分子诊断技术临床应用进展

分子诊断技术临床应用进展-标准化文件发布号：（9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII

分子诊断技术临床应用进展

张健（上海市临床检验中心，200126）

摘要：分子生物学的快速发展，使分子诊断技术进入常规临床实验室的应用技术，越来越多的分子诊断实验项目应用于疾病的诊断、治疗监测和预后判定。不同的分子诊断方法具有不

同的临床应用范围，本文根据分子诊断技术特征，按照杂交、扩增和测序三种技术特征，

对近期分子诊断技术的发展及其在临床应用方面的进展做一综述。

关键词：分子诊断荧光原位杂交聚合酶链式反应基因测序高通量

狭义的分子诊断（molecular diagnosis）是基于核酸的诊断技术，通过对DNA和／或RNA的检测来实践对疾病的检测和诊断。但是，随着第一张人类基因组测序图的完成，以及由此而带来的基因组学、蛋白组学、代谢物组学等新兴学科的发展，分子诊断的内涵已经从单纯的DNA/RNA拷贝、突变等变化的检测，拓展到核酸与DNA片段、蛋白与多肽、抗原与抗体、受体与配体等生物大分子的检测，并广泛应用于疾病的筛查、诊断、治疗监测、预后与预防等生命科学的各个领域［1］。当然，分子诊断学的快速发展，得益与分子诊断技术的日新月异。1990年启动的人类基因组计划的完成经历了十三年的时间，而2007启动的1000人基因组计划的完成却只用了3年［2］，人类了解自然密码的速度正在跨上快速列车。检验医学以提供精密准确的数据服务于临床，而分子诊断技术正逐渐成为成为常规临床实验室的应用技术，这将为检验医学的发展提供巨大的机遇与挑战。本文将根据分子诊断技术特征，按照杂交、扩增和测序三种技术特征，对近期分子诊断技术的发展及其在临床应用方面的进展做一综述。

一、基于分子杂交为基础的分子诊断技术发展及其应用

两条同源核酸分子（DNA或RNA）可以在碱基互补的原则下形成异质双链是遗传物质最重要的化学特征，这一过程亦被称为分子杂交（molecular hybridization）。分子杂交是所有分子生物学技术的基础，从最初的印迹杂交（southern Blot和northern Blot）到实时PCR（real time PCR），从基因芯片再到高通量的DNA测序技术，都离不开碱基互补的分子杂交反应。而且在理论上可以特异性相互作用的两个不同分子，例如核酸与核酸之间（A-G、G-C）、蛋白与蛋白之间（抗原和抗体）甚至核酸和蛋白之间（适体与多肽）的相互作用都可以视为分子杂交的不同表现模式。因此，广义的分子杂交技术是指以核酸、蛋白、糖基以及细胞、代谢物等分子的相互作用所建立的分析方法。目前临床应用的以分子杂交技术为基础的诊断技术繁多，缺乏统一的分类方法，但是可以根据实验方法的差异分为主要的两种类型，一类是通过特异性的标记探针检测检测细胞内的核酸物质，而另一类是通过探针检测从细胞内提取的核酸、蛋白等物质，前者以原位杂交及其衍生的技术为主，后者以生物芯片及其衍生的技术为主。1、原位杂交技术（in situ hybridiztion，FISH）的发展与临床应用：

原位杂交应用特异性的探针检测细胞内的核酸需要标记分子显示杂交信号，1960s年代的检测技术是放射性核素标记，但是信号检测程序复杂并且可能存在放射性物质的污染，而荧光物质标记可以通过显微镜直接观察实验结果，因此荧光标记的原位杂交技术（Fluorescent in situ hybridiztion，FISH）

一经出现立刻取代了放射性标记的技术，成为应用最广泛的分子杂交技术。FISH技术通过荧光标记探针，可以可视化的检测人类细胞或组织中特定基因的数量及其定位，是分子杂交与细胞遗传学技术的结合。IFSH技术的分析过程分为四个步骤，核酸变性、探针变性、杂交及信号检测。因此，针对探针标记、染料开发和图像分析的技术的更新是FISH分析技术发展的主要路径。首先是荧光染料的应用，从最初的单色FITC应用，发展到使用多种荧光染料的多色FISH技术（multicolor－FISH，1996）［3］，既多元荧光原位杂交（Multiplex－FISH，M-FISH）［4］和光谱核型分析技术（Spectral karyotying，SKY）［5］，使用五种染料（Rhodamine, Texas-red, Cy5, FITC, and Cy5.5）标记的探针可以在一次试验中定位多种不同的基因以及使用不同的颜色标记显示24条不同的染色体。其次，在探针方面，为了更精细和高分辩的显示染色体结构和基因的探针，染色体臂、着丝粒、端粒特异的探针被先后开发应用，而且应用微切割技术切割技术制备亚区域探针（microFISH），使FISH的基因定位和分辩率大大提高［6］。同时，探针标记对象和标记技术的发展不断衍生出新的FISH技术，例如比较基因组杂交（comparative genomic hybridization，CGH）、引物原位标记技术（Primed In Situ Labeling ，PRINS））、肽核酸探针原位杂交（PNA-FISH）、物种交叉荧光原位杂交（Rx－FISH）、纤维原位杂交（Fiber FISH）等［7］。在图像与信号分析方面，应用高分辨率CCD摄像机和计算机自动图像分析系统获得广泛应用，M-FISH分别为5种荧光染料分别成像，而SKY结合傅立叶频谱技术，同时计量可见光和近红外范围内的所有点的发射频谱而一次成像。

目前FISH技术是基础科学研究得到广泛应用，但在临床诊疗中的应用主要集中在产前诊断、血液肿瘤诊断、感染性疾病诊断及实体肿瘤的诊断和药物靶向性治疗等领领域。在产前诊断方面，FISH主要用于染色体数目异常的诊断，其与常规核型分析的一致性可以达到99.5％，但结果报告时间只需要24小时，大大低于核型分析的平均2周左右的报告时间，FISH在多数的发达国家已经批准为常规产前筛查辅助诊断技术［8］。在血液肿瘤的诊断方面，FISH用于染色体异位的融合基因检测、基因缺失检测、微小残留病灶监测、骨髓移植监测等。在感染性疾病检测方面，FISH检测痰液标本中铜绿假单饱菌、流感嗜血杆菌等常见菌的敏感性可以达到90％，特异性100％［9］。对于军团菌、幽门螺旋杆菌和结核杆菌等较难培养鉴定的细菌，FISH在快速诊断上也显示了很好的应用前景［10］。在实体肿瘤的应用中，FISH可以检测任何组织类型的染色质和基因的异常，广泛应用于肺癌、乳腺癌、膀胱癌、宫颈癌等实体肿瘤的肿瘤的辅助诊断，疗效检测、个体化治疗和预后判断。特别是在肿瘤的个体化治疗方面，FISH是药物个体治疗患者筛查的主要方法之一，用于药物靶向性基因表达状态的检测。在乳腺癌治疗药物曲妥珠单抗(赫赛汀)治疗有效性患者筛选中，FISH被认为是检测HER2基因表达状态的金标准［11］。

2、生物芯片技术的发展与临床应用

生物芯片（Biochip）是通过微加工技术和微电子技术将大量特定序列的寡合苷酸片段、抗原/抗体，甚至细胞或组织等生物大分子，按照矩阵方式高密度的固定或直接合成在玻璃、硅片、聚丙烯、磁性微球等固项支持物上，或者整合微流体技术以及微电级、为传感器等制备的类似于电子行业的芯片样产品的检测技术。固化的探针分子与荧光标记的相应样本进行杂交，通过荧光检测系统扫描分析及计算机软件分析，达到高通量分析生物信息的目的。生物芯片技术可以根据功能的不同分为微阵列芯片（Microarray chip）、微流控芯片（Microfluidics）和芯片实验室（LAB-on-chip, LOC）［12］。早期的微阵列芯片（Microarray）单指基因芯片（gene chip，DNA chip），但随着蛋白芯片（protein chip）