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；方法与技术（二级学科）定义3：用荧光剂对细胞特定成分染色，利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析，并能对特定群体加以分选的现代细胞分析技术。
应用学科：细胞生物学（一级学科）；细胞生物学技术（二级学科）流式细胞术（Flow CytoMeter，FCM）是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，与传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点，成为当代最先进的细胞定量分析技术。
简介一种在液流系统中，快速测定单个细胞或细胞器的生物学性质，并把特定的细胞或细胞器从群体中加以分类收集的技术。
其特点是通过快速测定库尔特电阻、荧光、光散射和光吸收来定量测定细胞DNA含量、细胞体积、蛋白质含量、酶活性、细胞膜受体和表面抗原等许多重要参数。
根据这些参数将不同性质的细胞分开，以获得供生物学和医学研究用的纯细胞群体。
目前最高分选速度已达到每秒钟3万个细胞。
特点1.测量速度快；2.可进行多参数测量；3.是一门综合性的高科技方法（FCM 综合了光学，电子学，流体力学，细胞化学，免疫学，激光和计算机等多门学科和技术）；4.既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。
流式细胞仪FlowCytometerFCMorFACS是一项集激光技术
流式细胞仪的主要技术指标
1. 荧光测量灵敏度 2. 仪器的分辨率和准确度 3. 前向角散射光检测灵敏度 4. 检测速度以每秒可分析的细胞数来表示 5. FCM分选指标主要包括：分选速度、分选纯
度、分选后细胞的活性度及分选收获率。
流式细胞仪可测量的主要参数
细胞结构
细胞大小 细胞粒度 细胞表面面积 核浆比例 DNA含量与细胞周期 RNA含量 蛋白质含量
胸片 右下肺斑片状密度增高影，右膈面 局限性膨升，脊柱侧弯。
副鼻窦CT示：双侧上颌窦、筛窦、蝶窦、 额窦腔内可见软组织密度填充影，部分 骨壁骨质增生硬化。
外周血涂片：成熟粒细胞占5%，成熟淋巴细胞 占95%，但淋巴细胞表面可见明显绒毛样突起， 血小板少。
骨髓细胞免疫分型与外周血免疫分型一致。 骨髓
双 参 数 图
外周全血细胞散射光双参数点图 （红细胞溶解后）
双参数可在二维散点图中同时显示，X 轴显示通道 1（FL1）， Y 轴显 示通道 2（FL2）。
3-D Histograms
（假）三维图由X、Y、Z三个数轴组成，X 轴显示通道 1信号 （FL1）， Y 轴显示通道 2信号（FL2），Z轴显示通道3信号（FL3） 或其他两个通道的细胞数量。
追溯病史：患者有发热、盗汗。
查体：慢性病容，双侧颈部、腋下及腹股沟 可扪及多个肿大淋巴结，0.5cm~2cm大小不等， 质地中等，活动尚可，无触痛。双眼内皉可 见脓点，耳、鼻、口腔无异常分泌物，鼻窦 区无压痛，心肺正常，腹软，肝肋下未及， 脾大约肋下两指。
一般实验室检查：血常规示：WBC 36.2x109/L， Lym 78%, Hb 78g/L, Plt 120x109/L,肝功能： ALB 23.9g/L, GLB 74g/L, ALT, AST及肾功能正 常。ESR: 142mm/L，IgG 57.41g/L, IgA 7.52g/L, IgM 1.91g/L。β 2-MG 14.8mg/L, LDH 正常，尿κ 251mg/L, 尿λ 95.4mg/L, 血 κ 13.5g/L, 血λ 6.72g/L。
流式细胞仪(FlowCytometer)基本原理汇总.
Counts
Event #
FL1 FITC
1
10
2 700
3 720
4
15
……
0…………10…………100…………1000 FITC荧光强度
直方图 Histogram
横坐标既可以是线性的，也可以是对数的。
DNA倍体分析
抗原表达分析
Overlay图
散点图 Dot Plot
散点图中每个点代表一个细胞，X轴与Y轴分别代表一种参 数，优点是比直方图直观。
FL-2(-)
FITC 单标
PE 单标
FL-2(PE)
FL2 - %FL1 FL-1(FITC)
FL1 - %FL2 FL-1(ion
FL-1(FITC)
After Compensation
FL-1(FITC)
什么样的补偿最合适？
单染管的阴性群体和阳性群体在所需调节通道的荧光Median 值相等时为最合适的补偿。
Hoechst（343, 450）常见为Hoechst33342和Hoechst33258，非嵌入的方 式与DNA链上的A-T碱基对结合。能对活细胞染色，用于活细胞DNA定量分 析，如精子分选；还用于侧群细胞的分选。
PY（派若宁 560, 573） RNA染料，能进入活细胞。
AO（吖啶橙 509, 525） DNA、RNA染料，染色后DNA呈黄绿色荧光，RNA呈 橙黄色荧光，可进行DNA/RNA双参数分析。
5% 默认阈值
32% 升高阈值后
荧光素和荧光信号
荧光： 荧光素的电子吸收光的能量由低能态转变为高能态， 再回到低能态时释放出的光。
＜ 激发波长
Excitation wavelength
流式细胞术一览
简介
流式细胞仪(Flow Cytometer):是集激光技术、 电子物理技术、光电测量技术、计算机技术、细胞 荧光化学技术以及单克隆抗体技术为一体的高科技 细胞分析仪。
流式细胞术(Flow Cytometry，FCM):利用流式 细胞仪对处于快速直线流动状态中的细胞或亚细胞 结构进行多参数、快速的定量分析和分选的技术。
在血液病诊断和治疗中的 应用
(1)白血病的诊断和治疗：FCM采用各种抗血细胞表面分化 抗原 (CD)的单克隆抗体，借助于各种荧光染料(异硫氰基 荧光素FITC，藻红蛋白PE等)测定一个细胞的多种参数， 以正确地判断出该细胞的属性。 (2)其它种类血液病的诊断和治疗监测：阵发性睡眠性血红 蛋白尿症是一种造血干细胞克隆病，细胞CD55、CD59抗 原表达减低是该病的一个特点。 (3)网织红细胞的测定及临床应用：网织红细胞计数是反映 骨髓造血功能的重要指标，FCM通过某些荧光染料(吖啶 橙、噻唑橙等)与红细胞中RNA结合，定量测定网织红细 胞中RNA，得到网织红细胞占成熟红细胞的百分比。
(2)在肿瘤的诊断、预后判断和治疗中的作用： FCM在肿瘤诊断中的重要作用已经被认可，DNA 非整倍体细胞峰的存在可为肿瘤诊断提供有力的 依据，FCM分析病理细胞具有速度快、信息量大， 敏感度高等优点，已被用在常规工作中。肿瘤细 胞DNA倍体分析对病人预后的判断有重要作用， 异倍体肿瘤恶性病变的复发率高、转移率高、死
在肿瘤学中的应用
(1)发现癌前病变，协助肿瘤早期诊断：人体正常组织发 生癌变要经过一个由量变到质变的漫长过程，而癌前细胞 即处于量变过程中向癌细胞转化阶段。人体正常的体细胞 均具有比较稳定的DNA二倍体含量。当人体发生癌变或 具有恶性潜能的癌前病变时，在其发生、发展过程中可伴 随细胞DNA含量的异常改变，FCM可精确定量DNA含量 的改变，作为诊断癌前病变发展至癌变中的一个有价值的 标志，能对癌前病变的性质及发展趋势作出估价，有助于 癌变的早期诊断。有资料证实，癌前病变的癌变发生率与 细胞不典型增生程度有密切关系，增生程度越重，癌变发 生率越高。随着细胞不典型增生程度的加重，DNA非整 倍体出现率增高，这是癌变的一个重要标志。
流式细胞术描述
二、流式细胞术的重要术语
1.前向散射与侧向散射 2. Coulter效应与电子体积 3.荧光信号及其面积与宽度 4.光谱重叠与荧光补偿 5.细胞基础荧光域值与阴性对照置信区间
1.前向散射与侧向散射
前向散射光 (forward scatter)： FSC信号的强弱与细胞的大小相关
侧向散射光（side scatter)： SSC信号的强弱与细胞内的颗粒多少相关
信号收集与光电转换系统
主要由光电转换器件、放大器和信号处理电路组成 光电转换器件主要功能是将光信号转换成电流信号。
由光电二极管和光电倍增管（PMT）来执行。 放大器分两类：线性放大和对数放大。 信号处理系统的主要功能是将电信号转变成脉冲信
号、数字信号最终传送给计算机系统进行处理。
计算机与分析系统
阴性对照 阳性对照 空白对照 补偿对照
2.一套完整的流式细胞术检测样本设置
阴性对照
作用是调节各荧光探测器合适的放大倍数，将仪 器归零，即确定待测标本的基础荧光域值
免疫球蛋白同型对照（同型抗体为没有特异性、与荧光
抗体蛋白亚型一致的免疫球蛋白。反映待测标本对抗体非特 异性结合的 水平）
阴性细胞对照（用已知不表达某种抗原的细胞进行平行
利用红细胞裂解液去除红细胞后，得到外周血中所有 白细胞的流式细胞分析的二维散点图
（二) 培养细胞的样品制备
单层培养细胞加蛋白酶消化后吸管吹打的方法 使细胞从培养皿上消化下来，然后离心漂洗。
悬浮培养细胞，可不用酶消化，直接吹打制备 成单细胞悬液。
第一节 流式细胞仪基本结构与原理 第二节 流式细胞术的数据分析 第三节 流式细胞仪分析的技术要求 第四节 流式细胞术的应用
第一节 流式细胞仪基本结构与原理
fcm是什么意思
回答：流式细胞术是一种生物学技术，用于对悬浮于流体中的微小颗粒进行计数和分选。
这种技术可以用来对流过光学或电子检测器的一个个细胞进行连续的多种参数分析。
流式细胞术（Flow CytoMetry，FCM）是对悬液中的单细胞或其他生物粒子,通过检测标记的荧光信号，实现高速、逐一的细胞定量分析和分选的技术。
延伸：其特点是通过快速测定库尔特电阻、荧光、光散射和光吸收来定量测定细胞 DNA含量、细胞体积、蛋白质含量、酶活性、细胞膜受体和表面抗原等许多重要参数。
根据这些参数将不同性质的细胞分开，以获得供生物学和医学研究用的纯细胞群体。
fcm全称“Firebase Cloud Messaging”，是一项针对Android、iOS及网络应用程序的消息与通知的跨平台解决方案，目前可免费使用；该服务由Google拥有的Firebase公司提供。
Firebase云消息传递（英语：Firebase Cloud Messaging，通常简称FCM），也称Firebase云信息传递，前身为Google云消息传递（GCM），是一项针对Android、iOS及网络应用程序的消息与通知的跨平台解决方案，目前可免费使用。
该服务由Google拥有的Firebase公司提供。
Firebase已于2014年10月21日宣布被Google收购，价格未公布。
[2]Google云消息传递的官方网站现已指向Firebase云消息传递，视作新版Google云消息传递。
由于中国大陆与谷歌的连接不畅，大多数中国大陆国产应用（如QQ等）都没有接入FCM，转而使用心跳机制来确保消息推送。
[4]微信在部分Play版本被发现内置了FCM，但被认为可能只是用以唤醒相关进程，而非用于推送聊天消息。
除此之外，日本的即时通讯应用Line也对中国、台湾手机号注册的账户实行了心跳机制的推送，而其他国家或地区以及未绑定手机号的账户使用FCM推送。
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流式“TUNEL”
Intracellular Cytokine-Protocol
SORTING（细胞分选）
DIMER X antigen specific T cell assay method for monitoring cellular response
CBA(Cytometric Bead Array)
细胞增殖周期测定和DNA倍体分析
1）细胞增殖周期：分为G0、G1、S、G2、M期。S期是DNA合成期，在S期 内，DNA进行复制，使细胞的DNA含量由2倍体（2C 46条染色体）变为4倍 体（4C）。G1和G2期为DNA合成前、后间期，此期无DNA的合成，但RNA和 蛋白质进行合成。M期为有丝分裂期，在此期一个细胞分裂为2个细胞。 细胞内的92条染色体分裂成2组46条染色体，使每个细胞内具有46条染色 体。在M期分裂成两个子细胞之前，G2和M期细胞的DNA含量均为恒定的4C 。M期以后部分细胞进入G1期，继续进行增殖，部分细胞进入G0期，即静 止期，不再继续增殖。因此，FCM分析一个群体细胞峰DNA倍体与细胞周 期时，将DNA含量直方图分为三部分，即G0/G1,S,G2/M期三个细胞峰。 G0/G1和G2/M细胞峰DNA的含量成正态分布，S期细胞峰则是一个加宽的正 态分布。
标本的获取和运输 标本的制备和染色 仪器的校准和质控 流式细胞仪数据获取与储存
FCM的主要测定指标
FSC, SSC, FL1, FL2, FL3 (FL4)
其中： FSC：反映细胞的大小 SSC：反映细胞内颗粒性
FCM标记方法
单标： 一种单抗/tube: FL1, FSC, SSC（三参数） 双标： （两种单抗/tube）：FL1, FL1, FSC, SSC（四参
实验对照的设计
空白对照：ALL 阴性对照：常用同型抗体对照
单色分析：设同型抗体对照 多色分析：同型对照，单阳性对照（用于仪器校正）
阳性对照：检测阴性时
空白对照和阴性对照的比较：
实验标本的处理
单细胞悬液的制备：胰酶消化 抗体或标记分子的染色：抗原抗体反应 非特异结合的去除：洗涤和封闭 封闭：血清和同型抗体
流式检测应用实例
凋亡 细胞内分子检测
凋亡检测-每一步都有检测试剂盒
细胞周期
G2 M
G1 S
G0 Quiescent cells
细胞周期不能区分凋亡与死亡细胞 Sub-G0/G1 peaks --- PI staining
Caspases
Annexin V Assay建议用于悬浮细胞
Annexin V Assay能够区分死亡与凋亡
流式细胞的免疫分型
是白血病分型的重要指标 FAB标准，形态学和免疫表型结合 适合于白血病的分型诊断，但不适合用 于确诊是不是白血病。 Minimal residual diseases (MRD)
FCM应用
1、细胞增殖周期测定和DNA倍体分析 2、凋亡检测 3、免疫功能的检测 4、血液学应用 5、HLA-B27的检测：用于诊断强直性脊柱炎。 6、其他：溶液中细胞因子的测量。 7、细胞分选
FL1 FL2 FL3 FL4
最常用的标记方法是荧光素分子标记 的抗体与细胞抗原结合
流式常见图形 (Histogram Plot)
适用于：单参数分析
流式常见图形 (Dot Plot)
适用于：多参数分析
第二节 流式细胞术的科研应用
分析群体细胞 所需时间短 多参数分析 定性或定量
流式应用常见范围
Traditional Analysis -- Percent positive
Linear Fluorescence in FL2
Determination of the CD4 PE ABC on lymphocytes
10000 1000
lymph FL2; (49,000 ABC)
100
数） 三/四标： （三种单抗/tube）（四种单抗/tube）：
FL1-FL3/4, FSC, SSC
荧光素种类
FITC(异硫氰酸荧光素）：绿色 530nm PE（藻红蛋白）：橙黄色 575nm PerCP(多甲藻黄素叶绿素蛋白）：深红色
675nm PI(碘化丙啶）：橙红色 620nm 488nm波长的氩离子激光激发 APC(别藻兰蛋白）：红色 660nm 630nm波长的氦氖激光或红色二极管激光激发
抗体的选择
PE最强，适用于弱表达抗原 FITC最便宜，适用于强表达抗原，适
用范围广
biotin-avidin不适合 弱抗原的检测
数据显示方式
单参数直方图 双参数二维点图 等高图 二维密度图 三维图
流式常见图形 (Histogram Plot)
流式细胞的主要信息:Fluorescence
细胞大小 细胞的颗粒度 细胞表面分子：CD 系列 细胞浆内分子：胞内细胞因子 细胞核内分子：P53 细胞功能检测：细胞周期、凋亡
抗体标记的方法
抗体的选择
首选直接标记抗体 荧光分子 PE最强，适用于弱表达抗原
FITC最便宜，适用于强表达抗原
间接标记：适用范围广, biotin-avidin不适
合弱抗原的检测
流式细胞术 （Flow 、流式细胞仪(Flow Cytometer):是集光电子物 理，光电测量，计算机，细胞荧光化学，单抗 技术为一体的高科技细胞分析仪。
2、流式细胞术(Flow Cytometry):利用流式细胞 仪对处于快速流动的细胞或生物颗粒进行多参 数、快速（每秒可达1000-10000个）的定量分 析和分选（纯度可达99%以上）的技术。
10
cell and bead neg
1
12 0
103
104 105
Molecules PE per Bead
第三节 流式细胞术的临床应用
白血病免疫分型 HLA-B27: 强直性脊柱炎 淋巴细胞亚群 造血干细胞计数：造血干细胞移植 网织红细胞 PNH诊断（CD55、CD59） 血小板活化试验
流式细胞白血病免疫分型
流式细胞仪结构
• 激光光源及光束形成系统 • 流动室及液流驱动系统 • 光学系统：透镜、滤光片、小孔，聚焦光源，
收集不同波长的荧光信号。 • 信号检测与分析：光电倍增管（PMT）、补偿
电路。荧光信号转换为电信号，并将信号放大。 • 存储、显示、分析系统：计算机。 • 细胞分选系统
流式免疫分型技术要点