[理学]黄牛mtDNAcytB进化分析-综合实验

黄牛血样的采集
• 颈静脉采血/尾静脉采血 • 准备物品：灭菌的5-10ml管、灭菌针头18号、剪毛剪、酒
精棉球75%、抗凝剂（肝素/EDTA/ACD）
DNA样品的制备及检测
PBS缓冲液洗3次，12 000 r/m离心10 min (4℃)，至沉淀呈淡黄色 加入DNA抽提缓冲液，混匀，37℃水浴1 h 蛋白酶K，混匀，55℃过夜至澄清 反应液冷却至室温，加Tris-饱和酚，混匀20min；4℃，12000 r/m离心10 min ，取上清；重复1次 加氯仿，混匀20min，4℃，12000 r/m离心10 min，取上清；重复1次 加氯仿和异戊醇混合液，混匀20min，4℃，12000 r/m离心10 min，取上清； 加NaAc缓冲液及冰冷的无水乙醇，混合转动出现浑浊到白色絮状沉淀， 20℃保存30 min～60 min； 4℃，12000 r/m离心10 min，弃上清液， 70%的冷乙醇漂洗DNA沉淀2次； 4℃，12000 r/m离心10 min，弃上清液，室温下使乙醇挥发干净，约3～4 h； DNA溶于80～100 µL的TE液，4℃保存直至DNA完全溶解。
PCR反应程序： 94 ℃预变性4 min 94 ℃变性30 s 5 ℃退火30 s 72 ℃延伸1 min （循环30-35次） 72 ℃充分延伸7 min 4 ℃保存
• Bio-Rad的MyCycler
PCR产物检测-琼脂糖凝胶电泳法
1.0%琼脂糖凝胶电泳 原理：片段大小不同的DNA 片段在琼脂凝胶中沿负极向 正极运动，其电泳速率不同 。
实验要求
• 注意安全 • 必须穿着实验服 • 严禁大声喧哗 • 以小组为单位，充分体现互助协作 • 注意实验室的卫生 • 写作综合实验报告(上交纸质版和电子版)：下学期
第一学期末收齐上交（以班为单位）。
引物(primers)设计：primer primer5.0
扩增引物： 正 链引物L14724B：
5′-CGAAGCTTGATATGAAAAACCATCGTTG-3′; 反链引物H15915R：
5′-GGAATTCATCTCTCCCGGTTTACAAGAC-3′。 测序引物：L15408：5´-ATAGACAAAATCCCATTCCA-3´。
中国黄牛mtDNA cyt b基因 分子进化分析
• 文献研究分析引入 • 本实验流程介绍 • 实验要求文献 Nhomakorabea究分析引入
本实验流程介绍
• 黄牛血样/组织样品的采集 • DNA样品的制备及检测 • 引物(primers)设计：primer primer5.0 • PCR反应液制备 • PCR反应及PCR产物检测 • PCR产物的凝胶回收(产物不好的情况下) • DNA序列测定 • DNA序列的进化分析
制作：
称取适量的琼脂糖粉0.2g， 量取25ml电泳缓冲液（0.51.0ΧTBE），混匀；电热套上 加热至沸腾至均匀；拿出凉 至约60 ℃（手背感觉不太烫 ），加1.0μLEB溶液，混匀； 迅速倒入胶槽（如有气泡将 气泡赶出）；凝固约30min， 点样，80-100V电泳约1h。凝 胶成像系统拍照。
同学自己可以从NCBI中的GenBank中下载自己感兴趣的基因 设计引物，也可以利用NCBI的在线引物设计软件。Just try！
PCR反应液制备与反应
ddH2O Primer1 Primer2 Golden Easy Polymerase 2ΧReaction Mix DNA Template
10.2μL 0.5μL 0.5μL 0.3U 12.5μL 1.0μL
• Marker • 已知大小的DNA片段或蛋白质，在相
同的条件下电泳，这些片段可以作为 参照物来计算位置片段的大小。
DNA序列测定及分析
• 得到PCR产物后将其送到公司序列测定
• 序列分析可以用很多软件，如Clustal、MEGA、DNAStar等 。
• 该部分分析工作希望大家自己完成，提供相关文献、软件 、说明书；大家可以相互一起研究软件的使用，可以借助 Internet。