几种新型植物基因表达载体的构建方法
生物技术 园艺植物基因工程步骤
生物技术园艺植物基因工程步骤
园艺植物基因工程是指通过生物技术手段对园艺植物的基因进行改变或调控，以获得所需的遗传特性。
其步骤主要包括以下几个方面：
1. 目标设定：确定要改变的遗传特性和目标基因，例如提高植物的产量、抗性、品质等。
2. 基因克隆：从目标植物中提取DNA，并使用分子生物学技术将目标基因扩增、纯化，以获得目标基因片段。
3. 基因构建：将目标基因片段插入植物基因工程载体（例如农杆菌载体），并利用适当的限制性内切酶将其与载体DNA连接起来，形成重组DNA。
4. 转化方式选择：选择适合的转化方法将重组DNA导入目标植物细胞，主要有农杆菌介导转化、生物弹射法或冷冻融合法等。
5. 遗传转化：将经过构建的重组DNA导入植物细胞，使目标基因插入植物染色体，形成转基因植物。
6. 试管繁殖：对转基因植物进行离体培养，通过细胞分裂和组织增殖等技术，大规模繁殖转基因植物。
7. 筛选和鉴定：利用分子生物学和生化分析等技术对转基因植物进行鉴定和筛选，确认目标基因的存在和表达情况。
8. 田间试验和推广：在试验田或实际种植场进行转基因植物的田间试验，评估其生长发育、产量、品质和抗性等性状，同时进行安全性评估和环境风险评估。
9. 商业化推广：通过权威部门的安全评估和监管审核，将合格的转基因植物品种进行商业化推广，使其广泛应用于园艺产业。
需要注意的是，园艺植物基因工程步骤可能会因具体目标和植物而有所差异，以上步骤仅供参考。
植物表达载体构建
共同特点
启动子的活化受到物理或化学信号的诱导； 启动子的分子结构都具有增强子、沉默子或类
似功能的序列结构； 感受特异性诱导的序列都有明显的专一性； 一部分该类型的启动子同时具有组织特异性表
达的特点； 该类启动子常以诱导信号命名，可分为光诱导
表达基因启动子、热诱导表达基因启动子、创 伤诱导表达基因启动子、真菌诱导表达启动子 和共生细菌诱导表达基因启动子。
在适宜条件下该酶可将X-Gluc水解生成蓝色物 质。 初始产物并不带有颜色，为无色的吲哚衍生物， 后经氧化二聚作用形成5，5‘-二溴-4，4’-二氯 靛蓝染料，使具有Gus活性的部位或位点呈现 蓝色。 注意：在测定时，由于植物体内的过氧化物酶 能促进氧化二聚作用，使颜色加深，所以染色 程度不能准确反映Gus活性，
植物表达载体构建
张玉刚 zyg4458@
载体 vector
克隆载体
载
体
原核表达载体
表达载体 真核表达载体
植物表达载体
质粒图谱及质粒构建
启动子 外源基因 终止子 启动子 报告基因 终止子
目的片段
（标记基因） 选择标记
载体
表达载体(expressing vector)
特点：带表达构件—转录和翻译所需的DNA序 列
Figure 1 a) Mature cold stored potato tubers, transformed and control, stained for GUS activity. b) In vitro-grown microtubers, transformed and control, stained for GUS activity
GUS酶的显色反应以底物不同而不同： 5-bromo-4-chloro-3-indole-B-D-glucuronide 靛蓝 5-bromo-6-chloro-3-indole-B-D-glucuronide 橘红 4-methylumbelliferyl-B-D-glucuronide 荧光产物
表达载体的构建方法及步骤
表达载体的构建方法及步骤一、载体的选择及如何阅读质粒图谱目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA 是一种新的非病毒转基因载体。
一个合格质粒的组成要素：（1）复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。
原核生物DNA 分子中只有一个复制起始点。
而真核生物DNA 分子有多个复制起始位点。
（2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+（3）多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段（4）P/E 启动子/增强子（5）Terms 终止信号（6）加poly（A）信号可以起到稳定mRNA 作用选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。
如果构建的目的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。
载体选择主要考虑下述3点：【1】构建DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。
【2】.载体的类型：（1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。
如<10kb 选质粒。
（2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。
（3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。
【3】载体MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不能产生阅读框架错位。
综上所述，选用质粒（最常用）做载体的5点要求：（1）选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载体）；（2）一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个。
（3）必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地；（4）必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr（试一试）。
（5）满足自己的实验需求，是否需要包装病毒，是否需要加入荧光标记，是否需要加入标签蛋白，是否需要真核抗性（如Puro、G418）等等。
植物农学中的新型植保技术
植物农学中的新型植保技术新型植保技术在植物农学中的应用植物农学作为一门研究植物生长、发育和利用的学科，一直以来都面临着植物病虫害对农作物产量和品质的威胁。
因此，研究人员一直致力于发展新型植保技术，以提高农作物的产量和品质，减少传统农药的使用。
本文将介绍几种在植物农学中的新型植保技术。
一、基因编辑技术基因编辑技术是一种能够直接修改植物基因组的技术，其主要方法是通过高效的DNA切割酶（如CRISPR/Cas9系统）来刻意地引发DNA断裂，并利用细胞自身的DNA修复机制进行修复。
通过基因编辑技术，可以针对植物病虫害相关基因进行精确编辑，从而实现对农作物的抗性改良。
例如，科学家们利用基因编辑技术成功开发出了多种具有抗性的转基因作物，如抗虫害的转基因玉米和抗病害的转基因番茄。
这些转基因作物的出现，使农民们能够以更低的成本和更少的农药使用来保护农作物免受病虫害侵害。
二、生物防治技术生物防治技术是指利用天然敌害生物来控制农作物病虫害的方法。
这一技术主要利用某些天敌生物对特定病虫害的亲和性或捕食性来实现病虫害防治。
与传统的化学农药不同，生物防治技术更加环保、可持续，并且不会对农作物、土壤和环境造成污染。
例如，在某些农田中引入对粘虫具有天敌作用的寄生性蜂类，就能够有效地控制粘虫的数量，提高农作物的产量，并降低农药的使用量。
此外，还有利用昆虫性信息素干扰病虫害的繁殖，以及利用细菌和真菌来阻断病原微生物的扩散等生物防治技术。
三、激素调控技术激素调控技术是利用植物自身激素在调控生长发育过程中的作用机制，来实现对病虫害的防治。
病虫害往往会对植物的生长发育过程产生负面影响，而植物激素的调控能够增强植物的抗性和免疫力，从而减轻病虫害对植物的伤害。
例如，研究人员发现，脯氨酸（Pro）和茉莉酸（JA）等植物激素能够在一定程度上抵抗病原菌和害虫的侵袭。
因此，通过激素调控技术，可以在农作物栽培和管理过程中，适时施用激素来增强植物的抗性能力，从而达到植物病虫害防治的目的。
几种新型植物基因表达载体的构建方法
几种新型植物基因表达载体的构建方法摘要:利用基因工程技术手段研究基因功能过程中，构建基因表达载体处于转基因植物的主导地位，采用合适的构建方法会使实验效果事半功倍。
植物基因表达载体的构建方法除了传统构建法、Gateway 技术、三段T-DNA 法、一步克隆法等，还有近年来出现的几种新型的载体构建方法：基于竞争性连接原理快速构建小片段基因表达载体；Micro RNA 前体PCR 置换法适用于构建小分子RNA 表达载体；重组融合PCR 法特别适用于插入片段中含有较多限制性酶切位点的载体构建；利用In-Fusion 试剂盒可以将任何目的片段插入一个线性化载体的某个区域；构建多片段复杂载体可采用不依赖序列和连接的克隆方法(Sequence and ligation-independent cloning, SLIC) 法；Gibson 等温拼接法。
本文将在总结分析前人工作的基础上，分析这6种新方法的特点，期望通过这几种新的方法给植物基因工程表达载体的构建提供新的思路。
关键词:Micro RNA 前体PCR 置换法，In-Fusion 试剂盒法，重组融合PCR 法，Gibson 等温拼接法，Golden Gate 拼接法基因克隆、载体构建是植物功能基因组研究中的常规步骤[ 1 ]。
而载体构建是基因工程和分子生物学研究中常用的基础技术。
随着植物基因工程技术的发展，适合于不同研究目的各种载体系统应运而生，其中在转基因植物中最常用的是质粒载体。
传统的载体构建方法在进行构建多片段拼接的复杂载体时，需要精心选择酶切位点[ 2 ]，有时还需要构建多个中间载体，操作比较麻烦，费时费力，因此寻找简单、高效、快捷的载体构建方法具有重要的现实意义。
从1969 年Arber 等发现了限制性切酶，载体的构建方法逐步发展，从传统构建方法到三段T-DNA、Gateway 等技术延伸出了许多新的载体构建方法。
本文结合自己的实验工作选择介绍了近年来其中几种新型的具有代表性的植物表达载体构建的方法，对其应用的方向、优缺点作出了评估，期望给植物基因工程表达载体的构建提供新的思路。
一种适用于多种植物的农杆菌介导基因瞬时表达的方法
随着科学技术的不断发展，人类对植物基因研究的需求也日益增加。
而农杆菌介导的基因瞬时表达方法则成为了植物基因研究领域的热门话题之一。
本文将围绕这一主题展开讨论。
一、农杆菌介导的基因瞬时表达方法简介农杆菌介导的基因瞬时表达方法是一种将外源基因导入植物细胞中并在短时间内表达的技术。
其原理是利用土壤中常见的植物致病菌——农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）来传递外源基因，使其经由农杆菌转座子插入到植物细胞的基因组中，从而实现目的基因的表达。
二、农杆菌介导的基因瞬时表达方法的优势1. 高效性：农杆菌介导的基因瞬时表达方法能够在短时间内使目的基因得到高效表达，为研究人员提供了更快捷、高效的研究手段。
2. 适用范围广：农杆菌介导的基因瞬时表达方法不仅适用于单一植物种类，还适用于多种植物，包括但不限于拟南芥、烟草、水稻等。
3. 可操作性强：相比于稳定转化方法，农杆菌介导的基因瞬时表达方法不需要等待植株成熟，而是直接在植物叶片上进行操作，省时省力。
三、农杆菌介导的基因瞬时表达方法的研究现状目前，科研人员对农杆菌介导的基因瞬时表达方法进行了大量探索与研究，不断优化该技术并拓展其应用范围。
通过改变农杆菌株系、转染条件、辅助基因等因素，有效提高了基因转化效率，并使其更适用于不同植物。
四、农杆菌介导的基因瞬时表达方法的应用前景随着生命科学领域的不断发展，对植物基因研究的需求逐渐增加，而农杆菌介导的基因瞬时表达方法正是满足这一需求的重要手段。
未来，该方法有望在植物遗传改良、抗病株培育、蛋白表达等方面发挥更为广泛的作用。
五、结语农杆菌介导的基因瞬时表达方法作为一种重要的植物基因研究技术，其独特的优势和潜在的应用前景吸引着越来越多的研究人员投入到相关领域的研究中。
随着技术的不断完善和发展，相信农杆菌介导的基因瞬时表达方法一定会为植物基因研究领域注入新的活力，为人类农业生产和生态环境的改善带来新的希望。
农杆菌介导的基因瞬时表达方法在植物基因研究领域中具有广阔的应用前景，其高效性和适用范围广的特点使其成为研究人员们研究植物基因功能和调控的重要工具。
叶绿体表达载体--如何构建载体
如何构建载体1启动子的选用和改造外源基因表达量不足往往是得不到理想的转基因植物的重要原因。
由于启动子在决定基因表达方面起关键作用，因此，选择合适的植物启动子和改进其活性是增强外源基因表达首先要考虑的问题。
目前在植物表达载体中广泛应用的启动子是组成型启动子，例如，绝大多数双子叶转基因植物均使用CaMV35S启动子，单子叶转基因植物主要使用来自玉米的Ubiquitin启动子和来自水稻的Actinl启动子。
在这些组成型表达启动子的控制下，外源基因在转基因植物的所有部位和所有的发育阶段都会表达。
然而，外源基因在受体植物内持续、高效的表达不但造成浪费，往往还会引起植物的形态发生改变，影响植物的生长发育。
为了使外源基因在植物体内有效发挥作用，同时又可减少对植物的不利影响，目前人们对特异表达启动子的研究和应用越来越重视。
已发现的特异性启动子主要包括器官特异性启动子和诱导特异性启动子。
例如，种子特异性启动子、果实特异性启动子、叶肉细胞特异性启动子、根特异性启动子、损伤诱导特异性启动子、化学诱导特异性启动子、光诱导特异性启动子、热激诱导特异性启动子等。
这些特异性启动子的克隆和应用为在植物中特异性地表达外源基因奠定了基础。
例如，瑞士CIBA-GEIGY公司使用PR-IA启动子控制转基因烟草中Bt毒蛋白基因的表达，由于该启动子可受水杨酸及其衍生物诱导，通过喷酒廉价、无公害的化学物质，诱导抗虫基因在虫害重发生季节表达，显然是一个十分有效的途径。
在植物转基因研究中，使用天然的启动子往往不能取得令人满意的结果，尤其是在进行特异表达和诱导表达时，表达水平大多不够理想。
对现有启动子进行改造，构建复合式启动子将是十分重要的途径。
例如，Ni等人将章鱼碱合成酶基因启动子的转录激活区与甘露碱合成酶基因启动子构成了复合启动子，GUS表达结果表示：改造后的启动子活性比35S启动子明显提高。
吴瑞等人将操作诱导型的PI-II基因启动子与水稻Actinl基因内含子1进行组合，新型启动子的表达活性提高了近10倍（专利）。
植物表达载体构建
卸甲载体（disarmed vector） 1．Onc-卸甲载体： 所谓的卸甲载体就是无毒的（ non-oncogenic）、即切 除了 Onc 致瘤基因的 Ti 质粒载体。在这种 Onc- 载体中，已 经缺失的T-DNA部位被大肠杆菌的一种常用质粒pBR322取 代。这样，任何适合于克隆在质粒中的外源DNA片段，都 可以通过与 pBR322 质粒 DNA 的同源重组，而被共整合到 Onc-Ti质粒载体上。最常用的 Onc-卸甲载体为pGV3850， 它保留了两个边界和右边界附近的 nos基因（胭脂碱合成酶 基因），可作为鉴别转化细胞的一个标记； T-DNA内部的 Onc 缺失 区被 pBR322 序 列（ 含 Apr 基 因 ）所取 代 。插入 pBR序列可供卸甲载体和中间载体之间实现交换重组形成 共和体，即重组体。 2. Onc+卸甲载体： 不去除Onc基因的卸甲载体，用于特殊用途。
第多种转化系统， 如载体转化系统、原生质体DNA直接导入转化系统、基因 枪DNA导入转化系统，以及利用植物种质细胞如花粉粒等介 导转化系统等等。 其中的载体转化系统是植物基因工程中最重要的一种转化 系统。 载体转化系统中最重要的又是Ti质粒转化载体。
一．植物基因工程载体种类及命名规则： 二．根癌农杆菌Ti质粒的结构和功能： （一）Ti质粒的遗传特性、结构及功能： （二）T-DNA的基因结构与功能： 三．农杆菌Ti质粒的基因转化机理： （一）T-DNA的加工和转移： （二）T链蛋白复合体的形成及VirE的功能： （三）T链复合体通过细菌膜的转运及VirB的功能： （四）T链复合体靶向植物细胞核： （五）T链整合植物基因组的分子机理： （六）农杆菌染色体基因对T-DNA转移的调控： 四．农杆菌Ti质粒的改造及载体构建： （一）Ti质粒的改造及卸甲载体构建： （二）中间载体的构建： （三）中间表达载体的构建： （四）植物基因转化载体系统的构建： （五）载体构建中常用的选择基因和报告基因
植物表达载体构建
2．常用的中间载体及其构建： （1）广谱中间载体： 所谓广谱中间载体是由大肠杆菌广谱质粒克隆 T-DNA片段后 构建而成的。常用的广谱质粒是 RK2 衍生的载体 pRK290 。 由它构建的中间载体既能在大肠杆菌中复制，又能在农杆菌 中复制。
广谱中间载体的构建过程见下图。 ①将选定的T-DNA片段克隆到大肠杆菌质粒上； ②将外源基因连同细菌选择标记（如抗生素抗性）一起插入 到T-DNA片段的限制性切点中； ③将产生的 T-DNA“ 工程”片段亚克隆或共整合到广谱质粒 pRK290。 由于 pRK290 具有在广寄主范围中复制和接合转移的起点， 因而在辅助质粒如 pRK2013 反式动员作用下， pRK290 即可 从大肠杆菌转入根癌农杆菌中。
（ 1 ）共整合系统中间载体：含有与 Ti 质粒 T-DNA 区同源的 序列，此外含有pBR的序列，在其被引入农杆菌后即可高频 地与Ti质粒的T-DNA的同源序列进行重组；具有一个或多个 细菌选择标记，这将有利于筛选共整合质粒；具有 bom位点 （接合转移位点），在有诱导质粒存在的情况下，bom位点 的存在可使中间载体在不同细菌细胞内进行转移；含有植物 阳性选择标记，例如可赋予转化植物细胞卡那霉素抗性的新 霉素磷酸转移酶（neomycin phosphoransferase，Npt-II）基 因，以利于转化植物细胞的筛选；含有单一的限制性内切酶 切点，以利于外源基因的插入；无 Ti 质粒的边界序列 ( 见下 图 )。 （ 2 ）双元载体系统中间载体：其与共整合载体的不同之处 是：无同源序列；具有LB和RB；无ColE复制点。
（四）植物基因转化载体系统的构建：
上述构建的中间表达载体仍然不能直接作为植物外 源基因转化的载体，因为中间表达载体仍是一种细菌 的质粒，不能把外源基因转化到植物细胞。因此，必 须进一步把中间载体引入到上述已改造的受体 Ti 质粒 中，并构建成能侵染植物细胞的基因转化载体，才能 应用于植物基因的转化。它是由两种以上质粒构成的 复合型载体，故称之为载体系统。
几种植物转基因表达载体的构建方法
Approaches of Constructing Expressional Vectors Utilized in
Plant Genetic Transformation
LIN Chun -jing1 ,WEI Zheng -yi1 , CAI Qin -an1 , HOU Jing -yao1 , 2 , XING Shao -chen1 ＊
(1 .Biotechnology Research Center, Jilin Academy of Agricultural S ciences , Changchun 130033 , China; 2 .Institute of Genent ics and Cytology, Northeast Normal University , Changchun 130024 , China)
2008 年 18(5) 生 物 技 术 85
随着植物基因 工程 技术 的发展 , 适 合于 不同 研究 目 的各 种载体系统应运而 生 , 其 中在 转基 因植物 中最 常用的 是 质粒
载体 。 在为某种特定的 植物 构建 表达载 体时 , 为 了使 外 源基 因高效 、安全表达 , 或 由于特 定的 要求 , 需要 构建 新载 体 或改 造已有载体 , 而选 择 一种 合适 的 载体 构 建方 法 , 从 而 达到 方 便 、快捷的目的就 显得 十分 重要 。 鉴 于目前 还没 有关 于 对载 体构建技术方面的总结 , 在收集 整理前人工 作的基 础上 , 本文 选择介绍了其中几 种具有 代表 性的策 略 , 对其 适用的 情 况作 了阐述 , 进而指出它们的应用潜 力和主要应 用领域 , 期望 对实 际操作起到借鉴作用 。
植物表达载体构建
一．植物基因工程载体种类及命名规则： 二．根癌农杆菌Ti质粒的结构和功能： （一）Ti质粒的遗传特性、结构及功能： （二）T-DNA的基因结构与功能： 三．农杆菌Ti质粒的基因转化机理： （一）T-DNA的加工和转移： （二）T链蛋白复合体的形成及VirE的功能： （三）T链复合体通过细菌膜的转运及VirB的功能： （四）T链复合体靶向植物细胞核： （五）T链整合植物基因组的分子机理： （六）农杆菌染色体基因对T-DNA转移的调控： 四．农杆菌Ti质粒的改造及载体构建： （一）Ti质粒的改造及卸甲载体构建： （二）中间载体的构建： （三）中间表达载体的构建： （四）植物基因转化载体系统的构建： （五）载体构建中常用的选择基因和报告基因
2．嵌合基因（chimeric gene）构建： 所谓嵌合基因就是来自两种或两种以上生物的启动 子、结构基因连接在一起而构成的基因。
3．中间表达载体的构建过程： 中间表达载体是由中间载体加上能在植物细 胞中表达的启动子和选择标记基因构成，也就是 嵌合基因插入中间载体后构成。所以中间载体的 构建是一个十分复杂的过程。
（六）农杆菌染色体基因对T-DNA转移的调控： 目前已发现位于细菌染色体上的一些基因也与 T-DNA 的转移有关，并已经了解它们编码的蛋白质的功能。 ChrA、ChrB和ChrC均参与细菌的附着功能。还有一些 基因（ Cel 、 Att 、 ivr 、 PscA 和 ExoC 等）在 T-DNA 转移 中起重要作用，这些基因的突变将使细菌表面成分发生 变化，从而丧失与植物细胞识别和结合的的能力。此外， ChrD 位点影响 AS 对毒性区的诱导效率和农杆菌的致瘤 能力。这是因为ChrD可能编码一种细菌ATP结合蛋白， 在低 pH 值和磷酸饥饿的情况下可诱导 VirG 的表达。 ChrE位点编码一个单糖结合蛋白，与单糖影响 Vir区的 表达有关。Ros基因与Vir基因的负调节有关。可见，目 前已知农杆菌染色体上游 10个基因与T-DNA的转移有关。
基因表达载体构建
一、简述原核生物和真核生物基因表达调控的异同点，并说明基因表达调控与基因工程表达载体构建的关系。
1．原核生物和真核生物基因表达调控的共同点：（1）结构基因均有调控序列；（2）表达过程都具有复杂性，表现为多环节。
2．不同点：原核生物：（1）RNA聚合酶只有一种，其σ因子决定RNA聚合酶识别特异性；（2）操纵子模型的普遍性；（3）阻遏蛋白与阻遏机制的普遍性（负性调节占主导）；（4）转录和翻译偶联进行；（5）转录后修饰、加工过程简单；（6）转录起始是基因表达调控的关键环节。
真核基因表达调控特点：（1）RNA聚合酶有三种，分别负责三种RNA转录，每种RNA聚合酶由约10个亚基组成；（2）活性染色质结构发生变化；（3）正性调节占主导；（4）转录和翻译分隔进行；（5）转录后修饰、加工过程较复杂；（6）转录起始是基因表达调控的关键环节。
3.由于基因的表达调控受到多种因子的影响，而构建基因工程表达载体时多是将真和生物的目的基因转入到原核生物载体上表达，所以应注意以下几点：（1）外源基因插入序列必须保持正确的方向和阅读框架。
其遗传密码不得缺失、遗漏、或错位及错码。
否则会导致编码错误的蛋白质分子，特别是目的基因序列内部应不含两端酶切位点的识别序列。
（2）插入的外源基因必须放在原核的启动子控制之下，也就是使原核的RNA 聚合酶能够识别插入的基因。
（3）外源基因必须能在大肠杆菌中进行有效转录（如无内含子），转录后的mRNA 在菌体必须相当稳定，并且能有效地进行翻译，转译的蛋白分子在菌体内不致于受菌体蛋白酶的降解。
二、目的基因功能和表达分析的意义是什么？目的基因功能与表达分析的主要环节有哪些？各有什么目的？这些环节与基因工程的主要环节有什么异同？1．意义：克隆的目的基因只有通过表达才能探索和研究基因的功能及基因表达调控的机理，明了其利用价值和途径。
2．主要环节：（1）目的基因的获得和加工：将得到的目的基因通过加工以期能连接到表达载体上并稳定表达；（2）载体的选择与加工：根据不同的实验目的和实验条件选择不同的载体，并对载体进行改造加工，使其满足高效连接的需要；（3）载体与目的基因的连接：即通过连接反应，将载体和目的基因连接形成重组DNA；（4）重组子导入受体细胞：通常将重组DNA导入大肠杆菌感受态进行扩增和筛选，以期得到大量的单一重组子，便于利用；（5）阳性克隆的筛选与鉴定：在连接产物中既有载体和目的基因的连接，也有载体自连、目的基因自连以及为发生连接的载体和目的基因，在转化过程中上述各种分子都会进入宿主细胞，所以需通过筛选鉴定出阳性克隆。
植物基因工程载体及其构建
分子量为95～156×106D, 约有200kb组成。
l
根据其诱导的植物冠瘿瘤中所合成的冠瘿碱种类不同，Ti质粒可以被分成四种类
型：章鱼碱型(octopine)、胭脂碱型(nopaline)、农杆碱型（agropine）和农杆菌素碱型
（agrocinopine）或称琥珀碱型(succinamopine)
2021/6/18
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2. VirA操纵子的诱导表达及功能
对VirA基因进行顺序分析发现, VirA是单个基因组成,分子大小为，仅编码一条多肽。Vir基因在接
受植物细胞产生的创伤信号分子后才能转录活化，其中首先是VirA编码一种结合在膜上的化学受体蛋
白 （ membrane
bound
chemoreceptor
2021/6/18
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第一节 植物基因工程载体种类
根据其功能和构建过程，可分为以下种类。 （1）目的基因克隆载体：其功能是保存和克隆目的基因。与微生物基因工程相似，通常是由多拷 贝的E. Coli小质粒为载体。 （2）中间克隆载体：是构建中间表达载体的基础质粒。是由大肠杆菌质粒插入T-DNA片段、目 的基因和标记基因等构建而成。 （3）中间表达载体：是含有植物特异启动子的中间载体。是构建转化载体的质粒。 （4）卸甲载体：是解除武装的Ti质粒或Ri质粒，是构建转化载体的受体质粒。 （5）植物基因转化载体：是最后用于目的基因导人植物细胞的载体，亦称工程载体。它是由中间 表达载体和卸甲载体构建而成。
2021/6/18
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Ti质2.粒T可i质分粒为的四功个能区区。域 （1）T-DNA区（transferred-DNA regions）：
T-DNA是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物细胞的一段DNA，称为转移DNA。 该DNA片段上的基因与肿瘤的形成有关。
现行的基因工程方法主要有以下几种
转基因农作物具有多种全新优良品质，其特征是采用生物工程技术将一个物种基因嵌入另一个物种中。
现行的基因工程方法主要有以下几种：1、首先选择所需特性的DNA片断，以便将它导入农作物中。
然后将称为细胞质遗传体的螺旋形DNA链从土壤细菌中抽取出来，再把细胞质遗传体环剪开，以便将所需特性DNA片断嵌入环中，并把再造胞质遗传体环移回土壤细菌中。
2、例如改造西红柿，就将一片西红柿叶浸入这种土壤细菌溶液中以利土壤细菌与西红柿细胞亲合。
这样就将改变的细胞质遗传体转移到植物细胞DNA链中。
3、一旦外源DNA被移植到农作物细胞核中，它便成为该植物染色体成分。
4、研究人员继而培植该植物细胞，直至它分裂并生成新型植物。
与此同时，新生植物就带有为其基因编码的外源DNA。
5、含有全新特性的植物就可以入土栽培了。
自从美国农业人员纷纷采用首批上市的生物工程技术改良农作物品种以来，研究人员还在研制其它可以大大改进农作物品质且具有保健医疗功效和出产优质纤维的农作物。
例如：抗除草剂农作物：1996年孟山都生物技术公司开始上市销售基因改良大豆，这种新型大豆具有抵抗该公司出产的一种常用除草剂的能力。
孟山都和霍伊斯特公司合作还推出了抗除草剂玉米。
生物改良新饲料：不久人们可以给家禽和奶牛喂食生物改良饲料，以便为人类提供更优良的蛋白质并帮助动物吸收磷。
生物改良饲料可以产生两项效益，即既能降低饲料成本，又能减少动物粪便中磷含量，因而有益于保护生态环境。
促进健康的食品：杜邦和孟山都公司即将推出多种可榨取有益心脏的食用油的大豆。
两大公司还将联手推出味道更鲜美且更容易消化的强化大豆新品种。
含天然杀虫剂的农作物：自1996年以来美国研究人员一直种植一种转基因改良棉花，这种棉花中含有一种从细菌中提取对棉铃虫和苞芽虫有致命危害的基因。
目前科学家还在创造含天然杀虫剂基因的玉米和马铃薯。
抗疾病农作物：艾尔姆公司与其它公司合作，正在研究高含量抗癌物质的西红柿，以及可用于生产血红蛋白的玉米和大豆。
植物表达载体构建与遗传
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2、工具酶 1）限制性内切酶;
2）T4 DNA连接酶; 3）RNaseA; 4）CAIP;
5) Taq DNA 聚合酶 ;
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一）影响构建植物表达载体的 主要因素
1)目的基因的结构特点； 2)转化受体植物类型与种类； 3)转化方法； 4)转入受体植物的表达要求； 5)植物表达载体类型； 6)选择适宜的启动子与终止子； 7)选择性标记基因及报告基因；
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(二）构建植物表达载体的一些 基本知识与实验技能
nptII基因,启动子为35S,终止子为nos
poly(A)，由本所陈平华博士提供。
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3) pUC19:克隆载体，用于构建含2x35S启动 子和35S poly(A)载体，从华美公司购买。
4) pSCL0041植物表达载体:在左右边界内含
有hyg和带内含子的gus基因，且各自带有35S 启动子和35S poly(A)、nos poly(A)。外源基
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而实际上，由于多种因素 的影响如转化方法要高效、被 转化的部位与可转化再生部相 同等问题至今仍未能很好解决。
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农杆菌介导转化技术比较 简单，但转化有基因型依赖、 质粒与菌株特异性。
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2、遗传转化与安全性
从事植物表达载体构建工作主要是进 行各种质粒的提取、纯化、酶切、相关DNA 片段的回收、连接、转化与验证等，需要 一些分子生物学相关的知识和实验技能。
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几种新型植物基因表达载体的构建方法摘要:利用基因工程技术手段研究基因功能过程中，构建基因表达载体处于转基因植物的主导地位，采用合适的构建方法会使实验效果事半功倍。
植物基因表达载体的构建方法除了传统构建法、Gateway 技术、三段T-DNA 法、一步克隆法等，还有近年来出现的几种新型的载体构建方法：基于竞争性连接原理快速构建小片段基因表达载体；Micro RNA 前体 PCR 置换法适用于构建小分子 RNA 表达载体；重组融合 PCR 法特别适用于插入片段中含有较多限制性酶切位点的载体构建；利用 In-Fusion 试剂盒可以将任何目的片段插入一个线性化载体的某个区域；构建多片段复杂载体可采用不依赖序列和连接的克隆方法 (Sequence and ligation-independent cloning, SLIC) 法；Gibson 等温拼接法。
本文将在总结分析前人工作的基础上，分析这6种新方法的特点，期望通过这几种新的方法给植物基因工程表达载体的构建提供新的思路。
关键词:Micro RNA 前体 PCR 置换法，In-Fusion 试剂盒法，重组融合 PCR 法，Gibson 等温拼接法，Golden Gate 拼接法基因克隆、载体构建是植物功能基因组研究中的常规步骤[ 1 ]。
而载体构建是基因工程和分子生物学研究中常用的基础技术。
随着植物基因工程技术的发展，适合于不同研究目的各种载体系统应运而生，其中在转基因植物中最常用的是质粒载体。
传统的载体构建方法在进行构建多片段拼接的复杂载体时，需要精心选择酶切位点[ 2 ]，有时还需要构建多个中间载体，操作比较麻烦，费时费力，因此寻找简单、高效、快捷的载体构建方法具有重要的现实意义。
从1969 年 Arber 等发现了限制性内切酶，载体的构建方法逐步发展，从传统构建方法到三段T-DNA、Gateway 等技术延伸出了许多新的载体构建方法。
本文结合自己的实验工作选择介绍了近年来其中几种新型的具有代表性的植物表达载体构建的方法，对其应用的方向、优缺点作出了评估，期望给植物基因工程表达载体的构建提供新的思路。
1. 载体构建方法1.1 快速构建小片段基因表达载体基因产物克隆的方法有很多种，如共环消解法、T4 DNA 聚合酶回切产生粘端、外切核酸酶Ⅲ回切产生粘末端、PCR 产物非依赖连接克隆、TA 克隆等，这些方法原理不一，应用的方向也不相同，但都不适合小片段基因的克隆及其载体的构建[ 3 ]。
传统构建方法构建载体时需要PCR 扩增，用2个不同的限制性内切酶酶切 PCR产物和载体，酶切后进行胶回收等，步骤繁琐、连接成功率低，任何一个步骤出现问题都会导致最终实验失败。
因此，提高酶切和连接的效率是提高实验成功率的关键。
通常在实际的实验中我们会将酶切后的片段进行回收浓缩，而且使用较小的连接体系，这种方法就利用了竞争性连接的特点，来源于化学中的有效碰撞原理，连接反应也是一个化学反应，当在进行连接反应时，单位时间内分子数目多的目的片段分子更加容易与载体分子接触，换言之，有效分子浓度更高，则更容易发生连接反应，同时能有效减少载体自连反应。
小片段基因载体构建时，小片段的PCR 技术又比较困难，尤其是在酶切回收步骤，也常出现酶切后的粘性末端被降解的现象[ 3 ]，因此需要采取办法避免这些常见问题。
金磊等[ 3 ]提出的新方法是基于小片段基因寡聚核苷酸合成技术和竞争性连接原理。
利用寡聚核苷酸合成的方法，省去了目的基因的酶切步骤和载体酶切后胶回收纯化步骤，解决了小片段PCR 困难的问题；利用竞争性连接原理可以克服载体自连，同时提高连接效率。
其应用该方法已经完成了4个小片段基因(67bp)表达载体的构建，连接成功率达到 66.7%−100%。
证明了该方法具有简单快速、节省试剂费用和连接效率高等特点。
1.2 Micro RNA 前体 PCR 置换法自 1999 年 Hamilton 等[ 4 ]首次发现了长度为 25 nt 的 RNA 中间产物后，RNAi 技术被广泛应用于植物基因功能鉴定和功能基因表达调控等各个领域。
前人的研究中构建 RNAi 载体的方法主要有：传统的酶切连接法、Gateway 技术、重叠延伸 PCR 法、LIC 克隆法和 Golden Gate克隆法[ 3 ]。
重叠延伸PCR技术(Gene splicing by overlap extension PCR，简称 SOEPCR)，于 1989年由 Horton 等建立，主要方法是采用具有互补末端的引物，使 PCR 产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。
此技术利用 PCR 技术能够在体外进行有效的基因重组，而且不需要内切酶消化和连接酶处理，用这一技术可以很快获得其他依靠限制性内切酶消化的方法难以得到的产物[ 7 ]，如 Cao 等[ 8 ]利用寡聚核苷酸合成技术和重叠延伸 PCR 技术合成了布氏柠檬酸杆菌植酸酶基因，并检测了其高效的表达。
应用此方法还可以对目的基因进行小泛素相关基因的修饰，如 Lu 利用这种方法对 HV1 蛋白进行了泛素化修饰从而解决了此蛋白在大肠杆菌 Escherichia coli 内外源表达易被降解的问题，以及泛素化修饰鸽子Aplopelia bonaparte B淋巴细胞刺激因子(do BAFF) 增强了其在大肠杆菌内的可溶性表达。
但是需要指出的是重叠延伸 PCR 技术在实际应用中，经常会受到引物自身序列的限制，例如，引物同(异)二聚体的产生导致的扩增效率低下，扩增片段中的重复序列导致产物突等诸多问题[ 7 ]。
1.3 重组融合 PCR 法基因的同源重组是噬菌体、细菌到真核生物都普遍存在的生物学现象[ 8 ]。
广义的同源重组是指含有同源序列的 DNA 分子之间或分子之内的重新组合，同源重组严格依赖 DNA 分子之间的同源性，因此，原核生物的同源重组通常发生在 DNA 复制的过程中，而真核生物的同源重组则常见于细胞周期的 S 期之后，DNA的修复过程中也会发生同源重组的现象[ 9 ]。
以同源重组技术为基础，通过构建突变或缺失的同源媒介基因载体并取代基因组中野生型的等位基因，进而研究目的基因与表型性状间的关系，是研究动物、植物、微生物基因功能的一种非常有用的遗传操作方法[ 10--11 ]。
常用的同源重组克隆的策略包括：T4 DNA聚合酶介导的同源重组，ExonucleaseⅢ介导的同源重组，RF 克隆等。
这些传统构建方法由于要避免目的片段中已有限制性酶切位点，而不得不选择构建中间载体或者选择昂贵且酶切效率低的非常用限制性酶，经过多次连接转化，操作麻烦，费时费力，不但大量增加了载体构建的工作量，而且实验成功得不到保证融合PCR 技术在不经过酶切和连接的条件下，采用具有互补末端的引物将不同来源的扩增片段连接起来，为同源重组片段的构建提供了快速简捷的途径。
现有的融合 PCR 技术一般包括两步PCR 反应，类似于重叠延伸 PCR 法和一步克隆法[ 12 ]：1)分别设计 5′端带有互补序列的若干条特异性引物，分别进行各个片段的扩增；2) 随后在同体系加入各片段，以一对外侧引物进行融合片段的全长序列的扩增。
1.4 In-Fusion 试剂盒法构建载体时需要通过连接酶连接完成，而且选择酶切位点时通常会被载体上独特的酶切位点所限制[ 13 ]，因此能够摆脱酶切位点的限制，省略酶切与连接的步骤，并且能够在载体的任意位置上插入目的基因的序列是载体构建发展的新趋势。
Gateway 技术、一步克隆法等技术的出现大大简化了载体构建的步骤，但仍然没有解决酶切位点的限制等问题。
近年来的研究发现，利用 In-Fusion 试剂盒(In-FusionTM advantage PCR cloning kit) 能够摆脱酶切位点的限制，利用这种方法可以对任何常用的载体进行修饰，用单酶切或者利用 PCR扩增的方法将载体线性化，使之成为一个不依赖序列和连接反应高效的基因克隆体[ 14 ]，该方法利用重叠 PCR 技术在 PCR 引物的 5'端增加一个与线性载体两端同源的 15 bp 的序列，由于序列的同源性，通过 PCR 程序可将目的基因插入到载体中，实现 DNA 重组。
这种方法操作简单，对目的基因和载体没有特殊的要求，可以将任何目的片段插入一个线性化载体的某个区域，不会产生反向插入的问题，没有知识产权限制[36-37]，而且适用于在多宿主中的表达[ 14 ]。
利用 In-Fusion 试剂盒构建表达载体的步骤：1)质粒的线性化(单酶切或双酶切)；2)目的基因的 In-Fusion 改造；3)经过 In-Fusion 改造目的基因片段与线性载体在In-Fusion 酶的作用下发生重组，使目的基因连接到载体上；4)In-Fusion 产物的转化与检测；5)提取阳性克隆质粒进行 PCR 和酶切验证[ 15 ]。
1.5 SLIC 法在一些基因共表达的研究中，需要构建一些大型复杂载体，将若干个目的片段依次、连续连接到目标载体上，插入片段较多，酶切位点难以选择，通常的构建方法是使用平末端连接，但是平末端连接效率低且工作量与难度较大。
Li 和Elledge 所建立的不依赖序列和连接的克隆方法(Sequence and ligation-independent cloning，SLIC)[ 16 ]，把同源重组与单链退火结合起来，可以高效、定向地将任意序列的2个[ 17 ]或2个以上的DNA片段组装到一起，不需要连接反应即可完成体外的重组，避免目的基因序列中原有酶切位点对 DNA 重组的限制，极大地简化了 DNA 重组过程[ 18 ]。
采用 SLIC 法构建复杂载体的基本步骤：1)采用 PCR 扩增使载体线性化；2)在 PCR的引物两端加上与载体末端同源的 DNA 序列(20−30 bp)，扩增目的基因；3)用T4DNA聚合酶处理目的基因和载体片段，使其5'末端形成突出单链；4)在 T4 DNA 连接酶缓冲体系中退火，形成重组中间体； 5)转化大肠杆菌Escherichia coli 并筛选重组子。
1.6 Gibson 等温拼接法Gibson 等温拼接法是 Gibson 等[ 19 ]报道的一种高效、快速的多基因片段拼接技术，由 Gibson变温拼接法发展而来。
与 SLIC 法相似，可以将任意序列的2个或2个以上的 DNA 片段组装到一起，适用于复杂载体的构建。
不同的是，通过控制目的片段重叠序列的大小(40−600 bp)可以直接在体外合成得到较大的基因组序列，大大简化了大型 DNA 分子合成的过程，展示了其广泛的应用前景。