巴戟天薄层色谱鉴别用对照提取物的研制方法

2.4.2 氧化破坏试验 取本品2份，分别用5%、30%过氧化氢溶液进行氧化破坏试验。在性状方面经氧化破坏后，2份样品颜色均发生了明显变化，薄层色谱鉴别结果显示，5%过氧化氢溶液破坏后的样品与0 d样品无明显差异，但30%过氧化氢溶液破坏后的样品则与0 d样品不一致，说明样品在强氧化环境下不稳定。
2.4.3 包装条件的确定 上述稳定性影响因素考察结果表明，影响巴戟天薄层鉴别用对照提取物稳定性的主要因素有光照、湿度和氧化，包装应避光、密封，避免氧化和吸湿，故拟定该提取物包装条件为棕色玻璃安瓿瓶密封包装。
2.5 巴戟天薄层鉴别用对照提取物的应用
2.5.1 代替《中国药典》巴戟天药材标准中的对照药材 取巴戟天药材粉末2.5 g，加水1 mL使润湿，再加乙酸乙酯30 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1 mL使之溶解后作为供试品溶液。另取巴戟天薄层鉴别用对照提取物1 g、巴戟天对照药材2.5 g，同法分别制成对照提取物溶液和对照药材溶液。吸取上述3种溶液各10 L，分别点于同一块硅胶GF254薄层板上，以甲苯乙酸乙酯甲酸8∶2∶0.1为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯254 nm下检视。结果巴戟天药材样品、对照提取物和对照药材色谱结果基本一致图1，表明对照提取物可以代替对照药材在该鉴别中使用。
2.2.2 不同浓度乙醇考察 取样品5份，每份约5 g，分别以50%、60%、70%、80%、95%共5种不同浓度乙醇为溶剂各50 mL加热回流提取1 h，滤过，滤液蒸干，残渣称重计算提取效率，并用甲醇5 mL溶解后作为供试品溶液进行蒽醌类成分薄层色谱检测和糖类成分薄层色谱检测色谱方法均同2.2.1。结果70%乙醇提取得率最高表2，且薄层色谱效果最佳，故确定最佳提取溶剂为70%乙醇。
2.2.3 不同提取方法考察 取样品2份，每份约5 g，各加70%乙醇50 mL，分别进行加热回流1 h和超声提取1 h，滤过，滤液蒸干，残渣称重计算提取得率，并用甲醇5 mL溶解后作为供试品溶液进行蒽醌类成分薄层色谱检测和糖类成分薄层色谱检测色谱方法均同2.2.1。对加热回流和超声提取这两种常用的提取方式进行考察，结果加热回流提取的得率高于超声提取见表3，故采用加热回流的提取方式。
巴戟天属于含糖较多，不易粉碎均匀，且按《中国药典》标准提取得到的供试品溶液黏稠不易点样的品种。为克服上述局限，需要研究制备巴戟天薄层鉴别用对照提取物，并使之可在巴戟天药材及含巴戟天中成药的薄层鉴别项检测中替代巴戟天对照药材使用。
1 仪器与试药
样品 巴戟天药材样品5批经广东省食品药品检验所林锦锋副主任中药师鉴定均为茜草科植物巴戟天Morinda officinalis How的干燥根，样品信息见表1 巴戟天对照药材中国食品药品检定研究院，批 喘可治注射液广州万正药业有限公司，批 。
[] 目的 研制薄层色谱鉴别用巴戟天对照提取物，以解决对照药材的局限性。 方法 从原料选定、制备工艺研究、稳定性影响因素考察等方面探讨薄层色谱鉴别用巴戟天对照提取物的研究思路，并比较巴戟天对照药材与对照提取物在薄层鉴别中的应用结果。 结果 巴戟天薄层鉴别用对照提取物的提取条件 巴戟天粗粉加20倍70%乙醇，加热回流提取，提取2次，每次1 h。该对照提取物替代对照药材应用于巴戟天及其成方制剂中的薄层鉴别效果一致。 结论 本研究制备的巴戟天薄层鉴别用对照提取物，可以替代巴戟天对照药材用于巴戟天及其成方制剂的质量控制分析。
2.5.2 代替喘可治注射液标准中的对照药材 取喘可治注射液2 mL，蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解，作为供试品溶液。另取巴戟天薄层鉴别用对照提取物0.1 g，加甲醇10 mL超声处理30 min，滤过，滤液作为对照溶液。再取巴戟天对照药材0.25 g，加70%乙醇20 mL，加热回流1 h，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇10 mL使溶解，作为对照药材溶液。吸取上述3种溶液各5 L，分别点于同一块硅胶G薄层板上，以正丁醇无水乙醇水5∶4∶1为展开剂，展开，取出，晾干，喷以萘酚试液，105℃加热至斑点显色清晰。结果对照提取物和对照药材色谱结果基本一致，喘可治注射液色谱中，在与上述两种色谱相应的位置上显相同颜色的斑点图2，表明巴戟天对照提取物可以代替对照药材在该鉴别中使用。 3 讨论
[关键词] 巴戟天 薄层色谱鉴别 对照提取物 质量控制
[中图分类 ] R927.11 [文献标识码] A [编 ] 16737210201609c002205
[Abstract] Objective To develop Morinda officinalis How reference extract for TLC to solve the limitation of reference crude herb. Methods The research strategy of Morinda officinalis How reference extract for TLC was discussed from raw material selected， preparation technology and stability influence factors. Practical results between Morinda officinalis How reference crude drug and extract in TLC were compared. Results The extract condition of reference extract used for TLC of Morinda officinalis How was as follows Morindae officinalis How thick powder was heating reflux extracted with 20 flods of 70% ethanol for two times， 1 hour each time. The reference extract instead of reference crude drug used for TLC of Morindae officinalis How and its historical preparations gained the same effect. Conclusion The reference extract of Morindae officinalis How for TLC prepared by this study can replace Morindae officinalis How reference crude herb to be used for quality control analysis of Morindae officinalis How and its historical preparation.
2.2.4 正交试验考察优化提取时间、次数及溶剂用量 为全面考察提取工艺条件，取样品6份，每份5 g，以70%乙醇加热回流提取，选择溶剂用量A、提取时间B和提取次数C为考察因素，因素A的水平依次为10、15、20倍，因素B的水平依次为0.5、1、2 h，因素C的水平依次为1、2次，选用L6322正交表安排试验，以提取得率为考察指标，将结果填入正交试验表中的结果栏内，并进行直观分析和方差分析。由表4可知，RCRB，表明对提取得率的影响从大到小的顺序为 提取次数溶剂用量提取时间，最佳的试验方案为 20倍提取溶剂，回流提取2次，每次提取2 h。提取时间的影响最小，故结合直观分析和实际生产，适当减少提取时间为1 h，即最终确定的提取方案是巴戟天粗粉加20倍70%乙醇，加热回流提取，提取2次，每次1 h，减压回收溶剂至干。
仪器设备 数控超声波清洗机昆山市超声仪器有限公司，KQ300DE型、旋转蒸发仪Heidolph，LABOROTA 4003、薄层自动点样仪Camag，ATS4、薄层色谱成像仪Camag，REPROSTAR 3、电子天平Sartorius，CP225D、恒温恒湿培养箱Binder KBF115、药物稳定性试验箱天津药典标准仪器厂，WD1。 试剂 纯水、试剂均为分析纯。
[Key words] Morindae officinalis How TLC identification Reference extract Quality control
巴戟天为茜草科植物巴戟天Morinda officinalis How的干燥根，始载于《神农本草经》，列为上品，为较常用的中药，有补肾壮阳、强筋骨、祛风湿的作用，可用于阳痿遗精、宫冷不孕、月经不调、小腹冷痛、风湿痹痛、筋骨痿软[15]。其以肉质根入药，是我国著名的四大南药之一，在中医药处方中应用广泛，在我国南方地区以及港澳台地区还作为常用的食疗补品，为我国主要出口药材之一[6]。
2.2.1 不同提取溶剂考察 采用乙酸乙酯、乙醇和水3种溶剂进行提取试验，提取方法 取样品2 g，分别以乙酸乙酯、乙醇和水3种溶剂各20 mL加热回流提取1 h，滤过，滤液蒸干，残渣用甲醇1 mL溶解后作为供试品溶液。将提取所得的供试品溶液分别按《中国药典》2016年版一部巴戟天药材标准[1]项下的鉴别2和原国家食品药品监督管理局颁布的喘可治注射液标准[22]项下鉴别2分别进行蒽醌类成分薄层色谱检测[以甲苯乙酸乙酯甲酸8∶2∶0.1为展开剂，展开，晾干，置254 nm紫外光下检视]和糖类成分薄层色谱检测[以正丁醇无水乙醇水5∶4∶1为展开剂，展开，晾干，喷以萘酚试液，105℃加热至斑点显色清晰]，结果表明，乙醇提取可以兼顾两种成分类别的提取，乙酸乙酯对蒽醌类成分提取较佳，但对糖类成分提取不佳 水则对糖类成分提取较佳，而对蒽醌类成分提取不佳。因此，初步选定乙醇为巴戟天薄层色谱鉴别用对照提取溶剂。
目前，在《中国药典》及国家、地方的其他药材和成药标准中，主要采用对照药材和中药单体成分对照品作为薄层色谱鉴别项的对照物质，这种模式存在如下局限性 ①对照药材品种有的黏度大难以粉碎均匀，粉碎后的稳定性降低，使用量过大，前处理麻烦或提取得到的供试品溶液含多种成分黏稠而难以点样等 ②单体成分对照品较难获得，价格高昂且所能控制的成分单一。中药对照提取物价格低廉、多成分、专属性高、稳定性好、制备难度低，更符合中药的自身特点和质量控制要求，已经逐步成为近年来中药标准物质研究的新方向，黄芪、大黄、肉豆蔻、苦杏仁、龙胆、当归、川芎、七叶皂苷等中药对照提取物得到了研制应用[714]。