胡萝卜愈伤组织培养

验名称 胡萝卜的愈伤组织诱导培养 实验时间 4月至6月
小组合作： 是○√ 否○
一、实验预习 1、实验目的：
1.1通过本次实验，能够熟练准确配制培养基，并能根据实验目的设计适合的培养基配方。

1.2熟练掌握外植体的表面消毒技术和无菌操作技术，同时能设计和配制胡萝卜伤组织增殖培养基。

1.3熟练掌握愈伤组织继代培养的基本操作技术，进一步熟悉、规范无菌操作技术；设计和配制胡萝卜细胞悬浮培养的培养基。

2、实验准备：
2.1 MS 母液培养基的配置 主要实验用具和仪器：
电子天平、烧杯、容量瓶、细口瓶、药勺、玻璃棒、电炉。

药品：
NH 4NO 3、KNO 3、CaCl 2·2H 2O 、 MgSO 4·7H 2O 、KH 2PO 4、KI 、H 3BO 3、MnSO 4·4H 2O 、 ZnSO 4·7H 2O 、Na 2MoO 4·2H 2O 、 CuSO 4·5H 2O 、CoCl 2·6H 2O 、FeSO 4·7H 2O 、 Na 2-EDTA ·2H 2O 、肌醇、烟酸、盐酸吡哆醇(维生素B6)、盐酸硫胺素 (维生素B1)、甘氨酸。

2.2胡萝卜愈伤组织诱导培养培养基的配置 主要实验用具和仪器：
冰箱、普通天平、三角瓶、移液管、量筒、烧杯、容量瓶、玻璃棒、医用口杯、精密pH 试纸（pH5.4~7.0）、药勺、称量纸、标签纸、封口膜、橡皮筋、电炉、高压蒸汽灭菌锅等。

药品和试剂：
MS 培养基母液、琼脂、蔗糖、生长调节物质、蒸馏水、1mol ·L-1HCl 、1mol ·L-1NaOH
2.3胡萝卜愈伤组织诱导 主要实验用具和仪器：
100ml 三角瓶、500ml 搪瓷杯、25ml 量筒、10ml 和5ml 吸管、pH 试纸（5.4~7.0）、封口膜、扎口用棉线、药勺、称量纸、酒精棉球、小块纱布、已灭菌滤纸、枪状镊子、手术剪、解剖刀、已灭菌培养皿、酒精灯等。

药品和试剂：
MS基本培养基母液、愈伤组织诱导培养基、蒸馏水、无菌水、75％酒精、蔗糖琼脂、NAA、6-BA、水解酪蛋白、1mol/LHCl、1mol/LNaOH、0.1%HgCl2。

实验材料：
胡萝卜肉质质根（贮藏根）
2.4 胡萝卜愈伤组织的继代培养
主要实验用具和仪器：
酒精棉球、小块纱布、已灭菌培养皿和滤纸、枪状镊子、眼科手术剪、手术刀、酒精灯、 100ml三角瓶、500或1000ml搪瓷杯、50ml量筒、1ml、2ml、5ml、10ml吸管、精密pH试纸（5.4~7.0）、封口膜、橡皮圈、药勺、称量纸等。

药品和试剂：
愈伤组织继代培养基、75％酒精、MS培养基和常用试剂母液、蒸馏水。

实验材料：
处于脱分化进程中的外植体。

3、实验原理：
配制培养及时，为了使用方便和用量准确，通常采用母液法进行配制，即将所选培养基配方中各试剂的用量，扩大若干倍后再准确称量，分别先配制成一系列的母液置于冰箱中保存，使用时按比例吸取母液进行稀释配制即可。

愈伤组织诱导的成败关键主要不是外植体的来源和种类，而是培养条件，其中激素的种类和浓度最为重要。

诱导愈伤组织常用的生长素是2，4-D，IAA和NAA，常用的细胞分裂素是KT和6-BA。

愈伤组织形成的过程分为3个时期：诱导期、分裂期、分化期（形成期）。

愈伤组织的生长是发生在不与琼脂培养基接触的表面。

4、实验方法步骤：
4.1 MS母液培养基的配置
配置过程以课本33页的配方图为标准
4.11大量元素的配置(CaCl2·2H2O要在最后单独加入)
用量=放大倍数*体积*培养基中的浓度
n=20 v=1L
4.12微量元素的配置(Fe单独配置)
N=200 v=1L
4.13有机成分的配置（单一母液）
N=200 v=250ml
4.14铁盐母液的配置
螯合态的铁，混合煮沸PH=5.8-6.2(用NaoH2调)
4.15生长调节物得配置
2-4-D：0.5mg/ml v=100ml
6-BA:0.1mg/ml v=100ml
NAA:0.5mg/ml v=100ml
注：不能直接加入水中，可先用酒精或NaoH2溶解2-4-D或NAA,用盐酸溶解6-BA.
4.16其他常用试剂
75%酒精
4.2胡萝卜愈伤组织诱导培养培养基的配置
组织增殖培养基的配制
配方：
MS基本培养基+ 2 mg/LNAA +0.1 mg·L—16—BA + 200 mg·L—1水解酪蛋白+ 3%蔗糖+ 0.7%琼脂粉
配制体积：各小组500ml(两个组配1000ml)
即大量元素:50 ml; 微量元素：5 ml; 有机物成分：5 ml; 铁盐：5 ml; 2 mg/L NAA：2mg(2ml); 0.1 mg·L—16—BA:0.1mg (1ml); 200 mg·L—1水解酪蛋白:200mg; 蔗糖:30g; 琼脂：7g
配制流程：
(1)根据需要配制培养基的量（各小组500ml）称好所需的琼脂放入医用口杯中，
(2)待琼脂完全溶解后，加入规定用量的母液（可事先取好放在一烧杯中），再加入规定用量的蔗糖，继续加温并不断搅拌，待琼脂煮透后端离火源，根据培养基配方及培养基体积加入所需的生长调节物质，定容至所需的体积，并用玻棒搅拌均匀。

（3）调节培养基的酸碱性至PH5.8。

由于培养基的PH值直接影响到培养物对离子的吸收，因而过酸或过碱都对植物材料的生长有很大的影响。

此外，PH还影响到琼脂培养基的凝固情况。

所以，当培养基配制好后应立即进行PH值的调整。

培养基若偏酸时用氢氧化钠（1mol·L-1）来调节，若过碱就用盐酸（1mol·L-1）来调整。

当PH值高于6.0时，培养基将会变硬；当PH值低于5.0时5.0时，琼脂不能很好地凝固。

（4）配制好的培养基要趁热分装，试管、三角瓶等培养基的容器加注量应占容积的1/3~1/4，果酱瓶每瓶20~30毫升，太多既浪费培养基，又减少了培养材料的生长空间；太少又会因营养不良影响生长。

培养基分装完，用封口膜封严瓶口，并用橡皮筋扎紧。

（5）培养基的灭菌消毒
灭菌时，压力表读数为0.11MPa,温度121℃时保持30分钟左右即可。

为了保证灭菌彻底，在蒸气灭菌锅增压之前应先将灭菌锅内的冷空气放尽。

排净冷空气的方法：可事先打开放气阀，煮沸等大量热蒸汽排出后再关闭；也可采用先关闭放气阀，待压力升到一定时打开放气阀排出空气，再关闭放气阀。

4.3 胡萝卜愈伤组织诱导
4.31准备工作
A．接种室的清洁和消毒；超净工作台的开机和消毒；消毒溶液、无菌水、装材料的容器、剪刀、镊子、培养皿、计时器、待用培养基等的准备。

B．实验材料的准备
第一步：材料的修整、刷洗、冲洗。

第二步：是用洗衣粉水或肥皂水浸洗并搅动。

4.32植物材料表面的灭菌
A．工作人员吸收消毒
B．装材料的容器及玻璃棒用酒精进行表面消毒
C．将待消毒材料浸入75%酒精中10秒，取出用无菌水冲洗
D．倒入消毒液并计时
E．到时倒出消毒液
F．倒入无菌水清洗后，切块接种到培养基上
4.4胡萝卜愈伤组织的继代培养
4.41准备工作
接种室的清洁和消毒；超净工作台的开机和消毒；剪刀、镊子、已灭菌培养皿和滤纸、待用培养基等的准备；实验材料的准备（选择装有无污染的已分化出愈伤组织的外植体的三角瓶摆放于超净工作台）
4.42 愈伤组织继代培养
将上次接种在愈伤组织诱导培养基中的无污染的外植体上产生的愈伤组织剥离转接到愈伤组织继代诱导培养基上，放置在25 0C全黑暗条件进行愈伤组织的增殖培养，以获得足够的愈伤组织，作为后续实验的实验材料
5、参考文献
[1].植物组织培养.李浚明.中国农业大学出版社.第二版.2004.
二、实验内容
1、实验结果
进行胡萝卜愈伤组织诱导，共诱导6瓶，最终实验结果得到：6瓶诱导中，只有两瓶成功诱导，并且长势良好，其余四瓶均被细菌污染；
进行愈伤组织继代培养，共培养5瓶，均成功，长势较好，但是由于继代培养时间过长，愈伤组织已经出现死亡，其中瓶内培养基数量少的愈伤组织，死亡情况更明显。

2、实验结果分析与讨论：
进行胡萝卜愈伤组织诱导，培养成功两瓶，其余均被细菌污染。

其原因可能是在无菌操作过程中，没有保持培养瓶封口膜的无菌条件，最终造成污染；
在进行愈伤组织几代培养中，均获得成功，没有背污染，但是愈伤组织出现不同程度的死亡，究其原因为：愈伤组织继代培养中，愈伤组织生长需要大量的营养，由于培养时间过长，培养基中的营养成分及水分不能满足愈伤组织的继续生长和生活，故出现死亡。

三、实验小结
1、本次实验的自我评价：
本次实验，在愈伤组织诱导环节中，由于在无菌操作过程中的不谨慎，造成了污染，只获得两瓶成功的胡萝卜愈伤组织，在继代培养中，所有的愈伤组织培养均成功，说明自己在进行无菌操作时，还需要认真和谨慎。

2、教师评语及评分：
签字年月日。