第05章 酶的工业提取
Bispora sp. MEY-1来源的嗜酸海藻糖酶TreA酶学性质研究
中国农业科技导报，2021,23(4)：85-92Journal of Agricultural Science and TechnologyBispora sp.MEY-1来源的嗜酸海藻糖酶TreA酶学性质研究蒋肖，涂涛，王坤，彤丽格，罗会颖*(中国农业科学院饲料研究所，农业农村部饲料生物技术重点实验室，北京100081)摘要:酸性海藻糖酶作为生物催化剂在生物工业中广泛应用，挖掘酶学性质优良的酸性海藻糖基因具有重要意义。
从Bispora sp.MEY-1中成功克隆出一个酸性海藻糖酶基因7＞丛,并在毕赤酵母GS115中实现高效表达。
对纯化后的酸性海藻糖酶TreA进行酶学性质鉴定,其最适pH为4.0,在pH2.2-5.0范围内，该酶能够维持60%以上的酶活力。
TreA在偏酸条件下稳定效果比较好，在pH1.0-4.0条件下处理1h,可以剩余88%以上的酶活力。
TreA的最适温度为60咒，在40~70t之间都可以维持50%以上的酶活力，属于中高温酶。
重组海藻糖酶TreA的比活为1913U-mg_1，动力学参数心和卩昨分别为0.67mg-mL_1f[l119iJimol-min-1-mg-1。
同时,还评估了不同金属离子或化学试剂对纯海藻糖酶TreA的酶活性影响及其蛋白酶抗性。
极大丰富了海藻糖酶基因资源，促进了其在生物工业中的应用。
关键词:Bispora sp.MEY-1；酸性海藻糖酶;异源表达;酶学性质鉴定doi：10.13304/j.nykjdb.2020.0452中图分类号:Q78文献标识码:A文章编号:1008-0864(2021)04-0085-08Enzymatic Properties of an Acidic TrehalaseTreA from Bispora sp.MEY-1JIANG Xiao,TU Tao,WANG Kun,TONG Lige,LUO Huiying*(Key Laboratory for Feed Biotechnology t Ministry of Agriculture and Rural Afiairs；Feed Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing100081,China)Abstract:As a biocatalystase,acid trehalase is widely used in biological industry.It is very important to exploit new acid trehalase with excellent enzymatic properties.In this study,an acid trehalase gene(TreA)from Bispora sp.MEY-1was successfully cloned and expressed in Pichia pastoris GS115.The enzymatic properties of purified trehalase TreA were identified.The optimum pH was4.0,and the relative activity maintained over60%under the range of pH2.2〜5.0.The relative activity of purified enzyme was more than88%after treated for1h under pH1.0〜4.0,whichexhibited the good acid stability.The optimum temperature of purified enzyme was60七,which was enzyme with medium-high temperature resistance.The specific activity of purified enzyme was1913U*m g_1,and its K m and V max were0.67mg•mL-1and119|JLmol•min-1*mg-1,respectively.Moreover,the effects of different mental ions or chemical reagents,and the protease resistances on the purified enzyme activity were also evaluated.Key words:Bispora sp.MEY-1；acid trehalase；heterologous expression；characterization海藻糖是一类非还原型二糖，由两个a-D-葡萄糖通过a-1,1-糖昔键连接而成,通常以二水化合物的形式存在，是所有糖中化学性最不活跃的糖⑴。
微生物学第五章微生物的代谢
通过改变细胞膜的通透性，控制代谢底物和产物的进出，从而调 节代谢过程。
微生物代谢的基因调控
01
原核生物的基因调 控
通过操纵子模型实现基因表达的 调控，包括正调控和负调控两种 方式。
02
真核生物的基因调 控
通过转录因子和顺式作用元件的 相互作用，实现基因表达的精确 调控。
03
基因表达的诱导和 阻遏
03 氮的转化代谢
微生物还可以通过氮的转化代谢将一种含氮化合 物转化成另一种含氮化合物，如硝酸盐还原成氨 的过程。
04Βιβλιοθήκη 微生物代谢的调节与控制代谢调节的方式与机制
酶活性的调节
通过改变酶的构象或修饰酶活性中心，从而调节代谢途径中关键 酶的活性。
代谢物浓度的调节
代谢物浓度的变化可以影响酶的活性，从而调节代谢速率。
用、液相色谱-质谱联用等。
核磁共振法
利用核磁共振技术对微生物代 谢产物进行结构和构象分析， 可以获得代谢产物的详细化学
信息。
生物信息学分析
利用生物信息学方法对微生物 代谢组学数据进行处理和分析， 包括代谢途径分析、代谢网络 构建、代谢物鉴定和代谢调控 研究等。
THANKS
感谢观看
微生物代谢产物的生物活性与应用
抗生素
由微生物代谢产生的具有抗菌活 性的化合物，用于治疗细菌感染。
酶
微生物代谢产生的生物催化剂，广 泛应用于食品、医药、化工等领域。
激素
某些微生物代谢产物具有激素活性， 可用于调节动植物生长发育。
微生物代谢在环境保护和能源领域的应用
污水处理
利用微生物代谢降解污水中的有机污染物，净化水质。
02
微生物的能量代谢
能量代谢的基本过程
高中生物_第1节降低化学反应活化能的酶教学设计学情分析教材分析课后反思
《降低化学反应活化能的酶》（第1课时）教学设计一、教学目标（一）知识方面说明酶在细胞代谢中的作用、酶的本质。
（二）能力方面学会控制变量能力，提高学生的实验操作能力。
（三）情感态度和价值观方面激励学生学习科学家实事求是的科学态度和勇于探索的科学精神。
二、教学重点及教学难点1.教学重点：酶的作用、本质。
2.教学难点：酶降低化学反应活化能的原理。
三、教学设计学情分析经过初中生物课的学习和实践，学生已经掌握了一些学习生物的方法和实验能力，具备了一定的学习生物的能力，特别是学习过酶和过氧化氢的相关知识，学生学起来显得容易得多，因此，教学中，尽量让学生自主、合作和探究学习，让他们自己质疑、释疑，教师适当点拨、扶助，必要时精当讲解，最终让学生自己归纳出酶的作用和定义。
但由于一节课时间有限最好将学生分组实验，分工明确实验进行的快。
再者，我校学生大多数是来自农村的，小组划分时要注意和城里的孩子合理搭配。
效果分析在有限的时间内，课堂设置的目标量不能过大，否则，要么无法完成，要么质量不高。
学生对实验操作的热情很高，对于这类实验安排在教室中的课程，如何在有限的时间内，有效地引导学生探索、分析、归纳，需要教师有较高的课堂驾驭能力，需要学生有很强的自律能力，教师对课程节奏的把握成为一个难点。
我积极组织学生进行实验，强调安全的前提下，有效地完成了课堂实验的指导和本堂内容的归纳提升。
从本堂课的准备到授课，我进一步体会是：首先，学生实验一定要坚持开设，学生对动手获得充满了热爱，同时，学生手脑并用的能力、发现问题并解决问题的能力在实验课上将得到很好的提升。
第二，学生实验尽量分组完成，否则效果大打折扣。
第三，学生热爱实验，但欠缺理性的分析，有效的把握节奏和引导是教师要狠背的课；第四，对课本实验，教师要用心发掘内涵，引申、演变，前后整合，可有效地拓宽、拓展深度和广度。
教材分析一、教学目的要求知识方面说明酶在代谢中的作用、本质情感态度与价值观方面通过研究科学家对酶本质的探索历史，认同科学是在不断的观察、实验、探索和争论中前进的；认同科学家不仅要继承前人的科研成果，而且要善于吸收不同意见中的合理成分，还要具有质疑、创新和勇于实践的科学精神与态度。
生物技术基础名词解释
第一章1、现代生物技术:也称生物工程。
在分子生物学基础上建立的创建新的生物类型或新生物机能的实用技术，是现代生物科学和工程技术相结合的产物。
2、基因重组：gene recombination 造成基因型变化的核酸的交换过程。
3、酶工程：enzyme engineering 酶制剂在工业上的大规模应用，主要由酶的生产、酶的分离纯化、酶的固定化和生物反应器四个部分组成。
4、蛋白质工程：protein engineering 按人们意志改变蛋白质的结构和功能或创造新的蛋白质的过程。
5、快速无性繁殖：7、生物工程：bioengineering应用生命科学及工程学的原理，借助生物体作为反应器或用生物的成分作工具以提供产品来为社会服务的生物技术。
包括基因工程、细胞工程、发酵工程、酶工程等。
8、细胞工程：cell engineering应用细胞生物学和分子生物学的方法，通过类似于工程学的步骤在细胞整体水平或细胞器水平上，遵循细胞的遗传和生理活动规律，有目的地制造细胞产品的一门生物技术。
9、发酵工程：是指采用现代工程技术手段，利用微生物的某些特定功能，为人类生产有用的产品，或直接把微生物应用于工业生产过程的一种新技术。
10、转基因工程：转基因工程又叫重组DNA技术，重组是指在体外将分离到的或合成的目的基因（object gene）,通过与质粒、病毒等载体（vector）重组连接，然后将其导入不含该基因的受体细胞(host cell)，使受体细胞产生新的基因产物或获得新的遗传特性。
11、生物固氮：是指固氮微生物将大气中的氮气还原成氨的过程。
12、人类基因组计划：human genome project于20世纪80年代提出，由美、英、日、中、德、法等国参加并于2001年完成的针对人体23对染色体全部DNA的碱基对（3×109）序列进行排序，对大约25 000基因进行染色体定位，构建人类基因组遗传图谱和物理图谱的国际合作研究计划。
保安康固体发酵-低温淀粉酶耐酸性能评估及其在制粒过程中的热稳定性研究-高研
明，低温淀粉酶具有优良的耐酸性能，并具有良好的热稳定性，能抵御饲料制粒过程中的高温。
关键词：低温淀粉酶；耐酸性能；饲料制粒；热稳定性 中图分类号：Ｓ８１６．７ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００３—６２０２【２０１６）０７—００４８一０５
Ａｃｉｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅｒｍａｌ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｄｕｒｉｎｇ ｐｅｌｌｅｔｉｎｇ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ｃｏｌｄ－ａｃｔｉｖｅ ａｍｙｌａｓｅ
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低温淀粉酶耐酸性能评估及其 在制粒过程中的热稳定性研究
祁营利１，高 研２，刘金爱２，吴 勃２，傅罗琴３，王则金１
３１００１４；３．浙江大学动
（１．福建农林大学食品科学学院，福建福州３５０００２；２．杭州保安康生物技术有限公司，浙江杭州 物科学学院，浙江杭州３１００５８）
收稿日期：２０１６—０３—１６；修回日期：２０１６—０６—１９ 作者简介：祁营利（１９８９一），男，硕士研究生，研究方向为农产品贮藏原理与技术。
通讯作者：王则金（１９５７一），男，教授、博士生导师，研究方向为农产品加工及贮藏工程。
万方数据
祁营利等ｉ低温淀粉酶耐酸性能评估及其在制粒过程中的热稳定性研究／２０１６年一７啊
ＡＢＳＴＲＡＣＴ：Ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ａｃｉｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｔｈｅｒｍａｌ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｃｏｌｄ—ａｃｔｉｖｅ ａｍｙｌａｓｅ，ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ ｅｓｔｉｍａｔｅｄ
ａｔ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐＨ ｖａｌｕｅｓ ａｎｄ ｐｅｌｌｅｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｆｏｒ ４ ｈ ｗｉｔｈ ｂｕｆｆｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ｓｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ
《酶法分析》课件
酶的分类和特性
酶的分类
酶的种类：包括氧化还原酶、 转移酶、水解酶、裂合酶、异 构酶等
酶的活性：受温度、pH值、离 子强度等因素影响
酶的来源：包括动物、植物、 微生物等
酶的稳定性：受温度、pH值、 离子强度等因素影响
酶的特性
酶是一种生物催化剂，可以加速化 学反应的速度
酶的活性受温度、pH值、离子强 度等因素的影响
法
酶法分析的应 用领域广泛， 包括食品、医 药、环境等领
域
酶法分析的发 展趋势是向着 自动化、微型 化、高通量方
向发展
酶法分析的未 来前景广阔， 有望在更多领
域得到应用
对未来发展的展望
酶法分析技术在生物医学领域的应用前景 酶法分析技术在环境监测领域的应用前景 酶法分析技术在食品检测领域的应用前景 酶法分析技术在工业生产领域的应用前景
酶法分析在生物体内的应用实例：例如，酶法分析可以用于检测血液中的葡萄糖、血脂、胆固醇等 物质，也可以用于检测尿液中的蛋白质、尿素、肌酐等物质。
酶法分析在生物体内的发展趋势：随着生物技术的不断发展，酶法分析在生物体内的应用将会越来 越广泛，越来越深入，为疾病的诊断和治疗提供更加准确、快速的信息。
食品分析中的酶法分析
《酶法分析》PPT课件
汇报人：PPT
目录
添加目录标题
01
酶法分析的实验技术 和方法
04
酶法分析概述
02
酶的分类和特性
03
酶法分析的应用实例
05
酶法分析的优缺点和 未来发展前景
06
添加章节标题
酶法分析概述
酶法分析的定义和原理
酶法分析：利用酶的生物催化作用，对样品进行定性、定量分析的方法
第05章第四节生物样品分析方法的基本要求
第四节
Hale Waihona Puke 生物样品分析方法的 基本要求
二、样品的储存
血浆和血清都必须在采血后即时分离。否则，血凝 后冰冻保存，则因冰冻时引起细胞溶解，而阻碍血浆 或血清的分出，同时因溶血而影响药物浓度变化。 冷藏—冰箱(4℃)中短期保存(1~2d)
冷冻—冷柜(-20℃)或低温冷柜(-80℃) 中长期保存
尿样宜立即测定，否则应加入防腐剂或低温冷藏。
四、简述容量分析法的特点及计算公式？
五、紫外吸收光谱有什么特征？哪些特征和常数可作为 鉴定药物的定性定量指标？
思考题
六、简述紫外分光光度法在药品质量标准中的应 用。 七、简述HPLC法中系统适用性试验的意义与内容。 八、HPLC法定量的分析方法哪些？各人何特点？ 九、药物分析方法的选择原则？比较几种定量分 析方法的特点并指出适用范围。 十、简述准确度与精确度的定义以及它们之间的 关系？ 十一、什么叫有效数字？如何正确运用有效数字 的运算规则来表示分析结果？
加入适量的酶和缓冲液，置水浴上水解一 定时间，过滤或离心，取上清液供萃取用
第四节
(二)
生物样品分析方法的 基本要求
缀合物的水解
尿中药物多呈缀合状态。一些含-OH，COOH，-NH3，-SH的药物可与内源性物质葡 萄糖酸或硫酸形成葡糖酸苷或硫酸缀合物。
1）酸水解 2）酶水解
第四节
(三) 有机破坏
生物样品分析方法的 基本要求
习
题
十六、取维生素B2 20片,精密称得重量为 1.6011g，研细，精密称取片粉0.1518g， 置于１000ml量瓶中，溶解．于444nm波 长处测得吸收度为0.312,按C17H20N4O6的 吸光系数为323计算。求维生素Ｂ２的标 示百分含量（标示量５mg/ 片）．(101.9%)。
天津大学生物化学05第五章核酸化学
（二）DNA的二级结构1(总)
1．DNA双螺旋结构模型的要 点 2．双螺旋结构的稳定因素 3．DNA双螺旋的不同类型
.
（二）DNA的二级结构2
➢公 认 的 为 1953 年 watson 和 crick 提 出 的 DNA 双 螺旋结构模 型
.
（二）DNA的二级结构3
➢此模型的建立主要基于两方面的根据 ➢（1）碱基组成A=T，C=G，并证明A 与T之间可生成两个氢键，而C与G之间 三个氢键。 ➢（ 2 ） X 衍 射 结 构 分 析 ： 不 同 来 源 的 DNA纤维具有相似的X光衍射图谱。
➢含量:占总RNA的5% ➢存在：在细胞核中以DNA为模板被合成以后，
可能暂存于核仁内，也可能立即转移到胞质中， 并以每分子mRNA与几个或几十个核蛋白体结合 成串珠样的多核蛋白体形式而存在。
➢特点：一般都很不稳定，代谢活跃，更新迅速，
寿命较短，种类很多。
➢功能:在蛋白质生物合成中起传递遗传信息的作
➢（2）离子键及范德华力：DNA分子中磷酸基因在生理 条件下解离，使DNA成为一种多阴离子，这有利于它与 带正电荷的其它阳离子基团发生静电作用，这样减少双链 间的静电排斥，有利于双螺旋的稳定。
➢（3）碱基堆积力：目前普遍认为堆积碱基间的疏水作 用是稳定DNA结构的更重要的因素。大量碱基层层堆积， 两相邻碱基的平面十分贴近，于是使双螺旋结构内部形成 一个强大的疏水区，与介质中的小分子隔开，有利于互补 碱基之间氢键的形成。
.
1．DNA双螺旋结构模型要点1（1）
➢（1）DNA分子是由两条方向相反的平行 的多核苷酸链构成。即p5’-糖3‘-p的结构 与p3’-糖5‘-p的结构相对;两条链的糖－磷 酸主链都是右手螺旋，有一共同的螺旋轴。
生物化学05.第五章 酶
时，酶原适时地转变成有活性的酶，发挥其催
化作用。
3.胃、肠黏膜及肠道寄生虫均有抵抗消化酶
的抗酶物质。
三、酶促反应的机制
(一)活化分子与活化能
1.活化能：底物分子从基态转变到活化态所需的能量。 2.活化分子：从基态转变到活化态的底物分子。
能 量 非催化反应活化能
一般催化剂催 化反应的活化能 酶促反应 活化能
底物 反应总能量改变 产物 应 过 程
反
酶促反应活化能的改变
(二)诱导契合假说
酶底物复合物
E+S
ES
E+P
酶与底物相互接近 时，其结构相互诱导、 相互变形和相互适应， 进而相互结合。这一过 程称为酶-底物结合的诱 导契合假说 。
酶的诱导契合动画
(三)邻近效应与定向排列
位于活性中心以外，维持酶活性中心应有的空间 构象所必需。
活性中心以外 的必需基团 底物
+ +
催化基团
结合基团
活性中心
二、酶原与酶原的激活
(一)酶原
有些酶在细胞 内合成或初分泌时 无活性，此无活性 前体称为酶原。
(三)激活过程
酶原
在特定 条件下
特定的肽链水解 分子构象发生改变 酶的活性中心形成
(二)酶原的激活
一些代谢物可与某些酶分子活性中心外的 某部分可逆地结合，使酶构象改变，从而改变 酶的催化活性，此种调节方式称变构调节。
1.变构酶 (allosteric enzyme) 2.变构部位 (allosteric site) 3.变构效应剂 (allosteric effector)
变构激活剂
变构抑制剂
(二) 共价修饰调节
常见化学致癌物的环境毒理学短学时
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六环芳烃 部分六环芳烃致癌 二苯并芘常有较强致癌性 七环以上芳烃 研究很少
多环芳烃的致癌作用 结构与致癌活性 K区理论
K区：易与核酸、蛋白质反应 致癌
L区：对致癌反应起拮抗作用的区域 苯并(a)蒽：L区活泼 不致癌 第7、12位被甲基取代，L区不 活泼 致癌
湾区理论
湾区环氧化 环氧化物 氧环打开
第五章 常见化学致癌物的环境毒理学 直接致癌物 间接致癌物：肝微粒体混合功能氧化酶系统催 化活化 第一节 多环芳烃类 ➣ 最早认识 ➣ 数量最多：致癌物中占1/3以上 ➣ 分布最广 ➣ 与人类关系密切
01
引起皮肤癌、肺癌和胃癌 多环芳烃类（稠环芳烃）：由多个苯环缩合而成 的化合物及其衍生物。（ 4～7个苯环）
第二节 芳香胺类化合物 芳香胺类化合物：苯及其同系物芳香烃环上的氢原子被 氨基（NH2）取代 一. 芳香胺类化合物的污染来源 原料、化工合成的中间体 有机物燃烧 ➣ 中等毒到低毒：作用于血液 高铁血红蛋白 溶血作用 其它急、慢性中毒 ➣ 有致癌作用：2-萘胺（煤焦油）、联苯胺、2-乙酰氨 基芴、4-氨基联苯等
03
6个苯环：部分致癌
02
4～5个苯环：往往致癌
04
6个以上苯环：致癌可能性较小 苯并(a环类
芴及胆蒽类
杂环类
双环芳烃
萘无致癌性
萘的氨基衍生物对膀胱有致癌性
01
02
03
04
05
三环芳烃
蒽和菲：没有致癌性
蒽的大部分烷基衍生物没有致癌性
菲的一些烷基衍生物有轻微致癌性
➣ 黄曲霉毒素B1 ：目前已知作用最强的化学致癌物
1
致癌作用：二甲基亚硝胺的75倍
香精香料知识问答(十九)
（） ３ 水洗 ：用 水将 反 应物 洗涤 ３ ４ 后 ，用分 液漏 斗将 油 层分 出 。 ～次 （） ４ 水蒸 气蒸 馏 ：将 以上 水洗 后分 出的油层 进行 水 蒸气 蒸馏 。 （） ５ 减压 分馏 ：再 将水 蒸气 蒸馏 后 得 到的粗 品进 行 减压 分馏 ，９ ℃／．× ０Ｐ ，馏 出物 为苯 乙酮 成 品。 Ｏ ６７ １ ａ 说 明 ： （） １ 使用 的原料 中 以无 水 者 为佳 ，最 好 是在 用 以前预 先处 理 。如 ：纯 苯 的凝 结 ，用 水蒸 气 溶解
科 技
前 沿
香 精香 料 知 识问 答 （ 九 ） 十
（ 续接上 期Ｐ ７ １） 问 ：酮 类香料 怎样 合成 ，其特性 和用途 是什 么？ （ 续）
１ 、苯 乙酮 的合成方 法 几种主要 酮类香 料 的合 成方法 如下 ：
（） １ 投料 与反应 ：纯 苯 １份 ，三 氯化 铝 １份 ，醋 酸酐２８ 。先 将纯 苯投入 反应 器 内，再将 三 氯化铝逐 ０ ０ ．份 投 入 ，不 断搅 拌 至无 阻碍 为止 ，将 投 料 口封严 ，再用 下 口瓶滴 加 醋酸 酐 ，继 续进 行搅 拌 ，此 时 反应器 的温 度达２ ￣－ ０Ｃ 间 ，需注 意其 气管 中是否 有盐 酸气逸 出，约在 ８ 内可将 醋酸 酐全 部滴 加完 毕 ，再 ０Ｃ ４ ￣ 之 ｈ
确 定 ，因为这 些化 合物 在麝 香 鼠麝 香 中的含量 有特 时每 个 化 合 物 的总 体 可 获得 性 要 高 于 １ 。快 速ＤＩ Ｃ
定 的范 围。 工 艺 （ ．ＭＰ ，８ 循 环 ，６ ０６ ａ 次 分钟 ） 比水 蒸汽 蒸馏 法 得 作 为对此 麝 香 的质 量监 督 ，取 １ 麝 香放 ） ５ ｍｌ （ １ ４ 小 时） 到更好 的效果 ，此 时直接 油 的得率 ｇ ，０ 蒸 ６ ＂ ． 烧瓶 中 ，加入４ ｍｌ ５ 乙醇 ，超 声提 取２ 分钟 后 ，将 最 为２８ （ 汽 蒸 馏 得 率 为２５ ，含 氧 物 的含 量 为 ０ ．％ 水 ．％）
酶学与酶工程复习提纲-第05章 酶反应器
━ 连续式酶反应器，又称连续搅拌釜式反应器、连续式搅拌罐。
＾ 向反应器投入固定化酶和底物溶液，不断搅拌，反应达到平衡之后，再以恒定的流速连续流入底物溶液，同时，以相同流速输出反应液（含产物）。
━ 鼓泡式反应器
＾ 利用从反应器底部通入的气体产生的大量气泡，在上升过程中起到提供反应底物和混合两种作用的一类反应器。也是一种无搅拌装置的反应器。
━ 膜反应器
＾ 将酶催化反应与半透膜的分离作用组合在一起而成的反应器。可以用于游离酶的催化反应，也可以用于固定化酶的催化反应。
一、酶反应器定义
━酶反应器：用于酶催化反应的容器及其附属设备。
二、常见类型
━ 间歇式酶反应器，又称间歇式搅拌罐、搅拌式反应罐。
＾ 底物与酶一次性投入反应器内，产物一次性取出；反应后，固定化酶用过滤法或超滤法回收，再转入下一批反应。
■ 优点：装置简单，造价较低，传质阻力很小，反应能很迅速达到稳态。
■ 优点是：在理想状况下，混合良好，各部分组成相同，并与输出成分一致。
■ 缺点是：搅拌浆剪切力大，易打碎磨损固定化酶颗粒
━ 填充床反应器，又称固定床反应器
＾ 将固定化酶填充于反应器内，制成稳定的柱床，通入底物溶液，在一定的反应条件下实现酶催化反应，以一定的流速，收集目前工业生产及研究中应用最普遍的反应器。
■ 缺点是：传质系数和传热系数相对较低。当底物溶度含固体颗粒或黏度很大时，不宜采用PBR。
━ 流化床反应器
＾ 底物溶液以足够大的流速向上通过固定化酶床层，使固体颗粒处于流化状态。混合程度高，故传热、传质情况良好。可用于处理粘性强和含有固体颗粒的底物。
第五章 工业微生物产生菌的分离与筛选
第二节 含微生物样品的采集
一、从土壤中采样
1. 土壤有机质含量和通气状况
5-25cm土层，适合微生物生长，每克土中含菌数约几 十万到几十亿个。酵母菌分布土层最浅，约5—10cm，霉菌 和好氧芽孢杆菌也分布在浅土层。
2.
土壤酸碱度和植被状况
偏碱土壤环境，适合于细菌、放线菌生长。偏酸的土 壤环境下，霉菌、酵母菌生长旺盛。 植物根部的分泌物有所不同，即植被对微生物分布也
采样时需要注意的地方: 用取样铲，将表层5cm左右的浮土除去，取5—25cm处的
土样10—25g，装入事先准备好的塑料袋内扎好。北方土壤
干燥，可在10—30cm处取样。给塑料袋编号并记录地点、土 壤质地、植被名称、时间及其他环境条件。
一般样品取回后应马上分离，以免微生物死亡。如果样
品较多，或到外地取样，路途遥远，难以做到及时分离，则
2.极端环境条件的影响 高温、低温、高酸、高碱、高盐或高辐射强度的环境 下，也有少数微生物存在，这类微生物被称为极端微生物。 生活所处的特殊环境，导致它们具有不同于一般微生物的 遗传特性、特殊结构和生理机能，因而在冶金、采矿及生 产特殊酶制剂方面有着巨大的应用价值。
第三节 含微生物样品的富集培养
（1） 纸片培养显色
将饱浸含某种指示剂的固体培养基的 滤纸片搁于培养皿中，用牛津杯架空， 下放小团浸有3%甘油的脱脂棉以保湿， 将待筛选的菌悬液稀释后接种到滤纸 上，保温培养形成分散的单菌落，菌 落周围将会产生对应的颜色变化。
（2） 变色圈法 将指示剂直接掺入固体培养基中，进行待筛选菌悬液的单 菌落培养，或喷洒在已培养成分散单菌落的固体培养基表 面，在菌落周围形成变色圈。 a. 在含淀粉的平皿中涂布一定浓度的产淀粉酶菌株的菌悬液， 使其呈单菌落，然后喷上稀碘液，发生显色反应。变色圈 越大，说明菌落产酶的能力越强。而从变色圈的颜色又可 粗略判断水解产物的情况。 b. 筛选果胶酶产生菌时，用含０.2％果胶为唯一碳源的培养基 平板，对含微生物样品进行分离，待菌落长成后，加入0.2 ％刚果红溶液染色４h，具有分解果胶能力的菌落周围便会 出现绛红色水解圈。 c. 分离内肽酶产生菌时，除了用酪蛋白外，还可以用吲羟乙 酸脂为底物加到分离培养基内，产生蛋白酶的菌落由于水 解吲羟乙酸脂为3-吲羟吲哚，后者能氧化生成蓝色产物，根 据呈色圈便可选出平板上产蛋白酶的菌落。
第五章谷氨酸的发酵控制
（3）消泡的方法
①物理方法：如改变温度 ②机械消泡：如耙式消泡器 优点：节省消泡剂，减少污染。 缺点：不能从根本上消除引起泡沫稳定的因素。
（3）消泡的方法
③化学消泡：加入消泡剂
优点：消泡效果好，作用快，用量少。
缺点：可能会影响菌体生长或代谢产物的生成； 增加染菌机会；添加过量会影响氧的传递。
④发酵工业上采用机械消泡与化学消泡结合 的方法。
１．高初糖发酵
如，在高初糖谷氨酸发酵中，高玉米浆用量和高生物 素用量可以明显降低高初糖对菌体细胞的抑制作用；
且在接种量１０％，玉米浆用量为０．５５％，生物 素用量为１０μｇ／Ｌ，初糖１９０ｇ／Ｌ的谷氨酸发酵 中，流加５００ｇ／Ｌ的浓糖，３０ｈ的产酸率达到１４ ５．８ｇ／Ｌ，糖酸转化率达到６０．３２％。
<24
180 2500 200
10
11.5
270 600～ 120 1800
1200 53
1200 8300 1300
第二节 主要发酵参数分段控制原则及其特点
一、中初糖流加高浓度糖液的 生物素“超亚适量”工艺
1. 流 程 图
2．谷氨酸发酵记录表
3.培养基的配方
（1）二级种子培养基 葡萄糖 300kg；KH2PO4 12kg；MgSO4· 2O 6kg；糖 7H 蜜100kg；玉米浆 200kg；纯生物素150mg；消泡剂 1.5kg；定容7000L，实消，121℃保温 10min。
3.无机盐
(3)钾 钾是许多酶的激活剂。 对谷氨酸发酵的影响： 谷氨酸发酵产物生成所需要的钾盐比菌体生长需要 量高，钾盐少利于长菌体，钾盐充足利于产谷氨酸。菌 体生长需钾约为1.0～1.5mmol／L，谷氨酸生成需钾约 为2.0～10.0mmol／L。
环境微生物第05章 微生物代谢
9
电子供体
电子受体
10
11
3、光合磷酸化：光引起叶绿素、菌绿素或菌紫素逐出 电子，通过电子传递产生ATP的过程叫光合磷酸化。
非循环式光合磷酸化：光照后，激发态叶绿素分子从H2O 得到电子传递给NADP+，经过电子传递链后产生ATP： 2H2O + 2NADP+ + 2ADP + 2Pi → 2NADPH + 2H+ + 2ATP + O2
环式光合磷酸化中电子循环流动，整个过程中只有ATP 的产生不伴随NADPH的生成，不产生O2。
12
二、化能异养微生物的生物氧化与产能代谢
产能（ATP） 生物氧化的功能： 产还原力[H] 产小分子中间代谢物
好氧呼吸 生物氧化的三种类型： 厌氧呼吸 发酵
13
1.好氧呼吸
以分子态的氧作为最终电子受体的生物氧化过程。 彻底氧化，放能最多。
7
ATP的生成方式有： 1、基质（底物）水平磷酸化：厌氧或兼性厌氧微生物在基 质氧化过程中，产生一个含有高能键的中间物，将高能键 转移到ADP，成为ATP，如1，3-二磷酸甘油酸和磷酸烯醇 式丙酮酸。 2、氧化磷酸化：是主要的能量来源。氧化磷酸化作用是将 生物氧化过程中释放出的自由能转移形成高能ATP的作用， 能量的转移通过电子传递链实现，ATP的生成基于与电子 传递相偶联的磷酸化作用。 氧化磷酸化的全过程可表示为： NADH + H+ +3ADP + 3Pi +1/2O2
29
HMP途径的重要意义
为核苷酸和核酸的生物合成提供戊糖-磷酸； 产生大量NADPH，一方面为脂肪酸、固醇等物质的合成提供还 原力，另方面可通过呼吸链产生大量的能量； 与EMP途径在果糖-1,6-二磷酸和甘油醛-3-磷酸处连接，可以调 剂戊糖供需关系； 途径中的赤藓糖、景天庚酮糖等可用于芳香族氨基酸合成、碱 基合成、及多糖合成； 途径中存在3~7碳的糖，使具有该途径微生物的所能利用利用 的碳源谱更为更为广泛； 通过该途径可产生许多种重要的发酵产物。如核苷酸、若干氨 基酸、辅酶和乳酸（异型乳酸发酵）等； HMP途径在总的能量代谢中占一定比例，且与细胞代谢活动对 其中间产物的需要量相关。
发酵工业与发酵工程_05发酵设备
粗产品的提取设备
产品精制与干燥设备 流出物回收 利用和处理设备等
7. 发酵罐工艺操作条件
1．温度：25～40℃。
2．压力：0～1 kg／cm3(表压)。
3．灭菌条件；温度100～140℃，压力0～3 kg／cm3 (表压)。 4．pH：2～11。 5．需氧量：0．05～0.3 kmo1／m3· h。 6．通气量：0.3～2 VVM。 7．功率消耗：0.5～4kW／m3。 8. 发酵热量：5 000～20 000 kcal／m3．h。
(二) 自吸式发酵罐
罐的主要构件是转子(自吸搅拌) 和定子(导轮)。
比较自吸式发酵罐与机械搅拌通风发酵罐
优点：
不必配备空气压缩机及其附属设备，节约设
备投资，减少厂房面积。
溶氧速率高，溶氧效率高、能耗较低。
用于酵母生产和醋酸发酵具有生产效率高、
经济效益高的优点。
缺点：
负压，易染菌。
二、发酵罐的结构
1、罐体 3、消泡器 2、搅拌器和挡板 4、联轴器及轴承
5、变速装置 8、轴封
6、空气分布装置 9、冷却装置
7、发酵专用PH、DO电极
1. 罐体
由圆柱体及椭圆形或碟形封头焊接而成，
材料为碳钢或不锈钢。
2. 搅拌器
• 最常用的搅拌器有平叶式、弯叶式、箭叶式三种。
• 其作用是打碎气泡，使氧溶解于醪液中，从搅拌程度
但剪切力较低。
（4）多棒搅拌桨，已用于粘稠的丝状链霉菌发酵的发 酵罐中。这种搅拌桨具有较好的剪切分散能力和较低 的功率消耗，在整个发酵过程中功率变化相对涡轮桨 要小的多。 （5）气体导入式搅拌器，它适应于低粘度的发酵液。
搅拌的作用：
搅拌能将通入空气的大气泡击碎成细小气泡， 增加气液接触面积。
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有机溶剂之所以能使酶沉淀析出。主要是由于有机溶剂 的存在会使溶液的介电常数降低。例如，20℃时水的介 电常数为80，而82％乙醇水溶液的介电常数为40。溶液 的介电常数降低，就使溶质分子间的静电引力增大，互 相吸引而易于凝集，同时，对于具有水膜的分子来说， 有机溶剂与水互相作用，使溶质分子表面的水膜破坏， 也使其溶解度降低而沉淀析出。 常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等
5.2.5离心分离
离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大 小、不同密度的物质分离的技术过程。 在离心分离时，要根据欲分离物质以及杂质的颗粒大小、 密度和特性的不同，选择适当的离心机、离心方法和离心条 件。
常速离心机又称为低速离心机, 其最大转速在8000 r/min以内，相对离心 力（RCF）在1×104 g 以下，在酶的分离纯化过程中，主要用于细胞、细 胞碎片和培养基残渣等固形物的分离。也用于酶的结晶等较大颗粒的分离。 高速离心机的最大转速为（1～2.5）×104 r/min ，相对离心力达到 1×104～ 1×105 g ，在酶的分离中主要用于沉淀、细胞碎片和细胞器等的分离。为了 防止高速离心过程中,温度升高而造成酶的变性失活,有些高速离心机装设有 冷冻装置,谓之高速冷冻离心机。 超速离心机的最大转速达 (2.5～12)×104 r/min，相对离心力可以高达 5×105 g甚至更高。超速离心主要用于DNA、RNA、蛋白质等生物大分子以及细胞器、 病毒等的分离纯化；样品纯度的检测；沉降系数和相对分子质量的测定等。
层析方法
分离依据
吸附层析
分配层析 离子交换层 析 凝胶层析 亲和层析 层析聚焦
利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合 物中各组分分离
利用各组分在两相中的分配系数不同，而使各 组分分离 利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团） 对各种离子的亲和力不同而达到分离目的 以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含 各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离 利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可 逆的亲和力，使生物分子分离纯化 将酶等两性物质的等电点特性与离子交换层析 的特性结合在一起，实现组分分离
目录
5.1.1酶分离纯化的基本原则
1.防止酶变性失效 （1）一般在低温下进行 （2）控制pH不要过酸、过碱 （3）尽量减少泡沫 （4）防止重金属、有机溶剂引起酶变性，防止微生物污 染和蛋白酶水解。 2.选择有效的纯化方式 （1）在不破坏待纯化酶的限度内，使用各种“激烈” 手 段。 （2）使用亲和剂进行纯化。 3.酶活性测定贯穿纯化过程始终。
温度差破碎法 压力差破碎法 超声波破碎法 有机溶剂： 甲苯、丙酮 丁醇、氯仿 表面活性剂： Triton、Tween 自溶法 外加酶制剂法
本章 目录
化学破碎
通过各种化学试剂对细胞 膜的作用，而使细胞破碎
酶促破碎
通过细胞本身的酶系或外 加酶制剂的催化作用，使 细胞外层结构受到破坏， 而达到细胞破碎
5.2.3 酶的提取
5.3.1 膜分离
借助于一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、不同形状和不同特性 的物质颗粒或分子进行分离的技术称为膜分离技术。膜分离所使用的薄 膜主要是由丙烯腈、醋酸纤维素、赛璐玢以及尼龙等高分子聚合物制成 的高分子膜。有时也可以采用动物膜等。膜分离过程中，薄膜的作用是 选择性地让小于其孔径的物质颗粒或分子通过，而把大于其孔径的颗粒 截留。膜的孔径有多种规格可供使用时选择。
5.2.6 萃取分离
萃取分离是利用物质在两相中的溶解度不同 而使其分离的技术。萃取分离中的两相一般 为互不相溶的两个液相。有时也可采用其它 流体。
按照两相的组成不同，萃取可以分为：
有机溶剂萃取
双水相萃取 超临界萃取 反胶束萃取
5.3酶的精制（细分离）
5.3.1 膜分离
5.3.2 层析分离
5.3.3 电泳分离
吸附层析通常采用柱 型装置，将吸附剂装 在吸附柱中，装置成 吸附层析柱。
在洗脱时，层析柱内 不断发生解吸、吸附、 再解吸、再吸附的过 程。
分配层析
分配系数是指一种溶质在两种互不相溶的溶剂中溶解达到平衡 时，该溶质在两项溶剂中的浓度的比值。在层析条件确定后， 层析系数是一常数。
在分配层析中，通常采用一种多孔性固体支持 物（如滤纸、硅藻土、纤维素等）吸着一种溶 剂为固定相，这种溶剂在层析过程中始终固定 在多孔支持物上。另一种与固定相溶剂互不相 溶的溶剂可沿着固定相流动，称为流动相。当 某溶质在流动相的带动流经固定相时，该溶质 在两相之间进行连续的动态分配。
1～20 (10,000-40,000)
纳滤 NF
反渗 透 RO
>1 (100～1000)
(>100)
压力差， <1000kPa
压力差， >1000kPa
优先吸附、 表面电位
优先吸附、 溶解扩散
四种常用膜分离过程的截留特性
5.3.1层析分离
层析技术，亦称色谱技术，是一种物理的分离方法。它是利 用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同 程度分布在两个相中，其中一个相为固定的(称为固定相)， 另一个相则流过此固定相(称为流动相)并使各组分以不同速 度移动，从而达到分离。
本章 目录
5.2.4 沉淀分离
沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解 度降低，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程。
沉淀分离方法 盐析沉淀法 分离原理 利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性，通 过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出 沉淀，从而使酶与杂质分离 利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解 质有不同的等电点这一特性，通过调节溶液的pH值，使酶或杂 质沉淀析出，从而使酶与杂质分离 利用酶与其它杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定 量的某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分 离
等电点沉淀法
有机溶剂沉淀法
复合沉淀法
选择性变性沉淀 法
在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来，从 而使酶与杂质分离
选择一定的条件使酶液中存在的某些杂质变性沉淀，而不影响 所需的酶，从而使酶与杂质分离
在盐浓度达到某 一界限后，酶的 溶解度随盐浓度 升高而降低，这 称为盐析现象。
在蛋白质的盐析中，通常采用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、 氯化钠和磷酸钠等。其中以硫酸铵最为常用。这是由于硫酸铵在水中的溶解度大而 且温度系数小，不影响酶的活性，分离效果好，而且价廉易得。然而用硫酸铵进行 盐析时，缓冲能力较差，而且铵离子的存在会干扰蛋白质的测定，所以有时也用其 它中性盐进行盐析。在盐析时，溶液中硫酸铵的浓度通常以饱和度表示。
第五章 酶的分离纯化
Contents of chapter 5
Go Go Go Go
1、酶的提取与分离纯化技术路线 2、酶的粗分离 3、酶的精制 4、酶的浓缩、干燥、结晶
细胞结构与酶分布
5.1 酶的提取、分离纯化技术路线
细胞破碎 动物、植物或微生物细胞 发酵液
酶提取
酶分离纯化
酶浓缩
酶贮存 离心，过滤，沉淀，层析，电 泳，萃取，结晶等。
5.2.1 发酵液预处理
1.发酵液相对纯化
2.发酵液固液分离
1.发酵液相对纯化
（1）无机离子的去除
（2）杂蛋白的去除
（3）色素及其他物质的去除
（1）无机离子的去除
钙离子——草酸 镁离子——三聚磷酸钠 铁离子——黄血盐
（2）杂蛋白的去除
1）沉淀法——pH、盐析 2）变性法——加热、极端pH、有机溶剂 3）凝聚和絮凝——电解质、有机絮凝剂 4）吸附法——吸附剂
提高温度，降低溶液粘度、增加扩散面积、縮短扩散距离，增大浓 度差等都有利于提高酶分子的扩散速度，从而增大提取效果。
为了提高酶的提取率并防止酶的变性失活，在提取过程中还要注 意控制好温度、pH值等提取条件。
酶的主要提取方法
提取方法 盐溶液提取 使用的溶剂或溶液 提取对象 0.02～0.5mol/L的盐溶液 用于提取在低浓度盐溶液中溶解度 较大的酶
JY92-II D超声波 细胞粉碎机 高 压 细 胞 破 碎 机
1）机械破碎
2）物理破碎
3）化学破碎 4）酶解破碎
DY89-I型 电动玻璃匀浆机
细 胞 破 碎 珠
细胞破碎方法及其原理
机械破碎 通过机械运动产生的剪切 力，使组织、细胞破碎。 捣碎法 研磨法 匀浆法
物理破碎
通过各种物理因素的作用， 使组织、细胞的外层结构破 坏，而使细胞破碎。
酶分离纯化过程
酶的纯化过程，约可分为三ein): 采样 → 均质 打破细胞 → 抽出全蛋白，多使用盐析沉淀法； 可以粗略去除蛋白质以外的物质。
(2) 部分纯化 (partially purified): 使用各种 柱层析法。均质酶 (homogeneous): 目标酶的进 一步精制纯化，可用制备式电泳或高效液相色谱。 (3)浓缩与干燥 （concentration and desiccation）使酶与溶剂分离的过程，使用蒸发、 冷冻干燥等方法。 本章
酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含 酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。也称为酶的 抽提。 酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂。 一般说来，极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于 非极性的有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物 质易溶于酸性溶剂中。 酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进 行提取，有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则可 用有机溶剂提取。
（3）色素及其他物质的去除
活性炭 离子交换树脂、离子交换纤维 大孔吸附树脂 专用脱色树脂
2.发酵液固液分离
——过滤
过滤是借助于过滤介质将不同大小、不同形状的物 质分离的技术过程。
提高过滤性能的方法 絮凝和凝聚 稀释 助滤剂——不可压缩的多孔微粒