鸡传染性法氏囊病毒病毒样颗粒的制备

ＩＢＤＶ 属于双 ＲＮＡ 病 毒 科（Ｂｉｍａｖｉｒｉ－ｄａｅａ ｆｍｉ－ ｌｙ），禽双 ＲＮＡ 病 毒 属 （Ｖａｉｎａｂｉｍｖａｉｕｒｓ）。 无 囊 膜， 具有双节段、双链 ＲＮＡ 基因组，呈二十面体对称结 构，直径为６０ｎｍ 左右。抗 ＶＰ２单克隆抗体可鉴别 出 ２ 个 血 清 型 ：血 清 Ⅰ 型 和 血 清 Ⅱ 型 ，血 清 Ⅰ 型 对 鸡 有致病力，对火鸡 没 有 致 病 力，但 是 能 产 生 抗 体，血 清Ⅱ型 属 于 无 毒 力 病 毒 株［１０］。ＩＢＤＶ 基 因 组 有 Ａ 和 Ｂ ２个片 段 组 成。 其 中，Ｂ 片 段 长 约 ２．８ｋｂ［１１］， 编码 ＶＰ１ 蛋 白，是 ＲＮＡ 依 赖 的 ＲＮＡ 聚 合 酶，使 Ａ、Ｂ ２个片段紧 密 结 而 环 化，与 病 毒 的 复 制 和 病 毒 样颗粒的组装有关 。Ａ ［１２－１３］ 片 段 长 约 ３．２ｋｂ，编 码 ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４、ＶＰ５ ４ 种 蛋 白 ［１４］，其 中 ，ＶＰ２ 是ＩＢ－ ＤＶ 主要结构蛋白，它暴 露 在 核 衣 壳 的 外 面，也 是 该 病毒的主要保护 性 抗 原，具 有 血 清 型 特 异 性。 目 前 已经鉴定的中和表位主要在 ＶＰ２ 上，并且多为构象 依赖性 ，这 ［１５－１８］ 意味着 ＶＰ２的立体结 构 对 其 中 和 表 位的形成至关重要。
摘要：为了制备鸡传染性法氏囊病毒病毒样颗粒，本试 验 通 过 ＲＴ－ＰＣＲ 技 术 扩 增 出 鸡 传 染 性 法 氏 囊 病 病 毒 超 强 毒 株ＪＬ 株的 ＶＰ２全长基因，并将其插入杆状病毒表达系统的供 体 质 粒 ｐＦａｓｔＢａｃＨＴＡ 中，构 建 含 有ＩＢＤＶ ＶＰ２ 基 因 的重组供体质 粒 ｐＦａｓｔ－ＶＰ２，转 化 ＤＨ１０Ｂａｃ Ｅ．ｃｏｌｉ感 受 态 细 胞 中，经 蓝 白 斑 筛 选，获 得 重 组 杆 粒 ｒＢａｃｍｉｄ－ＶＰ２，将 重组杆粒ｒＢａｃｍｉｄ－ＶＰ２转染ｓｆ９细胞后得到重组杆状病毒 ｖＢａｃ－ＶＰ２。ｒＢａｃ－ＶＰ２感染ｓｆ９细胞，提取 ＤＮＡ，经 ＰＣＲ 电 泳 分 析 ，得 到 １ 条 与 预 期 大 小 相 符 的 特 异 性 条 带 ；间 接 免 疫 荧 光 检 测 ，可 见 特 异 性 荧 光 ；Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔｔｉｎｇ 分 析 ，在 大约５３ ０００处出现１条特异性的蛋白条带；电镜观察感染重组杆状病毒的细胞上清和沉淀，均 可 见 重 组 ＶＰ２ 蛋 白 自行组装形成的病毒样颗粒。试验结果表明ＩＢＤＶ ＶＰ２基因在昆虫 细 胞 中 得 到 了 表 达 ，并 自 组 装 成 了ＩＢＤＶ 病 毒 样颗粒。本试验为研制鸡传染性法氏囊病病毒样颗粒疫苗奠定了基础。 关 键 词 ：鸡 传 染 性 法 氏 囊 病 毒 ；ＶＰ２；真 核 表 达 ；病 毒 样 颗 粒 ；ｓｆ９ 细 胞 中 图 分 类 号 ：Ｓ８５２．６５ 文 献 标 志 码 ：Ａ 文 章 编 号 ：１００５－４５４５（２０１４）１１－１７２５－０７
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中 国 兽 医 学 报 ２０１４年１１月 第３４卷 第１１期 Ｃｈｉｎ Ｊ Ｖｅｔ Ｓｃｉ Ｎｏｖ．２０１４ Ｖｏｌ．３４ Ｎｏ．１１
感［４－５］，近几年 的 研 究 发 现，ＩＢＤＶ 的 毒 力 还 在 不 断 的增强，并且 在 我 国 ＩＢＤ 的 发 生 还 有 增 加 的 趋 势， 尤其是超强毒 株 （ｖｖＩＢＤＶ）和 变 异 毒 株 （ｖＩＢＤＶ）的 出 现 、抗 原 的 变 异 以 及 不 同 血 清 型 间 没 有 交 叉 保 护 、 血 清 亚 型 多 样 性 ，使 得 该 病 更 加 复 杂 ，对 该 病 的 防 治 更 加 困 难 。 ［６－９］
Ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｖｉｒｕｓ－ｌｉｋｅ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｂｒｕｓａｌ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ
ＬＩ Ｑｉｎ１，ＷＡＮＧ Ｊｉａｎ－ｚｈｏｎｇ１，ＨＵＡＮＧ Ｃｈｕ－ｄｉ ２，ＭＵ Ｙｕ１，ＺＨＯＵ Ｙｕ－ｌｏｎｇ１，ＧＡＯ Ｃｈａｏ１，ＹＡＮＧ Ｍｉｎ－
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ ｐｒｅｐａｒｅ ＩＢＤＶ ｖｉｒｕｓ－ｌｉｋｅ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ，ｔｈｅ ＶＰ２ ｇｅｎｅ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｂｕｒｓａｌ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ （ＩＢＤＶ）ＪＬ ｓｔｒａｉｎ ｗａｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ａｎｄ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ ｐＦａｓｔＢａｃＨＡＴ ｄｏｎｏｒ ｐｌａｓｍｉｄ．Ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＦａｓｔ－ＶＰ２ｗａｓ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｉｎｔｏ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ１０Ｂａｃ ｃｅｌｌｓ，ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｂａｃｍｉｄ ＤＮＡ ｒＢａｃｍｉｄ－ＶＰ２ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｂｌｕｅ－ｗｈｉｔｅ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｎｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｉｎｔｏ ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌ Ｓｆ９ｔｏ ｐｒｏｄｕｃｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｖＢａｃ－ＶＰ２．ＤＮＡ ｏｆ ｓｆ９ｃｅｌｌｓ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｖＢａｃ－ＶＰ２ ｗａｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ａｎｄ ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ ＰＣＲ，ｓｈｏｗｅｄ ａ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂａｎｄ ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ｍａｔｃｈｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｅｘｐｅｃｔｅｄ ｓｉｚｅ．Ｔｈｅ Ｓｆ９ｃｅｌｌｓ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｖＢａｃ－ＶＰ２ｗｅｒｅ ｓｔａｉｎｅｄ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ａｇａｉｎｓｔ ＩＢＤＶ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｉｎｄｉｒｅｃｔ ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｓｓａｙ （ＩＦＡ）．Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔｔｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ ｄｉｓｐｌａｙｅｄ ａ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂａｎｄ ｏｆ ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅ ５３ ０００，ａｎｄ ｔｈｅ ｓｅｌｆ－ａｓｓｅｍｂｌｙ ｖｉｒｕｓ－ｌｉｋｅ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ（ＶＬＰ）ｃｏｕｌｄ ｗｅｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ．Ｔｈｅ ａｂｏｖｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ＶＰ２ｇｅｎｅ ｏｆ ＩＢＤＶ ｗａｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｓｆ９ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｓｅｌｆ－ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｉｎｔｏ ｖｉｒｕｓ－ｌｉｋｅ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ｐａｖｅｄ ｔｈｅ ｗａｙ ｆｏｒ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｔｈｅ ＩＢＤＶ ｖｉｒｕｓ－ｌｉｋｅ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｖａｃｃｉｎｅ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ＩＢＤＶ；ＶＰ２ｇｅｎｅ；ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；ｖｉｒｕｓ－ｌｉｋｅ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ；ｓｆ９ｃｅｌｌｓ
本研究通 过 ＲＴ－ＰＣＲ 扩 增 出 ＩＢＤＶ 超 强 毒 分 离 株 ＶＰ２基因，根据ＩＢＤＶ ＶＰ２ 蛋白单独表达后可 以自 我 组 装 成 ＶＬＰｓ的 特 性，利 用 Ｂａｃ－ｔｏ－Ｂａｃ表 达 系统在昆虫细胞 中 表 达ＩＢＤＶ ＶＰ２ 蛋 白，包 装 形 成 病毒样颗粒，为研制针 对 近 期 流 行ＩＢＤ 的 病 毒 样 颗
中 国 兽 医 学 报 ２０１４年１１月 第３４卷 第１１期 Ｃｈｉｎ Ｊ Ｖｅｔ Ｓｃｉ Ｎｏｖ．２０１４囊病毒病毒样颗粒的制备
李 芹１，王建忠１，黄楚荻２，穆 昱１，周玉龙１，高 超１，杨闽楠１，赛 度１，丁 壮１＊ （１．吉林大学
动物医学学院，吉林 长春 １３００６２；２．兰州大学 资源环境学院，甘肃 兰州７３０００１）
ｎａｎ１，ＳＡＩ Ｄｕ１，ＤＩＮＧ Ｚｈｕａｎｇ１＊ （１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｊｉｌｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ １３００６２，Ｃｈｉｎａ；２．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｌａｎｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ ７３０００１，Ｃｈｉｎａ）
收 稿 日 期 ：２０１４－０７－１３ 作 者 简 介 ：李 芹 （１９８７－），女 ，硕 士 。
＊ 通 讯 作 者 ，Ｅ－ｍａｉｌ：ｄｉｎｇｚｈｕａｎｇ＠ｊｌｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
要 发 生 在 ３～１２ 周 龄 的 幼 鸡 ，具 有 发 病 率 高 、病 程 短 的特 征。ＩＢＤＶ 主 要 侵 害 幼 鸡 的 免 疫 器 官—法 氏 囊 ，在 淋 巴 细 胞 中 增 殖 的 同 时 也 能 使 细 胞 发 生 变 性 、 坏死、排空等，损 伤 法 氏 囊［２－３］，进 而 引 起 免 疫 抑 制， 诱发多种 疾 病，给 养 殖 业 带 来 了 巨 大 的 经 济 损 失。 ＩＢＤＶ 在体外的 生 存 能 力 很 强，对 多 种 消 毒 剂 不 敏
不同毒株在 ＶＰ２的２０６～３５０位氨基酸的差异 非常大［１９］，称其为高 变 区，它 占 据 了 ＶＰ２ 大 部 分 构 象依赖区，是发 生 抗 原 漂 移 的 重 要 区 域。ＩＢＤ 变 异 株常缺失某些 ＭｃＡｂ结 合 所 必 须 的 中 和 抗 原 位 点， 使变异株能避开经典毒株中和抗体的作用。这种分 子结构的改变导致病毒致病力的改变及宿主对疫苗 应 答 的 改 变，使 得 传 统 的 疫 苗 已 不 能 控 制 其 流 行 。 ［２０］ 因此，开发 更 为 有 效、安 全 的 新 型 疫 苗 已 成 为迫切需要。
＊ Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ，Ｅ－ｍａｉｌ：ｄｉｎｇｚｈｕａｎｇ＠ｊｌｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
鸡传染性法氏囊病 （ＩＢＤ）是 由 鸡 传 染 性 法 氏 囊 病 病 毒 （ＩＢＤＶ）引 起 鸡 的 急 性 、高 度 接 触 性 杀 伤 淋 巴 细胞性传染 病，又 称 为 腔 上 囊 炎、贡 博 罗 病 等［１］，主
粒疫苗奠定基础。
１ 材料与方法
１．１ 材 料 １．１．１ 病毒 鸡 传 染 性 法 氏 囊 病 毒 超 强 株 由 吉 林 省 某 养 殖 场 分 离 ，并 由 本 实 验 室 保 存 。 １．１．２ 细 胞 Ｓｆ９ 细 胞 由 本 实 验 室 保 存 。 １．１．３ 载 体 与 菌 株 ｐＭＤ－１８Ｔ 载 体 购 自 Ｔａｋａｒａ 公 司；ｐＦａｓｔＢａｃＨＴＡ 载 体、ＤＨ５ɑ 感 受 态 细 胞、 ＤＨ１０Ｂａｃ感 受 态 细 胞 购 自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 公 司 。 １．１．４ 主要试 剂 Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ Ⅰ （１００）购 自 ＯＭＥＧＡ 公司；ＴＩＡＮｇｅｌ Ｍｉｎｉ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ购自 天根公司；ＥｃｏＲⅠ 内 切 酶、ＸｈｏⅠ 内 切 酶 购 自 Ｆｅｒ－ ｍｅｎｔａｓ；Ｘ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ ＨＰ ＤＮＡ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅ－ ａｇｅｎｔ购 自 Ｒｏｃｈｅ；Ｔ４ ＤＮＡ 连 接 酶 购 自 Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；ＴＮＭ－ＦＨ－Ｉｎｓｅｃｔ ｍｉｄｉｕｍ（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｇｒａｃｅ＇ ｓ ｉｎｓｅｃｔ ｍｅｄｉｅｍ）购 自 Ａｐｐｌｉｃｈｅｍ 公 司；ＨＲＰ 标 记 的兔 抗 鸡ＩｇＧ 购 自 Ａｂｂｋｉｎｅ公 司；ＦＩＴＣ 标 记 的 羊 抗鸡ＩｇＧ 购自北京鸿跃公司。 １．２ ＩＢＤＶ ＶＰ２ 基 因 的 克 隆 １．２．１ 引物设计 根据 ＧｅｎｅＢａｎｋ中已登录的ＩＢ－ ＤＶ 毒株 ＶＰ２基因设计扩增全长引物。