大鼠急性肺损伤中炎性因子的表达及病理损伤变化

大鼠急性肺损伤中炎性因子的表达及病理损伤变化
热依拉·牙合甫; 古丽加玛丽·阿不都拉; 范桂君; 宫蕊; 谢姆孜牙·买买提热夏提; 李瑞晟; 努尔阿米娜·铁力瓦尔迪; 买热木古·阿布都热木; 阿帕尔·卡哈尔; 哈利; 王琴【期刊名称】《《河北医药》》
【年(卷),期】2019(041)014
【总页数】5页(P2100-2103,2108)
【关键词】脂多糖; 急性肺损伤; 炎症因子; 病理损伤
【作者】热依拉·牙合甫; 古丽加玛丽·阿不都拉; 范桂君; 宫蕊; 谢姆孜牙·买买提热夏提; 李瑞晟; 努尔阿米娜·铁力瓦尔迪; 买热木古·阿布都热木; 阿帕尔·卡哈尔; 哈利; 王琴
【作者单位】830063 乌鲁木齐市新疆医科大学第二附属医院
【正文语种】中文
【中图分类】R563
急性肺损伤(ALI)在临床上是很常见的危重急症，发病时主要是由多种肺内外致病危险因子导致，是一组病理表现以血管通透性增加、透明膜形成为主要表现的炎性综合征，病死率可高达50%～70%[1-3]。

ALI的突出病理特征是肺泡内大量的蛋白堆积，这是临床研究中经常提到的一种急性肺水肿。

急性肺水肿的出现影响了肺内的气体交换，导致呼吸衰竭的迅速发生。

此外，急性肺水肿会导致肺上皮细胞毛细血管屏障的大量破坏，产生大量炎性介质[4]。

Strohmaier等[5]的研究表明中
性粒细胞流入在介导肺损伤的发挥重要作用。

肺泡巨噬细胞大部分分布在肺泡腔内，有较强分泌干扰素如白介素-1(IL-1)、IL-6、IL-8 的能力[6]。

肺间质巨噬细胞可
产生溶白三烯、酶体酶、前列腺素等炎性介质，这些介质在引发 ALI 的过程中，
也发挥一定的作用。

当肺巨噬细胞被激活，大量炎性因子随着被释放，进而刺激中性粒细胞、肺巨噬细胞等效应细胞释放大量细胞因子与炎性介质，进一步激活补体、纤溶系统和凝血过程，产生瀑布效应，最终使机体处于高动力循环、高代谢状态而导致过度炎性反应,从而引发 ALI[7]。

炎性介质在ALI和急性呼吸窘迫综合征的发
病过程中起着重要作用，其中核转录因子-κB(NF-κB)的激活是炎症级联反应的中
心环节，另外，多种炎性细胞如巨噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞释放的炎性因子也参与ALI和急性呼吸窘迫综合征的发病过程[8,9]，但笔者发现NF-κB、肿瘤坏
死因子-α(TNF-α)和白介素1β(IL-1β)在ALI/ARDS发病过程中的表达变化研究相
对较少。

本研究通过利用LPS诱导建立ALI模型，研究ALI发病过程中NF-κB、TNF-α和IL-1β的表达变化，揭示其作用机制，为ALI的临床治疗提供一定的理
论依据。

1 材料与方法
1.1 实验材料与试剂新疆医科大学实验动物中心提供的月龄为3个月的清洁型大
鼠40只[合格证号：SYXK(鄂)2013-0069]，体重(220±50) g；LPS (Sigma 公司，102M4017V，德国)；Western 印迹检测抗体:中性粒细胞弹性蛋白酶(neutrophil elastase，NE) 兔抗小鼠多克隆抗体(Abcam 公司，英国);一抗兔抗鼠NF-ΚBp65
抗体、抗辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG、DAB试剂盒及TNF-a、IL-1β检测
所用ELISA试剂盒由上海森雄科技实业有限公司生产，酶标仪和显微镜为奥地利
进口仪器。

1.2 动物模型的的制备与分组将所有大鼠随机分为2组，0.9%氯化钠溶液对照组(K组)和LPS组(L组)；造模的具体步骤为：第一步将L组中的大鼠注射0.5 ml用
0.9%氯化钠溶液稀释后的脂多糖(浓度为6 mg/kg)进行大鼠尾静脉注射，K组使
用0.5 ml 0.9%氯化钠溶液大鼠尾静脉注射。

用药后大鼠进行自由活动，随机选取注射后的大鼠，并分别于给LPS和0.9%氯化钠溶液后不同时间点2、4、8 h处死动物，除0 h处死4只外，每个时间点处死6只大鼠，用于后续实验取材。

1.3 实验方法
1.3.1 取材方法：处死动物并结扎右肺，然后暴露气管行气管插管，以大鼠体重10%剂量的0.9%氯化钠溶液进行3次支气管肺泡灌洗，回收率需≥70%，2 000×g离心10 min，取上清液，-80℃冰箱备用。

取大鼠右肺下叶，支气管插入6G套管针，注入10%中性甲醛致肺叶僵固，将其浸泡在10%中性甲醛液中固定，3 d后切片，HE染色后光镜下观察。

另取大鼠右肺上叶、中叶置入EP管放入液氮中用于检测NF-κB。

1.3.2 标本检测方法对右下肺组织HE染色，方法如下：分别取正常大鼠、模型组大鼠、注射LPS 2 h后大鼠模型组大鼠、注射LPS 4 h后大鼠模型组大鼠、注射LPS 8 h后大鼠模型组的新鲜肺组织(
2.0 cm×2.0 cm×0.3 cm)，切取组织时使用
锋利刀剪谨防切割时来回锉动，夹取标本时忌挤压，根据病变部位严格按病理标
本取材要求规范取材，根据器官组织结构确定切面走向，保证切取组织表面清洁保持组织原有形态， 4%中性甲醛溶液对组织进行固定，再用梯度乙醇对组织进行
脱水，二甲苯置换乙醇后浸蜡，石蜡包埋，修整蜡块、切片、贴片，烘烤脱去石蜡。

二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱苯、水洗、苏木素染色、水洗、盐酸乙醇分化，水
洗返蓝，伊红染色，梯度乙醇脱水、透明、中性树胶封固。

采用徕卡 TP1020 组
织脱水机以及 BX51 型显微镜，与其同时，要采用切片机仪器设备与病理科的图
文系统开展工作。

200×光镜下观察，Arold评分方法对肺水肿、肺泡及间质的炎
症和出血情况及肺不张和透明膜形成程度分别进行0～4分的半定量分析，以评估肺损伤的程度。

具体为：无损伤0分，病变范围<25%为1分，病变范围25%～
50%为2分，病变范围51%～75%为3分，病变满视野为4分；总肺损伤评分为前述各项之和。

每只大鼠选取观察10个高倍视野，取平均值。

阅片时要求有两位病理科医师，均分别先以单盲法评分，最终结果取平均分。

1.3.3 肺组织NF-κB提取：肺将冷冻肺组织与液氮一起碾磨；放入组织匀浆器，
加入5 ml细胞裂解液，碾棒碾磨，移至4皿试管，2 000 r/min离心，时间>30 s以彻底清除碎组织；将其上清液干冰中孵育5 min，后5 000 r/min离心5 min，取沉淀；核团重悬于100 μl胞核裂解液中，震荡15 s。

干冰中孵育30 min，溶
解的核移至微离心试管，14 000 r/min离心2 min，使细胞碎片聚集成团；液氮
速冻，-80℃下保存备用。

1.3.4 肺组织NF-κB测定：采用Western blot法。

以4 μg蛋白泳道上样，经10%SDS-PAGE电泳分离后，电转移到PVDF膜上，3%BSA封闭液封闭4 h，后加入一抗兔抗鼠NF-ΚBp65多抗及抗辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG进行杂交，DAB试剂盒检测杂交信号，并显影于X线(柯达)感光胶片上。

Bandscan图像分析系统对Western blot目的条带扫描后分析，结果用积分灰度值计算，表示NF-κB p65蛋白的相对表达。

1.3.5 支气管肺泡灌洗液中TNF-α和IL-1β的ELISA测定：小鼠支气管肺泡灌洗
液的方收集法如下:①小鼠腹腔注射水合氯醛(400 mg/kg),使小鼠快速过量麻醉致
死将处死的小鼠仰卧位置于解剖盘(蜡盘)上,图钉固定四肢末端。

②用70%乙醇消
毒小鼠颈部皮肤,沿颈部正中线纵行切开1.0 cm皮肤,切口下缘至胸腔入口处; 用止血钳钝性分离皮下结缔组织和肌肉,暴露气管;分离气管两侧及气管与食管间结缔组织,游离气管; 穿两根约 20 m长外科缝线于气管食管之间。

③术者左手持眼科镊,夹住小鼠气管环状软骨远端气管,提起气管至略呈弧形; 术者右手持24G静脉留置套
管针,以30°角从甲状软骨与环状软骨间结缔组织膜处进针,朝气管隆突方向送静脉
留置针,进入气管约3 mm;左手放下眼科镊,改握住静脉留置针尾端针翼,右手拔出留
置针不锈钢针芯; 左手使套管针以与气管平行的方向,轻柔缓慢向气管隆突方向递送,如有可感阻力,提示遇到气管隆突,此时应将套管向后退2～3 mm。

④将置于气管食管间的手术缝线拿起,分别在套管进入气管处套管远端处结扎,尽可能扎紧以固定套管和气管。

⑤以1 ml注射器抽吸0.8 ml 0.9%氯化钠溶液,接在静脉套管针进液端,将生理盐水缓缓注入气管,停留30 s后将0.9%氯化钠溶液缓缓回抽,可见回抽出带乳白色泡沫状液体,重复灌洗3次,最后可回抽出0.6～0.7 ml 0.9%氯化钠溶液,转移至 EP管中;重复以上步骤2次收到小鼠支气管肺泡灌洗液采用双抗体夹心酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测支气管肺泡灌洗液中 TNF-α 和 IL-1β 的含量。

1.4 统计学分析应用SPSS 17.0统计软件，计量资料以表示，采用单因素方差分析方差齐性，使用LSD法进行检验后多重比较，P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果
2.1 肺组织的病理学变化
2.1.1 对大鼠在注射LPS和0.9%氯化钠溶液后进行观察，发现N组大鼠在注射到实验结束时一般情况良好，活动、食量和呼吸均正常，同时对外界刺激的反应也正常，而L组中大部分反应正常，在注射LPS 4 h后有少数出现蜷缩少动，反应略显迟钝的现象，呼吸明显加快，饮水量也明显减少。

为了进一步对大鼠肺组织进行观察，分别在注射后2、4、8 h对2组大鼠的肺组织进行取样固定，在取样过程中首先通过肉眼对2组的肺组织进行大体观察，观察总体发现K组大鼠两肺成均匀的粉白色，表明光滑，没有出现灶和肿胀现象，而L组大鼠出现程度不一的两肺肿胀充血，特别是在注射8 h组的大鼠肺部出现一些出血点，并且肺表面渗出液较多。

2.1.2 为了进一步将2组中的肺组织进行观察，将K组和L组在光学显微观察，结果发现2组在肺组织损伤程度上有较大差异，K组肺泡间隔未见明显增厚，仅见少量炎性细胞，肺泡结构完整，肺泡腔清晰，也未见透明膜的形成，而L组肺泡毛
细血管显示充血扩张，肺间质和肺泡间隔明显增宽，随处理时间延长，炎性水肿程度增加更加明显，并出现大量炎性细胞浸润。

在注射LPS 4 h后，可以发现肺泡间隔明显加厚，见到大量炎性细胞浸润，有部分红细胞渗出，同时有小部分肺泡腔出现塌陷，并且可见部分肺泡腔内有透明膜出现，在注射8 h后，肺泡间隔增厚已经较为明显，有很多炎性细胞浸润及红细胞漏出的现象。

通过以上现象可以看出，LPS处理后可以引起肺组织损伤，肺组织损伤建模较为理想。

见图1。

2.2 2组肺损伤中NF-κB p65蛋白定量分析通过Western blot对肺损伤模型中NF-κB p65蛋白进行定量分析，通过定量分析表明，L组中各时间点NF-κB含量明显高于K组中各时间点，在L组中随着注射时间的延长，NF-κB含量也明显升高。

见表1。

正常大鼠
模型组大鼠
注射LPS 2 h后大鼠
注射LPS 4 h后大鼠
注射LPS 8 h后大鼠图1 大鼠肺显微结构损伤变化(HE×40)
表1 2组大鼠组织NF-κB蛋白定量分析
组别时间点2 h4 h8 hK组0.67±0.130.71±0.080.68±0.09L组
0.88±0.11*1.18±0.28*#1.47±0.32*#△
注：与K组比较，*P<0.05；与2 h比较，#P<0.05；与4 h比较，△P<0.05 2.3 2组支气管肺泡灌洗液中TNF-α定量分析 L组与K组相比，L组各时间点TNF-α均高于K组各时间点(P<0.05)，LPS注射2 h后TNF-α即迅速达到高峰，此后有所下降，但是注射8 h后仍高于K组(P<0.05)。

见表2。

表2 2组支气管肺泡灌洗液中TNF-α(pg/ml)蛋白定量比较
组别时间点2 h4 h8 hK组3.85±0.674.54±0.434.32±0.38L组
198.25±4.35*148.00±2.65*#118.00±4.95*#△
注：与K组比较，*P<0.05；与2 h比较，#P<0.05；与4 h比较，△P<0.05
2.4 2组支气管肺泡灌洗液中IL-1β定量分析 L组各时间点IL-1β浓度高于K组各时间点(P<0.05)，IL-1β在注射2 h后即迅速升高，随着时间推移进行性升高，在注射8 h后达到最高。

见表3。

表3 2组支气管肺泡灌洗液中IL-1β(pg/ml)蛋白定量比较
组别时间点2 h4 h8 hK组2.31±0.572.18±0.182.25±0.49L组
14.32±0.78*18.43±0.66*#25.46±0.35*#△
注：与K组比较，*P<0.05；与2 h比较，#P<0.05；与4 h比较，△P<0.05
3 讨论
ALI是由多种肺内外致病危险因素导致的，是一组主要病理表现为血管通透性增加、透明膜形成的炎性综合征[10]。

ALI具体是由多种致病因素引起的由炎性细胞释放炎性因子所介导的肺内过度性、失控性炎性反应，ALI的恶化阶段即为ARDS，其病死率高达30%～50%[11,12]。

LPS一旦侵入机体，可以引起一系列级联放大病理反应，其诱发的炎性因子对组织细胞的损害往往大于LPS本身对机体的直接影
响[13,14]，本研究通过注射LPS成功复制了肺损伤模型，在注射LPS 4 h后有少
数出现蜷缩少动，反应略显迟钝的现象，呼吸明显加快，饮水量也明显减少，而注射0.9%氯化钠溶液组大鼠一般状态变化不大。

本研究发现，LPS注射4 h后出现肺损伤，8 h后肺损伤已较为明显，肺泡间隔增厚已经较为明显，有很多炎性细胞浸润及红细胞漏出的现象，结合注射后大鼠的一般情况和状态改变、肺组织病理学检测结果及变化规律，证实本研究中成功复制了大鼠肺组织损伤模型。

NF-κB活化后可以诱导免疫、炎性反应等有关的多种基因转录过程，如TNF-α、
IL-1、IL-2、IL-6、IL-8等细胞因子，单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)，而且随着体
内炎性因子的增多，NF-κB可以进一步被激活，如此形成恶性循环，炎症级联反
应也随着被放大[15,16]，本研究结果表明，NF-κB在LPS刺激2 h内即可被激活，在6 h后达到最高峰，并且L组各时间NF-κB表达均高于K组(P<0.05)，这除了与LPS激活外，可能与TNF-α等产生进一步激活NF-κB有关。

当机体收到创伤、感染、休克等刺激时会激活单核/巨噬细胞系统，促使其释放促
炎因子，其中TNF-α和IL-1β是主要的快速反应促炎介质，往往在刺激2～6 h
内即可迅速达到高峰，是启动促炎和抗炎瀑布级联反应的最上游介质[17-19]。

IL-
1β又名淋巴细胞活化因子、前炎性反应细胞因子。

在炎性反应的发生发展的病理
生理过程中，IL-1β发挥着至关重要的作用[20]。

TNF-α仅是始动因素，IL-1β则
起到协同作用。

有研究发现IL-1可显著减少IL-1气管内滴入引起的灌洗液中性粒细胞增加、减轻血浆白蛋白在肺内的漏出和肺水肿形成[21]。

刘凯等[22]的研究发现气管内滴入IL-1后4 h，肺支气管肺泡灌洗液中中性粒细胞心数目和超氧阴离
子含量显著增加，他们与我们的研究结果相同。

本实验在成功建立了大鼠肺组织损伤模型后对TNF-α和IL-1β的含量进行了动态
分析，结果表明注射LPS后TNF-α和IL-1β的含量在2 h内即迅速升高，这说明TNF-α和IL-1β参与肺组织损伤过程。

但是本实验仅对NF-κB、TNF-α 和 IL-1β
进行了检测，对其调控途径的探究不是很深入，在以后的实验中会进一步对其调控途径进行研究。

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