生化分离工程复习

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生化分离技术复习

生化分离技术复习

名词解释:生化分离技术:是指从含有目标产物的发酵液、酶反应液或动植物细胞培养液中,提取、精制并加工制成高纯度的、符合规定要求的各种生物技术产品的技术,又称为下游加工技术。

生物技术产品:是指在生产过程应用微生物发酵技术、酶反应技术、动植物细胞培养技术等生化反应技术制得的产品。

细胞破碎:是指选用物理、化学、酶或机械的方法来破坏微生物菌体的细胞壁或细胞膜,释放其中的目标产物。

蛋白质复性:是指变性的包涵体蛋白质在适当条件下使伸展的肽键形成特定三维结构,使无活性的分子成为具有特定生物学功能的蛋白质。

用溶剂从溶液中抽提物质叫液-液萃取,也称溶剂萃取。

经典的液-液萃取指的是有机溶剂萃取.带溶剂是指能和产物形成复合物,促使产物更易溶于有机溶剂相中,在一定条件下又要容易分解的物质。

超临界流体(SCF)萃取是利用超临界流体作为萃取剂,对物质进行溶解和分离的过程。

超临界流体(SCF)是处于临界温度和临界压力以上的非凝聚性的高密度流体。

反胶团(reversed micelles)是表面活性剂在非极性有机溶剂中亲水性基团自发地向内聚集而成的,内含微小水滴的,空间尺度仅为纳米级的集合型胶体。

吸附:利用吸附剂对液体或气体中某一(些)组分具有选择性吸附的能力,使其富集在吸附剂表面。

实质是溶质从液相或气相转移到吸附剂表面的过程。

离子交换技术:是根据某些溶质能解离为阳离子或阴离子的特性,利用离子交换剂与不同离子结合力强弱的差异,将溶质暂时交换到离子交换剂上,然后用合适的洗脱或再生剂将溶质离子交换下来,使溶质从原溶液中得到分离、浓缩或提纯的操作技术。

洗脱:离子交换完成后,将树脂吸附的物质释放出来重新转入溶液的过程称作洗脱。

树脂的毒化:树脂失去交换性能后不能用一般的再生手段重获交换能力的现象称为树脂的毒化。

浓差极化:在膜分离过程中,由于水和小分子溶质透过膜,大分子溶质被截留而在膜表面处聚积,使得膜表面上被截留的大分子溶质浓度增大,高于主体中大分子溶质的浓度,这种现象称为浓差极化。

生化分离技术原理及应用复习提纲

生化分离技术原理及应用复习提纲

《生物分离工程》复习题1、什么是等电点沉淀?调节溶液的 pH至溶质的等电点,溶质所带净电荷为零时,其分子间的吸引力增加,分子相互吸引,把该溶质从溶液中沉淀出来,即等电点沉淀2、什么是微滤?微滤(micfiltation,MF)是以多孔细小薄膜为过滤介质,靠膜两侧的压力差来对物质进行选择性透过,达到膜分离的目的。

微滤膜的孔径分布范围在0.05〜 10um之间;采用的压力一般在0.05〜0.5MPa范围内。

3、什么是超滤?超滤(ultafiltationUF)是利用膜两侧的压力差为动力将分子有选择地透过膜的过程,透过膜的分子除溶剂水外,还可以将溶质中的小分子(如无机盐等)通过膜,因此它属于一种“膜分离”过程。

超滤的分离介质与微滤膜类似,但孔径更小,为0 001〜0.05um,采用的压力常为0.1〜1.0MPa。

4、什么是反萃取?反萃取(backextraction):将萃取液和反萃取剂(含无机酸或碱的水溶液、水等)相接触,使某种被萃取到有机相的溶质转人水相,可看作是萃取的逆过程。

5、什么是溶剂萃取溶剂萃取:利用物质在互不相溶的两相溶剂中溶解度的不同,将物质从一相溶剂转移到另一相溶剂中,从而进行分离、浓缩和提纯目的产物的方法.6、什么是色谱技术?色谱技术是一组相关分离方法的总称,色谱柱的一般结构含有固定相和流动相,根据物质在两相间的分配行为不同,经过多次分配(吸附-解吸-吸附-解吸…),达到分离的目的。

7、什么是膜分离技术?膜分离技术利用膜的选择性(孔径大小),以膜的两侧存在的能量差作为推动力,由于溶液中各组分透过膜的迁移率不同而实现分离的一种技术。

8、什么是生化分离技术?生化分离技术是指从发酵液或酶中,分离纯化生物产品的过程。

它是生物技术转化为生产力不可缺少的重要环节,又称为生物技术下游加工技术。

9、发酵产品预处理特点?利用微生物发酵生产各种发酵产品,由于菌种不同和发酵醪特性不同,其预处理方法和提取、精制方法的选择也有差异。

生化分离工程重点

生化分离工程重点

第一章绪论1、生物工程学的概念,生物工程学的研究领域。

2、生物分离工程的概念。

3、生物分离加工过程按工艺流程顺序可分为四个主要阶段:发酵液的预处理、提取、精制和成品加工。

第二章发酵液的预处理1、发酵液的一般特征有哪些?发酵液预处理的目的和要求有哪些?2、发酵液预处理的方法有哪些?并简述各种方法的原理和特点?3、发酵液过滤的目的是什么?影响发酵液过滤速度的因素有哪些?第三章细胞分离技术1、常用细胞分离方法有哪些?并说明其原理。

2、什么是细胞破碎和细胞破碎率?细胞破碎的方法主要有哪些?其原理各是什么?3、什么是包含体?包含体形成的原因有哪些?包含体的溶解常用的试剂有哪些?4、蛋白质复性常用的方法有哪些?第四章沉淀技术1、沉淀的概念?2、常用的蛋白质沉淀的方法有哪几种(盐析法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法),各自的作用机理是什么?第五章萃取技术1、萃取,萃取剂,萃取液,萃余液的概念?2、萃取法的分类。

3、分配定律内容及其适用条件。

4、简述液液萃取的一般操作过程。

5、影响有机溶剂萃取的主要因素有哪些?如何选择有机溶剂?6、什么是乳化现象?消除乳化现象常用的方法有哪些?7、简述双水相的形成?并说明其形成的原因?8、常用的双水相系统的类型有哪些?影响双水相分配系数的主要因素有哪些?9、什么是液膜?并简述液膜的组成、液膜体系、液膜的分类、液膜分离机理、。

10、试述液膜的分离过程。

并简述影响液膜分离效果的因素。

11、简述胶团及反胶团的形成。

12、简述反胶团萃取蛋白质的原理。

说明影响反胶团萃取蛋白的主要因素。

13、制备反胶团系统的方法主要有哪些?14、简述反胶团萃取蛋白质的过程。

15、什么是液固萃取?什么是超临界流体?第六章膜分离过程1、什么是膜分离过程?2、根据推动力本质的不同膜分离过程分为哪几类?各种分离过程的原理是什么?3、膜的概念及膜的特征?4、什么是浓差极化?5、什么是膜污染?膜污染的控制方法有哪些?膜清洗方法主要有哪些?第七章吸附与离子交换1、吸附的概念。

生化分离工程复习题

生化分离工程复习题

生化分离工程复习题一、填空题1. 生化分离过程主要包括四个方面:、、、产品加工。

2. 发酵液常用的固液分离方法有和等。

3. 膜分离过程中所使用的膜,依据其膜特性(孔径)不同可分为、超滤膜、纳滤膜和;4. 离子交换分离操作中,常用的洗脱方法有和。

5. 等电聚焦电泳法分离不同蛋白质的原理是依据其的不同。

6. 典型的工业过滤设备有和。

7. 常用的蛋白质沉析方法有、和有机溶剂沉淀。

8. 离子交换树脂由、和可交换离子组成。

9. 超临界流体的特点是与气体有相似的,与液体有相似的。

二、单选题1.供生产生物药物的生物资源不包括()A. 动物B. 植物C. 微生物D. 矿物质2.下列哪个不属于初步纯化:( )A. 沉淀法B. 吸附法C. 亲和层析D. 萃取法3.HPLC是哪种色谱的简称()。

A. 离子交换色谱B.气相色谱C.高效液相色谱D.凝胶色谱4.其他条件均相同时,优先选用那种固液分离手段()A. 离心分离B. 过滤C. 沉降D. 超滤5.适合小量细胞破碎的方法是()A. 高压匀浆法B. 超声破碎法C. 高速珠磨法D. 高压挤压法6.有机溶剂沉淀法中可使用的有机溶剂为()A. 乙酸乙酯B. 正丁醇C. 苯D. 丙酮7.液-液萃取时常发生乳化作用,如何避免()A. 剧烈搅拌B. 低温C. 静止D. 加热8.盐析法与有机溶剂沉淀法比较,其优点是()A.分辨率高B.变性作用小C.杂质易除D.沉淀易分离9.工业上常用的过滤介质不包括()A. 织物介质B. 堆积介质C. 多孔固体介质D. 真空介质10.哪一种膜孔径最小()A. 微滤B. 超滤C. 反渗透D. 纳米过滤11.用于蛋白质分离过程中的脱盐和更换缓冲液的色谱是()A. 离子交换色谱B. 亲和色谱C. 凝胶过滤色谱D. 反相色谱12.“类似物容易吸附类似物”的原则,一般极性吸附剂适宜于从何种溶剂中吸附极性物质()A.极性溶剂B.非极性溶剂C.水D.溶剂13.下列细胞破碎的方法中,哪个方法属于非机械破碎法( )A. 化学法B. 高压匀浆C. 超声波破碎D. 高速珠磨14.离子交换树脂适用()进行溶胀A. 水B. 乙醇C. 氢氧化钠D. 盐酸15.使蛋白质盐析可加入试剂()A. 氯化钠B. 硫酸C. 硝酸汞D. 硫酸铵16.超临界流体萃取法适用于提取()A. 极性大的成分B. 极性小的成分C. 离子型化合物D. 能气化的成分17.最常用的干燥方法有()A. 常压干燥B. 减压干燥C. 喷雾干燥D. 以上都是18.分子筛层析指的是()A. 吸附层析B. 分配层析C. 凝胶过滤D. 亲和层析19.为加快过滤效果通常使用()A. 电解质B. 高分子聚合物C. 惰性助滤剂D. 活性助滤剂20.影响电泳分离的主要因素()A. 光照B. 待分离生物大分子的性质C. 湿度D. 电泳时间21.发酵液的预处理方法不包括()A. 加热B. 絮凝C. 离心D. 调pH22.哪种细胞破碎方法适用工业生产()A. 高压匀浆B. 超声波破碎C. 渗透压冲击法D. 酶解法23.液-液萃取时常发生乳化作用,如何避免()A. 剧烈搅拌B. 低温C. 静止D. 加热24.在葡聚糖与聚乙二醇形成的双水相体系中,目标蛋白质存在于()A. 上相B. 下相C. 葡聚糖相D. 以上都有可能25.使蛋白质盐析可加入试剂()A. 氯化钠B. 硫酸C. 硝酸汞D. 硫酸铵26.超滤技术常被用作()A. 小分子物质的脱盐和浓缩B. 小分子物质的分级分离C. 小分子物质的纯化D. 固液分离27.吸附色谱分离的依据是()。

生化分离工程技术复习题

生化分离工程技术复习题

一、填空题1. 生物产品的分离包括,,和。

2. 发酵液常用的固液分离方法有: 和等。

3. 离心设备从形式上可分为,,等型式。

4. 亲和吸附原理包括,和三步。

5. 多糖基离子交换剂包括和两大类。

6. 工业上常用的超滤装置有,,和。

7. 影响吸附的主要因素有,,,,和。

8. 离子交换树脂由,和组成。

9. 电泳用凝胶制备时,过硫酸铵的作用是;甲叉双丙烯酰胺的作用是;TEMED的作用是;11、超临界流体的特点是与气体有相似的,与液体有相似的;12、离子交换树脂的合成方法有和两大类;13、常用的化学细胞破碎方法有,,,和;14、离子交换分离操作中,常用的洗脱方法有和;15、等电聚焦电泳法分离不同蛋白质的原理是依据其的不同;17、亲和吸附原理包括,和三步。

二、名词解释1、超临界流体萃取:2、等电点沉淀法:3、盐析沉淀法:4、亲和层析法:5、三相点:三、是非题1、冷冻升华干燥过程是将湿物料在较低的温度下,冻结成固态,然后在高度真空下,将其水分直接升华成气态的干燥过程,该方法不适合处理青霉素、生物酶等热敏性物料。

2、在膜分离过程中,由于浓差极化的形成导致膜表面溶质浓度增大,溶质的通透性降低,故在使用中要尽量减少这种情况出现。

3、层析技术根据使用目的不用可分为制备层析技术及分析层析技术。

4、分子蒸馏是一种非平衡状态下的分离操作,它与常规蒸馏技术的原理是不同的。

5、萃取是利用溶质在两项之间分配系数的不同而使溶质分离的技术,分配系数差别越小萃取效果越好。

6、凝聚和絮凝原理不同,凝聚是在中性盐作用下,由于双电层排斥电位的降低而使胶体体系不稳定的现象。

絮凝是在高分子絮凝剂的作用下,通过架桥作用,使细胞和蛋白质聚集成粗大的絮凝团的过程。

7、细胞破碎就采用一定的方法,在一定程度上破坏细胞壁和细胞膜,设法使细胞内产物最大程度地释放到液相中,破碎后的细胞浆液经分离后再采用不同的分离手段进一步纯化的方法。

四、简答题1、请结合图示简述凝胶排阻色谱(分子筛)的分离原理。

生化分离工程

生化分离工程

生化分离工程复习资料第一章绪论1.生化分离工程的定义:为提取生物产品时所需的原理、方法、技术及相关硬件设备的总称,指从发酵液、动植物细胞培养液、酶反应液和动植物组织细胞与体液等中提取、分离纯化、富集生物产品的过程 (Downstream Processing)。

(生化物质主要包括氨基酸、蛋白质、多糖、核酸、抗生素、肽类物质、脂质和其他生化产品,其主要来源包括微生物、动物、植物和海洋生物等生物原料或者基因工程产物。

)2.生物分离技术在整个生物加工过程中的重要性可以从三个方面加以体现:第一,生物产物的特殊性;产物稳定性差(a 化学降解(pH , 温度); b 微生物降解(酶作用,染菌)[生物活性物质的稳定性差,对PH、温度、金属离子、有机溶剂、剪切力、表面张力等十分敏感,易失活、变性]分批操作,生物变异性大第二,生物产物所处环境的复杂性;组分复杂(a 大分子;b 小分子;c 可溶物;d 不可溶物;e 化学添加物[除了产物外,还含有大量的细胞、代谢物、残留培养基、无机盐等;]产物浓度低的水溶液 (原因:a 氧传递限制;b 细胞量;c 产物抑制 ) 第三,对生物产品要求的严格性;质量要求高(药品或食品)[含目的产物的初始物料组成复杂,生化产品种类繁多,包括了大、中、小分子量的结构和性质复杂又各异的生物活性物质;生化产品的应用面广,许多产品用作医药、食品、试剂等,对含量和纯度要求高等。

]从而导致下游加工过程度成本往往占整个生物加工过程生产成本的大部分。

(教材中列出了若干生物制品生产过程中分离过程的成本)因此,下游加工过程的成本往往决定整个生物加工过程的成败,设计合理的下游加工过程可大大降低目标产品的生产成本,实现更大规模上的商业生产。

评价生化物质分离纯化技术的标准是纯度、收率和成本等三个因素,应从这三个方面进行综合考虑和优化才能决定最佳工艺技术。

3.下游加工技术的一般流程参照教材第3页图1.1强调如下几点:第一,流程图包括了本课程所涉及的大部分教学内容;第二,一个目标产物的获得需要进行多步处理,这样导致总收率的降低。

生化分离工程复习提纲

生化分离工程复习提纲

包涵体
---一种蛋白质不溶性聚集体,包括目标蛋白、菌体蛋白等。

目标蛋白一级结构是正确的,但立体结构是错误的,所以没有生物活性。

形成:大肠杆菌中目标产物的表达水平过高,超过正常代谢水平,
内,形成不溶性的包涵体。

第四章
离心分离的特点(选择)
优点:分离速度快、分离效率高、液相澄清度好;
②支撑液膜
支撑液膜是由溶解了载体的膜相液,在表面张力作用下,依靠聚合凝胶层中的化学反应或带电荷材料的静电作用,含浸在多孔支撑体的微孔内而制成,见图。

由于将
可以承受较大的压力,且具
支撑液膜的性能与支撑体材质、厚度。

生化分离工程期末考试复习资料

生化分离工程期末考试复习资料

生化分离工程期末考试复习资料第一章1、什么是生物分离工程?生化分离工程:也称生物技术下游加工过程(Downstream Processing),从发酵液或酶反应液或动植物细胞培养液中分离、纯化生物产品的过程。

2、生物产品不同于化工产品的特点(发酵液特点)。

A:①产物浓度低的水溶液②组分复杂③产物稳定性差,大分子,小分子④质量要求高3、生化分离下游加工过程的一般流程及各流程所包含单元操作。

①发酵液的预处理与固液分离(絮凝,离心,过滤,微过滤)②细胞破碎技术(球磨,高压匀浆,冷冻破碎、化学破碎技术)③初步纯化技术(产物提取)(盐析法,有机溶剂沉淀,化学沉淀,大孔吸附树脂,膜分离技术)④高度纯化技术(产物精制)(各类层析,亲和,疏水,聚焦,离子交换,凝胶层析)⑤成品加工(喷雾干燥,气流干燥,沸腾干燥,冷冻干燥,结晶)4、生物下游加工过程的选择准则①步骤少②次序合理:a应选择不同分离纯化机理的方法联合使用:b应首先选择能除去含量最多杂质的方法:c应尽量选择高效的分离方法:;d应将最费时、成本最高的分离纯化方法安排在最后阶段③产品规格:用成品中各类杂质的最低存在量来表示,它是确定纯化要求的程度及由此而产生的下游加工过程方案选择的主要依据(注射,非注射,去除热原质);④生产规模:琼脂糖凝胶、冷冻干燥⑤物料组成:丝状菌——适合过滤,不适合中空纤维膜⑥产品形式:固体适当结晶;液体适当浓缩⑦产品稳定性:调节操作条件,使由于热、pH值或氧化所造成的产品降解减少到最低程度。

如蛋白质的巯基容易氧化,使用抗氧化剂;⑧物性:溶解度、分子电荷、分子大小、功能团、稳定性、挥发性⑨危害性:溶剂萃取;基因工程菌发酵;干燥过程的防护和粉尘排放;固定化过程溴化氰。

⑩废水处理:BOD、COD第二章1、发酵液为什么要预处理(目的)?有哪些方法?以及各方法的原理。

A、促进从悬浮液中分离固形物的速度,提高固液分离的效率:⑪改变发酵液的物理性质降低液体黏度;⑫相对纯化,去除发酵液中的部分杂质以利于后续各步操作;⑬尽可能使产物转入便于后处理的一相中(1)加热法a)加热降低液体粘度;b)加热使蛋白质变性凝固,去除杂蛋白(2)调节悬浮液的pH值pH值直接影响发酵液中某些物质的电荷性质,适当调节pH值可改善其过滤特性。

生化分离工程基本概念复习要点

生化分离工程基本概念复习要点

生化分离工程基本概念复习要点生化分离工程基本概念复习要点一类1、过滤是指利用多孔介质(滤布)截留固液悬浮液中的固体粒子,进行固液分离的方法。

速度和质量是过滤操作的指标,滤饼阻力是关键,故先多对滤液絮凝或凝聚处理,或加助滤剂如硅藻土等。

2、广泛用于生化实验室及生化工业的分离设备是离心机,根据其离心力大小可分为:低速离心机、高速离心机和超离心机。

细胞的分离一般可用低速离心机或高速离心机,蛋白质的分离一般要用超离心机。

3、膜在分离过程中功能:①物质的识别与透过;②相界面;3、反应场。

4膜分离过程的实质是物质透过或被截留于膜的过程,按分离粒子大小进行分为微滤(MF)超滤(UF)反渗透(RO)透析(DS)电渗析(ED)和渗透气化(PV)等,其中传质推动力为压差和浓差,适合于有机物与水分离,共沸物分离的是渗透气化(PV)。

5、膜组件主要有管式、中空纤维、螺旋卷绕式、平板式,其共同的特点是尽可能大的膜表面积、可靠的支撑装置、可引出透过液、膜表面浓度差极化达到最小。

6、双水相萃取的特点为:平衡时间短、含水量高、界面张力低、为生物活性物质提供了温和的分离环境。

操作简便、经济省时、易于放大。

7、液膜根据结构可分为多种,但具有实际应用价值的主要有三种乳状液膜、支撑液膜、流动液膜。

8、在双水相系统中,影响分配系数的主要因素有,成相聚合物分子质量和浓度、盐的种类和浓度、PH值、温度。

9、溶质、溶剂、萃取剂、萃取相、萃余相10、超临界流体的密度接近于液体,这使它具有液体溶剂相当的萃取能力;超临界流体的粘度和扩散系数又于气体相近似,而溶剂的低粘度和高扩散系数的性质也是有利于传质。

11、离子交换树脂按活性基团不同可分为强酸性阳离子交换树脂在PH1~14范围内均可使用、弱酸性阳离子交换树脂、强碱性阴离子交换树脂、弱碱性阴离子交换树脂只能在PH<7的溶液中使用,按理化性质分类透明的凝胶型树脂,吸水后形成微细的空隙,失水后,孔隙消失。

《生化分离工程》整理

《生化分离工程》整理

第一章绪论1、何为生化分离技术?其主要研究那些内容?生化分离技术是指从动植物组织培养液和微生物发酵液中分离、纯化生物产品的过程中所采用的方法和手段的总称。

第二章预处理、过滤和细胞破碎6、影响过滤的因素及改善措施?影响过滤性能的因素主要有:①混合物中悬浮微粒的性质和大小;②混合液的粘度;③操作条件:固液分离操作中温度、pH、操作压力、滤饼厚度等;④助滤剂的使用;⑤固液分离设备和技术改善过滤性能的方法:工艺上一般采用降低混合液粘度的方法、增大被分离颗粒的粒度或者在混合液中加入助滤剂的方法、提高离心机的转速或提高操作压力、增大真空度、降低滤饼层的厚度,或除去滤饼等方法以改善过滤性能。

1、机械法细胞破碎与非机械破碎相比有何特点?2、细胞破碎主要有那几种方法?10、何谓化学法破碎细胞?其原理是什么?包括那几种?细胞破碎技术:(一)机械法①珠磨法:在磨腔中装入小玻璃球或小钢球,由电动机带动搅拌碟片高速搅拌微生物细胞悬浮物和小磨球而产生剪切力,将细胞破碎,释放出内含物。

一般有立式或卧式两种珠磨机;②高速匀浆法:利用高压使悬浮液通过针形阀,由于突然减压和高速冲击撞击环使细胞破碎。

设备是高速匀浆器,由高压泵和均压阀组成;③超声破碎法:另一种液相剪切破碎法,常为实验室方法.当通过超声探头向悬浮液输入声能,大量声能转化成弹性波形式的机械能,引起局部的剪切梯度,使细胞破碎。

(二)非机械方法①酶法溶胞:利用酶分解细胞壁上特殊的化学键使之破裂。

②化学法:用某些化学试剂溶解细胞壁或抽提细胞中某些组分,改变细胞壁或膜的通透性,从而使内含物有选择性地渗透出来。

包括酸碱条件改变pH、有机溶剂法、表面活性剂法等。

③物理法如渗透压冲击法、冻融法、干燥法等。

11、何为包涵体?包涵体中分离产物一般包括哪几个步骤?所谓包涵体是指蛋白质分子本身及与其周围的杂蛋白、核酸等形成不溶性的,无活性的聚集体,其中大部分是克隆表达的目标产物蛋白。

从包涵体中分离产物的处理步骤为:收集菌体细胞→细胞破碎→离心分离→包涵体的洗涤→目标蛋白的变性溶解→目标蛋白的复性。

生化分离工程复习

生化分离工程复习
2
生化产品的一般特点
1) 体系复杂:目的产物存在于非常复杂的体系中
组分复杂(a 大分子;b 小分子;c 可溶物;d 不可溶 物;e 化学添加物)
生物技术产品以粗料发酵为主,增加了下游操作成 本及废液处理成本
目前发酵或培养分批操作,各批差异,还有染菌发 酵液。
3
2) 目标产物浓度低、杂质含量高
许多工艺设计理论性不强,实验结果常带有很大经验成分。
7
分离效果的评价
1)浓缩率(富积率,concentration factor)
原料(Raw material)
分离器
产品(Product)
FW, VW, cT,W, cX,W
废液(Waste fluid)
如mT >1,则目标产物得到富积;
8
2)分离度
捣碎法 研磨法 匀浆法 超声法 温度差破碎法 压力差破碎法
有机溶剂: 表面活性剂: 酸碱 自溶法 外加酶制剂法
26
细胞壁的组成和结构
微生 物 壁厚
层次 主要 组成
革兰氏 阳性细菌
20-80 nm
革兰氏 阴性细菌
10-13 nm
单层
多层
肽聚糖(40-90%) 肽聚糖 (5-10%)
多糖
脂蛋白
胞壁酸
脂多糖(11-22%)
操作形式: A、离心沉降;B、离心过滤;C、密度梯度(超离心)。
25
细胞破碎技术
机械破碎 物理破碎 化学破碎 酶促破碎
通过机械运动产生的剪切力, 使组织、细胞破碎。
通过各种物理因素的作用,使组 织、细胞的外层结构破坏,而使 细胞破碎。
通过各种化学试剂对细胞膜的 作用,而使细胞破碎
通过细胞本身的酶系或外加酶制 剂的催化作用,使细胞外层结构 受到破坏,而达到细胞破碎

生化分离技术复习题及答案

生化分离技术复习题及答案

离心技术1、什么是离心技术?这种技术主要应用于哪些方面?离心技术是分子生物学和生物化学研究中不可缺少的一种技术。

它是利用物质沉降系数、密度、浮力等方面的差别,用强大的离心力场将其分离、浓缩、纯化和鉴定的技术。

离心技术既可以是制备性的也可以是分析性的。

处理的样品可多可少(几千L至0.2mL以下),应用范围十分广泛。

这项技术应用很广,诸如分离出化学反应后的沉淀物,天然的生物大分子、无机物、有机物,在生物化学以及其它的生物学领域常用来收集细胞、细胞器及生物大分子物质。

2、离心机的种类有哪些?主要性能如何?根据性能,离心机分为三种类型,即低速离心机(转速在2000~6000r/min之间,最大RCF可达6000g)、高速离心机(转速在18000~25000r/min之间,最大RCF 可达60 000g)、超速离心机(转速在40 000~100 000r/min之间,最大RCF可达803 000g)。

超速离心机按性能又分为分析型、制备型和分析制备型三类。

3、超速离心机主要由哪四个部分构成?分析性离心机构造的特点是什么?超速离心机主要由驱动和速度控制、温度控制、真空系统和转头四部分组成。

分析性离心机使用了特殊设计的转头和光学检测系统,以便连续地监视物质在一个离心场中的沉降过程。

从而确定其物理性质。

分析性超速离心机的转头是椭圆形的,以避免应力集中于孔处。

此转头通过一个有柔性的轴联接到一个高速的驱动装置上,转头在一个冷冻的和真空的腔中旋转,转头上有2~6个装离心杯的小室,离心杯是扇形石英的,可以上下透光,离心机中装有一个光学系统,在整个离心期间都能通过紫外吸收或折射率的变化监测离心杯中沉降着的物质,在预定的期间可以拍摄沉降物质的照片,在分析离心杯中物质沉降情况时,在重颗粒和轻颗粒之间形成的界面就像一个折射的透镜,结果在检测系统的照像底板上产生了一个“峰”,由于沉降不断进行,界面向前推进,因此峰也移动,从峰移动的速度可以计算出样品颗粒的沉降速度。

生化分离工程复习题综述

生化分离工程复习题综述

概念题:1生物分离技术:是指从动植物与微生物的有机体或器官、生物工程产物(发酵液、培养液)及其生物化学产品中提取、分离、纯化有用物质的技术过程。

2凝聚:在电解质作用下,破坏细胞菌体和蛋白质等胶体粒子的分散状态,使胶体粒子聚集的过程。

3.絮凝:指在某些高分子絮凝剂存在下,在悬浮粒子之间发生架桥作用而使胶粒形成粗大的絮凝团的过程.4.分配系数:在一定温度、压力下,溶质分子分布在两个互不相溶的溶剂里,达到平衡后,它在两相的浓度为一常数叫分配系数。

5.过滤:是在某一支撑物上放过滤介质,注入含固体颗粒的溶液,使液体通过,固体颗粒留下,是固液分离的常用方法之一。

6.吸附:是利用吸附剂对液体或气体中某一组分具有选择性吸附的能力,使其富集在吸附剂表面的过程.7.离子交换:利用离子交换树脂作为吸附剂,将溶液中的待分离组分,依据其电荷差异,依靠库仑力吸附在树脂上,然后利用合适的洗脱剂将吸附质从树脂上洗脱下来,达到分离的目的。

8.色谱技术:是一组相关分离方法的总称,色谱柱的一般结构含有固定相(多孔介质)和流动相,根据物质在两相间的分配行为不同(由于亲和力差异),经过多次分配(吸附-解吸-吸附-解吸),达到分离的目的。

9.膜分离:利用膜的选择性(孔径大小),以膜的两侧存在的能量差作为推动力,由于溶液中各组分透过膜的迁移率不同而实现分离的一种技术。

10.超临界流体:超临界流体是状态超过气液共存时的最高压力和最高温度下物质特有的点——临界点后的流体。

11.萃取:当含有生化物质的溶液与互不相溶的第二相接触时,生化物质倾向于在两相之间进行分配,当条件选择得恰当时,所需提取的生化物质就会有选择性地发生转移,集中到一相中,而原来溶液中所混有的其它杂质(如中间代谢产物、杂蛋白等)分配在另一相中,这样就能达到某种程度的提纯和浓缩。

12.Aqueous Two Phase Extraction双水相萃取:双水相现象是当两种聚合物或一种聚合物与一种盐溶于同一溶剂时,由于聚合物之间或聚合物与盐之间的不相容性,当聚合物或无机盐浓度达到一定值时,就会分成不互溶的两相。

生化分离工程 复习题

生化分离工程 复习题

生化分离工程(bioseparation engineering)通过微生物发酵过程、酶反应过程或动植物细胞大量培养获得生物化工产品,从上述发酵液、反应液或培养液中分离、精制有关产品的过程即称为生化分离工程或称下游加工过程(downstream processing)。

上游:菌种,基因工程,分子生物学,遗传学中游:微生物发酵工程,动植物细胞培养,海洋生物培养下游:生物分离工程生物分离过程的一般流程生物分离工艺要求:(1) 高纯度(2) 大规模(3) 经济性(4) 生物相容性对产物的要求:保持生物产物的活性;纯度要求高当生物技术产品是食品或药物时,要求无污染物、无对映体、无病毒、无热原无致敏原。

从发酵液和细胞培养液中提取所需生化物质的第一步,分两部分:预处理和固液分离发酵液预处理的原因:液相粘度大,大多为非牛顿型流体,不易过滤,所需物质多在液相。

发酵产物浓度较低,大多为1-10%,发酵液成分复杂,不利于提取产物预处理的目的促进从悬浮液中分离固形物的速度,提高固液分离的效率:⑴改变发酵液的物理性质,包括增大悬浮液中固体粒子的尺寸,降低液体黏度。

⑵相对纯化,去除发酵液中的部分杂质(高价无机离子和杂蛋白质),以利于后续各步操作。

⑶尽可能使产物转移进入便于后处理的一相中(多数是液相);发酵液杂质的去除:1/ 15不同杂质的去除方法:发酵液成分复杂,目标产物与各种杂质溶解在一起。

这些杂质中对提取影响最大的是高价无机离子和杂蛋白。

无机离子的去除:钙离子,在发酵液中加入草酸,可出去钙离子。

镁离子,由于发酵液中镁离子含量通常不高,利用草酸很难完全出去镁离子。

此时,可加入三聚磷酸钠,三聚磷酸钠与镁离子形成可溶性络合物,即可除去镁离子。

铁离子,发酵液中的铁离子,一般用黄血岩去除,使其形成普鲁士蓝沉淀。

可溶性蛋白质的去除:①盐析法②等点沉淀法③有机溶剂沉淀法④其他沉淀法⑤加热法⑥吸附法蛋白质盐析常用的中性盐,主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。

生物分离工程判断复习题与参考答案

生物分离工程判断复习题与参考答案

生物分离工程判断复习题与参考答案一、判断题(共100题,每题1分,共100分)1、极性溶剂与非极性溶剂互溶。

A、正确B、错误正确答案:B2、SDS-CTAB属于非离子表面活性剂水胶束两水相体系。

A、正确B、错误正确答案:B3、液膜能把两个互溶但组成不同的溶液隔开。

A、正确B、错误正确答案:A4、影响电泳分离的主要因素电泳时间。

A、正确B、错误正确答案:B5、阴离子交换剂可交换的为阳离子。

A、正确B、错误正确答案:B6、阳离子交换剂可交换的为阴、阳离子。

A、正确B、错误正确答案:B7、要增加目的物的溶解度,往往要在目的物等电点附近进行提取。

A、正确B、错误正确答案:B8、絮凝是物理环境的变化引起的溶质的溶解度降低、生成固体凝聚物的现象。

A、正确B、错误正确答案:B9、通过加入某些反应剂是发酵液进行预处理的方法之一。

A、正确B、错误正确答案:A10、用来提取产物的溶剂称萃余液。

A、正确B、错误正确答案:B11、真空转鼓过滤机工作一个循环经过过滤区、缓冲区、再生区、卸渣区。

A、正确B、错误正确答案:A12、临界压力是液化气体所需的压力。

A、正确B、错误正确答案:B13、压力是在重力场中,颗粒在静止的流体中降落时受到的力。

A、正确B、错误正确答案:B14、颗粒与流体的密度差越小,颗粒的沉降速度越小。

A、正确B、错误正确答案:A15、结晶过程中,溶质过饱和度大小不仅会影响晶核的形成速度,而且会影响晶体的长大速度。

A、正确B、错误正确答案:A16、按分离原理不同,电泳可分为纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳。

A、正确B、错误正确答案:B17、在生物制剂制备中,常用的缓冲系统有磷酸盐缓冲液;碳酸盐缓冲液;盐酸盐缓冲液;醋酸盐缓冲液等。

A、正确B、错误正确答案:B18、在液膜分离的操作过程中,膜溶剂主要起到稳定液膜的作用。

A、正确B、错误正确答案:B19、蛋白质类的生物大分子在盐析过程中,最好在高温下进行,因为温度高会增加其溶解度。

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生化分离工程
复习
据各种资料统计,分离纯化过程所需的费用要占产品总成 本的很大比例,按产品不同。 对抗生素生产而言,分离纯化部分的投资费用约为发酵部 分的4倍;对有机酸或氨基酸生产而言,则为1.5倍;对基 因工程药物,分离纯化技术的要求更高,如重组 DNA 蛋 白质精制的费用可占整个生产费用的 80~90%;对于血液 制品,分离纯化几乎占整个生产费用的100%。 因此人们逐渐认识到下游工程的落后有可能会阻碍生物技 术的发展。
(2) 从包涵体中获取活性蛋白
②包涵体溶解和表达产物变性
溶解包涵体通常使用变性剂盐酸胍和尿素以及表 面活性剂 SDS 。这三种试剂溶解包涵体原理不同。 盐酸胍和尿素破坏离子间相互作用,解除维系蛋 白质稳定性的非共价键,引起蛋白质的去折叠和 变性,但它们不破坏共价键;
SDS主要破坏蛋白质肽键间的疏水相互作用
3.1.2 GM-CSF的分离和纯化
V).色谱法纯化 V-I)疏水色谱
将 Phenyl-Sepharose 6 FF 色 谱 柱 用 50mmol/L 磷 酸 -7% (NH4)2SO4液(pH6.9)平衡。
复性粗产品加入( NH4)2SO4 使其浓度达 7%(w/v) ,上样。
用 50mmol/L 磷酸 -7% ( NH4)2SO4 液 (pH6.9) 、 20mmol 磷 酸盐缓冲液( pH7.0 )及 30% 异丙醇依次洗脱, 280nm 紫 外检测,收集洗脱峰,电泳(银染色)检定。
3.1.2 GM-CSF的分离和纯化
V-III)凝胶色谱
装Sephacryl S 200色谱柱,以20mmol/L磷酸盐0.l5mol/L NaCl 液 (pH6.5) 平衡,上步目的产物上 样后以相同的缓冲液进行洗脱,收集吸收峰,产 品经0.2m滤膜过滤。
本法所得 rhGM-CSF 产品,经 HPLC 检测为单一 峰,纯度为 99% ; SDS-PAGE 显示为一条带,分 子量为14kD;生物活性为1.59107~1.86107u/mg
3.1.1 GM-CSF的特性
分泌到细胞外的成熟人由 127个氨基酸残基组成,分子量 为22kD。 不同来源的 GM-CSF分子量范围为 14.5kD35kD,分子量 差异是由糖基化程度不同造成的。但糖基化程度不同的 GM-CSF生物学活性却没有明显的不同,甚至有报道大肠 杆菌表达的非糖基化 GM-CSF 比真核细胞表达的糖基化 GM-CSF具有更高的生物学活性。
常用的氧化剂有:氧化型谷胱甘肽和空气(在碱性条件下)。
谢谢大家!
III).包涵体的洗涤
上 述 沉 淀 加 入 9 倍 体 积 20mmol/L 磷 酸 盐 缓 冲 液 ( 含 0.5%TritonX I00),5000g离心30min,沉淀加入9倍体积 20mmol/L磷酸盐缓冲液(含0.5mol/L脲),同法离心,沉淀 加入 6倍体积 20mmol磷酸盐缓冲液 (含5mmol/L EDTA), 以10000g离心30min,收集沉淀。
(2) 从包涵体中获取活性蛋白
由于表达产物、宿主以及培养和诱导条件的差异, 溶解包涵体所用的试剂和浓度也会有很大差异, 一般先进行予试验,测定包涵体中表达产物开始 溶解和完全溶解所需试剂浓度及作用时间。
一般能使表达产物溶解的盐酸胍浓度为 5~8mol/L, 尿素为6~8mol/L,SDS浓度在l%~2%(w/v)之间。 不同溶解剂对层析分离影响不同,也需要予以关 注。
滤液中加尿素至 5mol/L ,并调 pH 至 4.0 ,静置 2h , 以 解 离 hNGF 高 分 子 聚 合 体 。 8000r/min 离 心 30min,收集上清液。
3.2.2 分离纯化 III) 超滤分离
上清液以分子量截留值为 30kD 的超滤膜超 滤,滤液再用 10kD 的超滤膜超滤,当截留 液 剩 下 约 1000ml 时 , 在 其 中 加 pH4.0 、 50mmol/L NaAc-HAc( 含 0.4mol/L NaCl) 缓 冲液(平衡缓冲液)2000ml,再浓缩至1000ml, 反复5次,收集截留液,对平衡缓冲液充分 透析。
II).细胞破碎与包涵体的收集 沉淀(菌体细胞)加 4 倍体积 20mmol/L 磷酸盐缓冲液 ( 含 5mmol/L EDTA),冷浴搅匀,置超声破碎器中破菌,每次 30s,间隔30s,反复破碎直至革兰染色镜检无完整的菌体止。 5000g离心30min,去上清,沉淀即含有包涵体。
3.1.2 GM-CSF的分离和纯化
一、 分离纯化的一般步骤
(1) 发酵液的预处理和固液分离 ;
(2) 初步分离(提取) ;
(3) 高度纯化(精制) ;
(4) 成品加工。
二、多肽和蛋白质的纯化
多肽和蛋白质的纯化包括两部分内容。 一是将蛋白质与非蛋白质分开,二是将不同的蛋白质分开。 对非蛋白部分可以根据其性质采用适当的方法去除。而对于不同蛋白 质的分离则可以利用它们之间性质上的差异进行。常用的方法有: (一)利用溶解度不同的纯化方法 有盐析法、有机溶剂法、等电点沉淀 法、加热变性法等。 (二)利用分子形状和大小不同的纯化方法 凝胶层析法、透析法等。 (三)利用电离性质不同的纯化方法 离子交换法、电泳法等。 (四)利用生物功能专一性的不同纯化蛋白质 亲和层析法等。
3.2 人神经细胞生长因子
神经生长因子(nerve growth factor, NGF) 是神经系统最重要的生物活性分子之一, 也是最早发现和最典型的神经营养因子, 它们影响外周神经及中枢神经系统某些神 经元的存活与分化,可促进损伤神经系统 的再生与修复。
NGF还具有免疫调节作用。
3.2.1 NGF的特性
(1) 包涵体的制备与处理
包涵体的制备主要包括菌体细胞的破碎与 包涵体的洗涤与收集两步。
菌体的破碎可用前面所述的各种方法,如 超声波法。 包涵体的洗涤与收集一般采用含不同添加 剂的磷酸盐缓冲液通过离心进行,收集沉 淀。
(2) 从包涵体中获取活性蛋白
从包涵体中获取活性蛋白,需要对其进行处理。对包涵体 产物的处理包括三个步骤: ①包涵体溶解前处理 在变性条件下溶解包涵体可将表达产物变为可溶形式,以 利于分离纯化。 在溶解包涵体前,先用温和表面活性剂 ( 如 Triton X-100) 或低浓度弱变性剂(如尿素)处理,除去脂质和部分膜蛋白, 使用浓度以不溶解包涵体中的表达产物为原则。
本例是以人胎盘为原料提取hNGF。
I). 胎盘绒毛的分离
取人足月胎盘,用注射器向脐带总动脉注 入生理盐水,并轻揉胎盘,直至洗尽血污, 分离绒毛叶。
3.2.2 分离纯化 II) 提取
将 来 自 100 个 胎 盘 的 绒 毛 叶 28kg 剪 碎 , 加 20% (v/w)预冷的PBS(pH6.8,含lmmol/L EDTA), 匀浆,每次3min,共3次。 匀浆液在4C 8000r/min离心30min,上清以尼龙 膜过滤,除去脂肪。
IV).包涵体的变性与复性 上 步 沉 淀 加 入 8mol/L 脲 溶 液 , 振 摇 l2h , 40000g 离 心 30min 。用逐步稀释法将上清液脲浓度稀释至 0.lmol/L , 复 性 24h , 以 17000g 离 心 30min , 上 清 液 即 为 复 性 的 rhGM-CSF粗产品。
包涵体
多数重组蛋白表达产物是以不溶性表达产物存在 于细胞内的,这种不溶性表达产物称为包涵体。 这类产物的分离制备相对较复杂。 包涵体基本上由蛋白质组成,其中大部分是克隆 基因表达产物,因无正确折叠的立体结构而没有 活性。其它成分有细胞RNA聚合酶、膜蛋白、核 糖体RNA、质粒DNA和质粒编码蛋白以及脂质、 肽聚糖、脂多糖等。
三、蛋白质分离纯化举例
3.1 重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 人 粒 细 胞 - 巨 噬 细 胞 集 落 刺 激 因 子 ( human granulocytemacrophage colony stimulating factor, GM-CSF)是一种可 由体内多种细胞产生的细胞因子,如激活的T、B淋巴细胞、 成纤维细胞、内皮细胞等,可作用于造血干细胞,促进其增 殖、分化,形成中性粒细胞和巨噬细胞群,同时还能刺激噬 酸性粒细胞、巨核细胞、多浅能性和早期红细胞的形成和增 殖。 1993年获美国 FDA批准重组GM-CSF( rhGM-CSF)用于临 床。主要用于治疗肿瘤化疗产生的造血障碍、再生障碍性贫 血、骨髓异常增生综合征等,还用于增强免疫、骨髓移植等。
3.1.2 GM-CSF的分离和纯化 Nhomakorabea V-II)离子交换色谱 装DEAE-Sepharose FF色谱柱,以20mmol/L磷酸 盐缓冲液(pH6.5)平衡至基线。 加上步得到的目的产物,以20mmol/L磷酸盐缓冲 液 (pH6.5) 、 20mmol/L 磷酸盐 -0.l5mol/L NaCl 液 (pH6.5)、20mmol/L磷酸盐-lmol/L NaCl液(pH6.4) 分别洗脱,收集洗脱峰,电泳检定。
人 NGF ( hNGF )的前肽原含 241 个氨基酸 残基,信号肽为18个氨基酸残基。
成熟 hNGF 为 l20 个氨基酸残基,分子量为 1.3kD ,有 1 个 N- 糖基化位点, 6 个 Cys 残基, 形成3个链内二硫键,pI为8.86。 在体内以二聚体存在。
3.2.2 分离纯化
3.2.2 分离纯化 IV) 离子交换色谱纯化
透析液上预先以平衡缓冲液平衡的 CM52离子交换 纤维素(9.2cm30cm)柱,上完样后以平衡缓冲液洗 脱穿过峰,换用 pH9.0 、 50mmol/L Tris- 盐酸缓冲 液 洗 脱 , 最 后 以 pH9.0 、 含 0.5mol/L NaCl 的 50mmol/L Tris- 盐酸缓冲液洗脱,收集洗脱峰 ( 含 hNGF)。 本 制 备 工 艺 从 100 个 胎 盘 可 提 取 纯 化 得 hNGF 约 148.6mg , 比 活 约 为 15000u/mg ; 产 品 经 SDSPAGE银染显示其分子量约 14.4kD,为单一条带; 经TSK2000SW HPLC层析得到单一峰。
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