分子诊断的临床应用

分子诊断的临床应用

基因分析，即基因诊断 ( Gene Diagnosis )：是利用DNA 分析技术直接从基因水平 ( DNA or RNA ) 检测遗传病的基因缺陷。

这种方法和传统的诊断方法主要差别在于直接从基因型推断表型，可以越过基因产物，直接检测基因的结构而作出诊断，改变了传统的表型诊断方式，所以又称为逆向诊断 ( Reverse Diagnosis )。

基因诊断的优点：

材料容易获得，不受细胞类型的限制；

不受基因表达的时空限制。

不受年龄的限制；

可以于发病前做出诊断；

方便有效，迅速准确，携带者也可以有效检出。

基因诊断的难点：对大多数疾病尚未找到合适的基因诊断方法，另外由于遗传异质性、基因突变的多样性，一种基因诊断方法对同一疾病往往有很大差异。

基因诊断的对象：一般是指单基因病和某些有主基因改变的多基因病。

至1997年，发现人类单基因病遗传病已达8587种，现已达到15988种

进行基因诊断必须具备的条件：

(1)致病基因的染色体定位已明确

(2)致病基因的结构、顺序与突变性质巳清楚

(3)致病基因与DNA多态存在连锁关系

根据所具备的条件选择适合的基因诊断技术

基因诊断方法

目前常用的基因诊断方法:

(1)聚合酶链反应DNA扩增法

(2)限制性酶谱Southern印迹杂交直接分析法

(3)限制性片段长度多态性(RFLP)连锁分析法

(4)寡核苷酸探针(oligonucleotide probe)检测法

(5)DNA测序

(6)基因芯片

一、基因检测在感染性疾病中的应用

（一）肝炎病毒基因的检测

1、临床价值主要体现在：

病情评估

血清中病毒含量的多少与肝脏病理损害程度相关，病毒载量越高，肝组织炎症反应程度越重。

疗效预测

治疗前病毒核酸载量越高，疗效越差；载量越低，机体清除病毒的可能性越大。预后判断

病毒核酸载量持续处于高浓度者预后不良。

垂直传播途径感染者，预后较差。

反映肝细胞损害的其它指标正常，但病毒核酸

水平经常波动者更易发展为肝硬化。

2、乙肝HBV-DNA定量检测的临床诊断意义

荧光定量PCR:为乙肝病毒的检测诊断提供了新手段，大量临床标本测定结果证明，其特异性为100％，灵敏度可达0.01fg（10-12mg），相当于2.5个乙肝病毒颗粒。荧光定量PCR对下列情况更具有独特的诊断价值：

1）.治疗前进行病毒定量检测，可以指导选择对症药品，避免盲目用药。

2）.治疗后定量PCR可直接准确地测定体内病毒数量，有助于疗效的判断。3）.怀孕前进行定量PCR测定，有助于选择有利的怀孕时机。乙肝孕妇进行定量PCR检查，有助于使部分病人得到及时、正确的诊断。

所以说HBV-DNA定量检测指标降低在乙肝治疗中有着非常重要的意义，是乙肝转阴的前奏，也是康复最为关键的一步，只有体内的HBV-DNA定量指标降低，病毒的复制繁殖才会停止，乙肝的彻底治愈才有希望。

一般以定量检测103copies/ml以下为阴性，以上为阳性。阳性提示体内病毒复制活跃，血液中含量高，传染性较强；阴性则相反，病毒复制已得到抑制，血液中含量底，传染性弱。

目前我国正在使用抗乙肝病毒药物包括干扰素类和核苷（酸）类似物，这两大类药物各有其优缺点。前者的优点是疗程相对固定，乙肝病毒e抗原和e抗体血清学转换率较高，疗效相对持久，耐药变异较少，其缺点是需要注射给药，不良反应较明显，不适于肝功能失代偿者。后者的优点是口服给药，抑制病毒作用强，不良反应少而轻微，可用于肝功能失代偿者，其缺点是疗程相对不固定，乙肝病毒e抗原和e抗体血清学转换率低，疗效不够持久，长期应用可产生耐药变异，停药后可出现病情恶化。

2、病毒分型和耐药检测

各个编码区段存在着大量有意义的自然变异或药物诱导的变异，并由此产生不同的变异株，从而导致 HBV感染的不同血清学和临床表现。

检测HBV的变异株对了解疾病机制、药物耐受和指导用药有一定的价值。

根据HBV基因组核苷酸序列的差异，乙肝病毒可以分为8个基因型，分别命名为A~H。我国的乙肝患者基因分型主要为A、B、C、D四个型别，其中B和C基因型为优势基因型,分别占30%和60%。D型基因主要分布在新疆地区。不同的基因分型有着不同的临床意义，一般来说，A型基因预后较好，治疗应答率较高；B型治疗效果和预后要比C型好，C型治疗应答率最低，疗效不好，病情容易重症化，预后不良。

以普通干扰素ɑ治疗为例，如果是B型基因的乙肝患者，治疗有效应答率为41%（即乙肝病毒DNA 和e抗原转阴）；而对于C型基因的乙肝患者，有效应答率只有15%。如果使用最新的长效干扰素（聚乙二醇化干扰素）治疗不同基因型的乙肝患者，也有不同的治疗有效应答率。治疗A型基因的乙肝患者，乙肝病毒e 抗原血清转换率为47%，B型基因为44%，C型基因为28%，D型基因仅为25%。也就是说，如果我们用干扰素治疗乙肝患者前，先对患者的乙肝病毒基因分型进行一次检查，就可以预测到远期治疗效果。这是非常重要的措施，比如说一个乙肝患者经过化验检查，提示为C型基因，如果我们为其使用普通干扰素ɑ进行治疗，有效应答率只有15%；即便使用最新的长效干扰素治疗，有效应答率也只有28%。像这种情况，最好选择其他治疗药物和治疗方案，不要硬着头皮蛮干。(二）HPV基因检测在预防宫颈癌中的作用

宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，发病率在女性恶性肿瘤中居第二位，每年约有50万左右新发病例。

我国每年有新发病例约13.15万，占世界宫颈癌新发病例总数的26%。

HPV广泛存在于自然界,人的皮肤,消化道,呼吸道等都携带有这种病毒.

持续的人乳头瘤病毒(human papillomavirus, HPV) 感染是引起宫颈癌和癌前病变的必要因素，93.0%-99.7%的宫颈癌组织中均可检测到HPV DNA。

大样本调查显示：HPV6 ,11 ,40 ,42 ,43 ,44 ,54 ,61 ,70 ,72 ,81 ,cp6 108等12种归为低危型，主要引起生殖道肛周皮肤和阴道下部的外生性湿疣类病变、扁平湿疣类病变和低度子宫颈上皮内瘤样变(CINI), 多呈一过性，可自然逆转；高危型主要为HPV16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，68，73，82等15种，主要导致CINII-III级病变和宫颈癌的发生, 持续高危型HPV感染的CINⅠ级易进展为CINⅡ～Ⅲ。

高危型HPV-16和HPV-18分别占宫颈癌的50%和14%。高危型HPV的持续感染可使患宫颈癌的风险增加250倍。

HPV DNA的检测方法

实时定量PCR (Real time PCR)

核酸杂交捕获（Hybrid CaptureⅡ，HCⅡ）

HC Ⅱ可一次检测所有致癌的13种高危型HPV。

敏感度：对CIN Ⅱ、Ⅲ和癌的检出率为 98%。

阴性预期值：对高度鳞状上皮细胞病变或更高度

病变的阴性预期值99.9%

细胞学检查结果为意义不明确的非典型细胞时，HPV基因的检测能预测受检者患宫颈癌的风险。

细胞学检查+HPV基因的检测是宫颈癌前病变和宫颈癌筛查的最佳方法，成为预防宫颈癌的关键。

二、遗传性疾病的分子诊断

遗传性疾病中常见的分子异常

遗传性疾病的产生是由于一个（或数个）基因发生异常导致这些基因所载有的遗传信息受到改变，而发病是通过遗传物质的表达产物——蛋白质（或酶）的表现异常所致。

基因突变主要包括点突变、片段性突变和动态性突变。

点突变 (point mutation)

包括错义突变、无义突变、移码突变

各种点突变所造成的后果：

蛋白质分子量改变

蛋白质合成量下降

无蛋白质合成

片段性突变(fragememtal mutation)

核苷酸的丢失和增多

缺失：基因中硷基（遗传物质）的丢失

插入：外来基因片段插入某一基因序列中

倍增：基因内部某一段序列发生重复

基因重排：基因组中原来不在一起的基因由于某些原因组合排列在一起

动态性突变(dynamic mutation)

以三核苷酸为单位的重复序列在传递过程中

不稳定，会发生扩展，即子代的重复次数往

往较亲代大为增加，因此又称动态性突变。