模块二 原核表达和纯化 实验报告
原核表达实验报告 -回复
原核表达实验报告-回复实验目的：本实验旨在探究原核表达的过程和原理，分析原核表达实验的步骤和相关技术应用。
引言：原核表达是生物学领域中常用的实验技术之一，它可以通过转录和翻译过程将外源基因导入到原核细胞中并使其表达出目标蛋白质。
原核表达在基因工程、药物研发、蛋白质生产等方面起着重要作用。
了解原核表达的过程和原理，掌握其实验步骤和技术应用，对于学习和应用相关领域的研究都具有重要意义。
实验步骤：1. 选择合适的原核表达系统：原核表达系统主要包括细菌和酵母两种。
在选择表达系统时，需要考虑目标蛋白质的生理特性和产量需求等因素。
细菌表达系统常用的有大肠杆菌(E. coli) 和拟杆菌(Bacillus subtilis)，而酵母表达系统则常用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
2. 构建表达载体：构建表达载体是原核表达实验的关键一步。
通常采用的是重组DNA技术，将目标基因插入载体中。
载体中包含启动子、选择标记物和阻遏子等元件，以控制和增强目标基因的表达。
3. 转化表达细胞：将构建好的表达载体导入到表达细胞中。
常用的转化方法有化学法、电转化法和热冲击法等。
通过转化，表达载体成功导入到细胞内。
4. 选择和培养表达阳性克隆：转化后的细菌需要进行筛选，得到表达阳性克隆。
通常通过选择标记物（如抗生素）对未转化细胞进行抑制，从而判断转化是否成功。
表达阳性克隆可通过液体培养或固体培养等方式进行扩增。
5. 蛋白质表达和纯化：经过培养扩增的表达阳性克隆可进行蛋白质表达和纯化。
比较常用的方法有亲和层析、离心扩增和玻璃珠破碎等。
实验技术应用：1. 蛋白质生产：原核表达广泛应用于大规模蛋白质生产。
通过原核表达系统，可以高效地表达大量目标蛋白质，满足科研和工业生产的需求。
2. 蛋白质互作研究：原核表达技术可用于研究蛋白质的互作关系。
通过表达不同蛋白质，进行蛋白质相互作用的分析，有助于揭示蛋白质功能和信号转导网络等。
原核表达(原理、材料与实验方案)
原核表达（原理、材料与实验方案）一、原理1、E . coli表达系统E . coli是重要的原核表达体系。
在重组基因转化入E . coli 菌株以后，通过温度的控制，诱导其在宿主菌内表达目的蛋白质，将表达样品进行SDS-PAGE 以检测表达蛋白质。
2、外源基因的诱导表达提高外源基因表达水平的基本手段之一，就是将宿主菌的生长与外源基因的表达分成两个阶段，以减轻宿主菌的负荷。
常用的有温度诱导和药物诱导。
本实验采用异丙基硫代-β-D-半乳糖昔（IPTG）诱导外源基因表达。
不同的表达质粒表达方法并不完全相同，因启动子不同，诱导表达要根据具体情况而定。
二、材料1、诱导表达材料( 1 ) LB （Luria—Bertani）)培养基酵母膏(Yeast extract) 5g 蛋白胨(Peptone) 10gNaCl 10g 琼脂(Agar) 1-2%蒸馏水(Distilled water) 1000ml pH 7.0适用范围：大肠杆菌( 2 ) IPTG 贮备液：2 g IPTG溶于10 mL 蒸馏水中，0 . 22 μm 滤膜过滤除菌，分装成1 mL /份，－20 ℃保存。
( 3 ) l×凝胶电泳加样缓冲液：50 mmol / L Tris -CI ( pH 6 . 8 )50 mmol / L DTT2 % SDS （电泳级）0.1 ％溴酚蓝10 ％甘油2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料1 ）酶溶法（1）裂解缓冲液：50 mmol / L Tris-CI ( pH 8 . 0 )1 mmol / L EDTA100 mmol / LNaCI（2）50 mmol / L 苯甲基磺酰氟（PMSF ）。
（3）10 mg / mL 溶菌酶。
（4）脱氧胆酸。
（5）1 mg / mL DNase I。
2 ）超声破碎法( 1 ) TE 缓冲液。
( 2 ) 2×SDS -PAGE 凝胶电泳加样缓冲液：100 mmol / L Tris-HCI ( pH 8 . 0 )100 mmol / L DTT4 %SDS0.2 ％溴酚蓝20 ％甘油三、实验方案1、外源基因的诱导表达( 1 ）用适当的限制性内切核酸酶消化载体DNA 和目的基因。
原核表达及纯化方法
原核表达及纯化-His tag一、原核表达1.挑取一个单菌落（重组表达载体），接种到10mL LB培养基中（注意抗生素抗性）。
37℃，过夜摇菌。
2.次日，将菌液接种到1L LB培养基中（1:50~1:100），继续培养至OD600=0.6时（0.6~0.8），加1×IPTG诱导4h。
（加IPTG前留样（诱导前全菌蛋白）200μL做SDS-PAGE）3.收菌：(1)200μL诱导后全菌；(2)小量表达：收集5mL诱导后全菌，12000g离心1min，裂解沉淀，分别收集上清（可溶性）和沉淀（包涵体）中的蛋白。
大量表达：收集1L诱导后全菌，4℃，4500g离心15~30min。
二、可溶性分析目的：重组蛋白是否表达，是可溶性的还是包涵体形式。
根据这个结果选择纯化方法。
（1）各用30μL 4×SDS Loading buffer重悬诱导前和诱导后的菌体（200μL）；用500μL 1×Binding Buffer重悬菌体（5mL），超声破碎（3min，超2s，挺3s，27%能量；溶液透亮即可）；4℃，19000g离心15min，分离上清和沉淀；（2）用30μL 4×SDS Loading buffer重悬沉淀；（3）取10μL上清蛋白加10μL 4×SDS Loading buffer；（4）将诱导前全菌，诱导后全菌，上清蛋白和包涵体蛋白煮沸5~10min。
（5）各取10μL 用于SDS-PAGE检测（12%的胶）。
三、小量富集实验样品制备：取5mL诱导全菌，用500μL 1×Binding Buffer（8M Urea）溶解，超声破碎（3min，超2s，挺3s，27%能量；溶液透亮即可）。
4℃，19000g离心15min，取上清用于富集实验。
（留样做SDS-PAGE）富集：1.装柱：取30μL~50μL体积的Ni柱料（纯柱料）于1.5mL离心管中。
原核表达及蛋白质的纯化与浓度测定
记录测定结果。
用灭菌水清洗侦测台5-6次，退出系统，关闭计算机。
防止二价Ni被还原。
不能含离子型的去垢剂，比如SDS，防止Ni流失。 建议在破碎细胞的时加入蛋白酶抑制剂，如0.11mM的PMSF，防止目的蛋白被降解。
缓冲液里可以加入甘油，防止蛋白之间由于疏水
相互作用而发生聚集沉淀，甘油浓度最高可达 50%（v/v）。 缓冲液里NaCl的浓度应在300mM到2M之间。 可加入非离子型去垢剂，如Triton，Tween等，最 高2%，可以减少背景蛋白污染和去除核酸污染。
GST标签蛋白的纯化
• 诱导200mL菌体，4℃ 12000rpm 离心1min集菌，然后用 PBS洗涤诱导后的菌体2-3次，Buffer A（一般用1/10体 积）重悬菌体，超声波破碎至清亮 ，12000rpm离心 20min取上清，在上清中加入适量经处理过的50%的 Glutathione Sepharose 4B，室温摇床轻轻晃动作用1h，使 蛋白充分吸附。 • 2000 rpm离心5min，弃上清。 • 加入至少10倍体积PBS，轻摇至Glutathione Sepharose 4B 悬浮于溶液中，2000rpm离心5min弃上清。 • 重复上步两次。
蛋白浓度测定
特点
检测只需1微升的样本，适用于极 微量样本的检测。
直接使用加样器将待检测样本加在
检测的表面上，无需使用比色皿和 毛细管。 不浪费样本，节省消耗品费用。 样本无需进行稀释，即可进行快 速、简便的检测，检测范围宽。
操作步骤
在主画面点选“Protein A280”，计算机与仪器自动完成 联机。 先用灭菌水清洗侦测台5-6次，最后一次点“OK”确定。 依照Pro所溶于之液体准备该溶液取出2ul点在侦测台 上，放下上臂后再按“Blank”。 将样品混匀，取出2ul点在侦测台上，放下上臂后再按 “Measure”。
原核蛋白表达与纯化
GE tac (Pharmacia) NEB tac
pMal
Amp
MBP· Tag
pET
Merck (Novagen) Transgen
T7 T7lac T7lac
Amp Kan Amp
His· Tag
pEASY
His· Tag
选择表达菌株
菌株
BL21 BL21(DE3) BL21(DE3)pLysS
pGEX pET
Lane 2：30℃ Lane 3：25℃
促进包涵体形成
• 目的 高浓度，高纯度 毒基因表达
免受蛋白酶水解（小蛋白，多肽）
• 手段 胞质表达 提升表达速率（诱导温度，IPTG浓度，etc） 特定的表达载体（pET-17xb，pET-31b(+)）
蛋白纯化障碍 • 表达——纯化是一个完整的、密切联系的过程，蛋 白纯化过程中，很多问题的根源来自上游表达 • 蛋白不结合，洗脱杂带多，包涵体不易溶解…… • 下篇详述
常用表达载体系统
系统名称 公司 pGEX 启动子 抗性 Amp 常用标签 GST· Tag 特点 可溶性表达，纯化难以控制，谷 胱甘肽 一步洗脱，得到的蛋白纯 度较低,通常需要去掉GST· Tag 可溶性表达，纯化难以控制，麦 芽糖一步洗脱，得到的蛋白纯度 较低,通常需要去掉MBP· Tag 种类丰富。标签小，无需切割， 一般来说，对蛋白活性无影响。 纯化及其方便。 同pET系统
GE tac (Pharmacia) NEB tac
pMal
Amp
MBP· Tag
pET
Merck (Novagen) Transgen
T7 T7lac T7lac
Amp Kan Amp
His· Tag
原核表达分析
实验三
一.白班菌落的PCR鉴定 注意事项：应挑单个白色菌落，而且挑时要轻触。 二.重组质粒DNA的提取 严格按照试剂盒的说明书操作， 注意：漂洗后要把柱子晾干，不然影响DNA的浓度。 三.重组质粒DNA的酶切鉴定 注意事项：反应体系中各成分加的顺序应是由多到少，加过后瞬 离，用封口膜封好EP管，以免水浴锅的水进入影响实验进行。
分子生物学实验汇报
实验四组
目录
1
实验二 重组质粒的连接大肠杆菌感 受态细胞的制备及连接产物转 化感受态细胞 实验一 绿色荧光蛋白GFP的扩增、 琼脂糖凝胶电泳及DNA的回收纯化
2 3
实验三 白斑菌落的PCR鉴定、重组 质粒DNA的提取及重组质粒DNA 的酶切鉴定
实验一
一.目的基因扩增
1.PCR反应体系：（25ul）
三.DNA的回收纯化 1. 严格按照试剂盒说明书操作并用回收产 物电泳检验 2.实验结果 1 2
结果分析:第一条带比较暗，可能是回收时切 胶没有切完整，也可能是DNA没有完全从柱 上洗脱。
实验二
一.重组质粒的链接 1.反应体系：（10ul） 溶液I pMD-T载体 目的基因产物 连接16摄氏度30min 2.注意事项 加样顺序：由多到少，确认加入，瞬离。包好封口膜以免进水。 5ul 0.2ul 4.8ul
上游引物 (10uM) 下游引物(10uM) 模板DNA Mix ddH2O 1.0ul 1.0ul 1.0ul 12.5ul 9.5ul
2.注意பைடு நூலகம்项
加样顺序：应先加水和Mix，再加上下游引物，吸取引物时要
确定加进去。加完之后瞬离，使管壁上的液体流到管底，保证反 应中各种成分充分接触。
二.琼脂糖凝胶电泳 1.按照目的片段750bp做琼脂糖 凝胶称取琼脂糖0.2g，加20mlTAE， 微波炉加热溶解，稍放凉后加入核 酸染料，打入插好梳子的胶板里。 将做好的胶放入电泳槽里，用跑 好PCR的产物点样，插上电源线进行 电泳。 2.注意事项 溶解琼脂糖时注意不要太沸腾，以 免浓度改变，加入染料时要摇匀， 倒胶时注意不要有气泡，如果发现 气泡要用枪头挑出。点样前要让点 样孔里充满电解液，点样时要慢让 样品慢慢下沉以免溢出。电泳时要 看好正负极。
蛋白质的原核生物表达与纯化实验大纲
实验一：EV71病毒非结构基因（2b）的克隆一．实验目的通过本实验使学生掌握外源基因克隆的原理和方法二．实验原理基因克隆技术包括把来自不同生物的基因与具有自主复制能力的载体DNA在体外进行人工连接，构建成新的含目的基因的重组载体，然后将其导入受体生物中去进行表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。
三．实验用品１. 材料：EV71病毒基因组序列载体pMAL-c2x （Amp抗性）大肠杆菌DH5a２. 器材：离心机、DNA电泳仪、微波炉、试管、摇床、酒精灯、高压蒸汽灭菌锅、培养皿等、三角瓶、天平３. 试剂与药品：氨苄青霉素、碱性裂解液、电泳缓冲液、Rnase A、Taq DNA聚合酶、T4DNA 连接酶、1kb 分子量DNA Marker 、内切酶BamHI和SalI、DNA 片段胶回收试剂盒、X-gal 贮液、 IPTG 贮液、T ris 碱、Na2EDTA、NaCl、CaCl2 、甘油、葡萄糖、酵母提取物、胰蛋白胨、分析纯无水乙醇、95%医用酒精、琼脂糖四．方法与步骤（一）缓冲液及培养基配制1.质粒提取试剂：溶液I：葡萄糖 50m mol/L,Tris-HCl(pH 8.0) 25m mol/L,EDTA(pH8.0) 10mmol/L于6.895×104Pa灭菌15 min，4℃保存。
溶液II：NaOH 0.2 mol/L，SDS 1%。
SDS（10%，200ml）：20 g SDS，慢慢转移到约150ml水的烧杯中，磁力搅拌至溶解，用水定容至200 ml。
溶液III:（0.5M，pH5.2，KAC）,用冰醋酸调pHTE缓冲液：1ml Tris-HCl(1M pH8.0),0.2ml EDTA(0.5M pH8.0),加灭菌水至100ml。
2. LB液体培养基（perliter）:胰蛋白胨10g酵母膏5g pH 7.0NaCl 5g(二).步骤1．碱裂解法抽提质粒实验原理：在 pH 12.0～12.6 碱性环境中，细菌的染色体 DNA 变性分开，而共价闭环的质粒 DNA 虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。
原核表达蛋白镍离子亲和纯化-概述说明以及解释
原核表达蛋白镍离子亲和纯化-概述说明以及解释1.引言1.1 概述概述原核表达是一种重要的蛋白质表达方法，它在生物学和生物技术领域被广泛应用。
原核表达系统通常包括大肠杆菌、酵母和其他细菌等微生物，其表达效率高、表达周期短、操作简便，因此备受研究者青睐。
然而，由于细胞内含有大量的内源性蛋白和杂质，常规方法无法有效地纯化目标蛋白。
为了解决这一问题，科学家们开发了各种蛋白纯化方法。
其中，镍离子亲和纯化技术因其高选择性和高效性而备受关注。
镍离子亲和纯化的原理是基于镍离子（Ni2+）与某些蛋白的特定结构域（如组织因子蛋白A标签、组织因子蛋白S标签和组织因子蛋白H标签等）之间的特异性配位作用。
通过构建一定的表达载体，将含有目标蛋白的基因与镍离子亲和柱（如Ni-NTA柱）结合，可以实现目标蛋白在细胞裂解液中的高效富集。
在原核表达蛋白镍离子亲和纯化的方法中，首先需要构建包含目标蛋白编码序列的表达载体，并将其转化到适当的宿主细胞中。
然后，通过诱导表达剂（如异丙基β-D-硫代半乳糖苷）刺激蛋白的大量合成。
接着，使用一系列的细胞破碎方法，如超声波处理或高压细胞破碎仪，将细胞内的目标蛋白释放出来。
最后，通过镍离子亲和柱，将目标蛋白与杂质分离，得到纯化的目标蛋白。
镍离子亲和纯化在原核表达蛋白中具有广阔的应用前景。
通过该方法，可以高效地纯化大量的目标蛋白，为后续的结构解析、功能研究和药物开发提供了可靠的材料基础。
然而，该方法也存在一些局限性和可改进之处，例如对于某些难以表达的蛋白，亲和纯化的效率可能较低；此外，在某些情况下，镍离子柱可能与非特异性结合的蛋白相互作用，导致纯化产物的纯度下降。
综上所述，原核表达蛋白镍离子亲和纯化技术是一种高效、可靠的蛋白纯化方法，具有广泛的应用前景。
随着该技术的不断发展和改进，相信将为蛋白研究领域提供更多更好的工具和方法。
文章结构部分的内容可以如下所示：1.2 文章结构本文将按照以下结构进行论述：第一部分是引言。
原核表达及蛋白纯化方法
蛋白原核表达预实验：摸索最适的诱导浓度、诱导温度1. 构建所需要的重组质粒，转化相应的表达菌株（如BL21，Rossetta），挑斑菌液PCR验证。
2. 分别挑取含有重组质粒和空载体的大肠杆菌Rossetta（或BL21）单菌落至5 mL 新鲜的2×YT液体培养基（含100 μg / mL Amp, 50 μg / mL Kan, 34 μg / mL Cm）中，37 ℃摇床，180 rpm 培养过夜，即种子菌。
3. 将过夜种子菌按照1﹕100的比例转接到20 mL 新鲜的2×YT液体培养基（含100 μg / mL Amp, 50 μg / mL Kan, 34 μg / mL Cm）中，37 ℃摇床，180 rpm 培养。
4. 待菌液浓度达到OD600为0.6~0.8时（约3 h），加入IPTG至终浓度为1 mM，37 ℃摇床，180 rpm 培养4~6 h。
（最适的诱导浓度、诱导温度，需要多次实验摸索再确定，不同的表达载体所需的IPTG浓度及温度是不同的）5. 取100 μL菌液，12，000 g 离心2 min，弃上清，用40 μL PBS 悬浮菌体，加入10 μL 5×SDS Loading Buffer，95 ℃变性5 min，记为样品A（总蛋白）。
6. 将剩下的20 mL 菌液离心弃上清，加入2 mL PBS悬浮菌液，其中1 mL 菌液备用，另1 mL 菌液转入1.5 mL 离心管中，12，000 g 离心2 min，弃上清，加入800 μL 超声波反应缓冲液，15% ，超声1 s ，间隔2 s ，反应5 min ，4 ℃，12，000 g 离心2 min，取500 μL 上清，在上清样品中取40 μL 上清加入10 μL 5×SDS Loading Buffer，95 ℃变性5 min，记为样品B（可溶性蛋白）。
7. 沉淀用PBS洗4-5次，以除去沉淀中的可溶性蛋白，用500 μL 裂解缓冲液悬浮沉淀，取40 μL 沉淀，加入10 μL 5×SDS Loading Buffer，95 ℃变性5 min，记为样品C（不可溶蛋白，即包涵体）。
原核表达实验报告 -回复
原核表达实验报告-回复什么是原核表达实验？在实验中原核生物如何表达外源蛋白？这个实验有哪些应用？本文将一步一步回答这些问题。
原核表达实验是指利用原核生物（如细菌）对外源基因进行表达的实验。
通常情况下，研究人员将目标基因插入一个载体中，然后将载体导入原核生物体内。
原核生物通过利用其自身代谢途径和蛋白合成机制，将外源基因转录成mRNA并翻译成蛋白。
在实验中，最常用的载体是质粒（plasmid），它是一种在细胞质中自由存在的环状DNA分子。
研究人员可以通过限制性内切酶的作用，将目标基因插入质粒的多个限制性内切位点中。
随后，带有目标基因的质粒被转化入细菌中，细菌质粒DNA酶解酶的作用下，转化为细胞DNA。
在细菌内部，目标基因通过细菌的转录和翻译机制进行表达。
对于转录，DNA的一条链被RNA聚合酶识别并合成相应的mRNA分子，这个过程称为转录。
翻译是指mRNA上的密码子通过核糖体和tRNA的催化作用，将氨基酸按照基因密码子的顺序连成多肽链，形成蛋白质。
这样，目标基因的DNA序列被转译为目标基因的蛋白质。
原核表达实验有广泛的应用。
首先，它被广泛用于基因工程研究中。
通过原核表达实验，研究人员可以将外源基因导入细菌中，使细菌表达出目标蛋白质，从而研究这些蛋白质的功能和机制。
其次，原核表达实验也可用于大规模生产重组蛋白质。
通过大量培养转化的细菌，可以获得大量目标蛋白质，用于药物研发、工业生产等领域。
另外，原核表达实验还可以用于抗原表达，用于蛋白质酶解学研究、免疫学研究等。
总结起来，原核表达实验是一种将目标基因表达为蛋白质的实验。
通过将目标基因插入质粒中，并将质粒导入原核生物体内，细菌通过其自身的转录和翻译机制将外源基因表达为蛋白质。
该实验在基因工程研究、蛋白质生产和其他领域具有广泛的应用。
原核表达实验报告
原核表达实验报告
一、实验目的
本实验旨在通过原核表达系统将目标蛋白在大肠杆菌中进行表达，并对其进行纯化和鉴定。
二、实验材料
1. 目标蛋白基因克隆质粒；
2. 大肠杆菌感受态细胞；
3. 抗生素（如氨苄青霉素）；
4. IPTG诱导剂；
5. SDS-PAGE凝胶电泳试剂盒；
6. 蛋白质纯化试剂盒。
三、实验步骤
1. 大肠杆菌转化：将目标蛋白基因克隆质粒转化到大肠杆菌感受态细胞中，加入抗生素（如氨苄青霉素）筛选阳性克隆。
2. 诱导表达：将阳性克隆的大肠杆菌接种到含有IPTG诱导剂的培养基中，使其表达目标蛋白。
3. 收集菌体：培养一定时间后，收集大肠杆菌菌体。
4. 裂解菌体：将收集到的大肠杆菌菌体进行裂解，释放目标蛋白。
5. 纯化目标蛋白：使用蛋白质纯化试剂盒对目标蛋白进行纯化。
6. 鉴定目标蛋白：通过SDS-PAGE凝胶电泳分析目标蛋白的表达情况和纯度。
四、实验结果与分析
1. 大肠杆菌转化结果：通过抗生素筛选，获得阳性克隆。
2. 诱导表达结果：在含有IPTG诱导剂的培养基中，目标蛋白得到了有效表达。
3. 菌体收集结果：成功收集到大肠杆菌菌体。
4. 裂解菌体结果：菌体裂解后，释放出目标蛋白。
5. 纯化目标蛋白结果：通过蛋白质纯化试剂盒，成功纯化了目标蛋白。
6. 鉴定目标蛋白结果：通过SDS-PAGE凝胶电泳分析，目标蛋白得到了高纯度的表达。
五、实验结论
本实验通过原核表达系统成功表达了目标蛋白，并通过纯化和鉴定获得了高纯度的目标蛋白。
这为进一步研究该蛋白的功能和应用提供了基础。
做原核表达的几点教训和体会
做原核表达的几点教训和体会最近在做原核表达，包涵体。
以前也做过，但经验不多。
一点失败的教训以及纯化过程中的体会，贴出来与大家共享，同时希望得到同行们的指正1. 首先介绍一下背景。
载体是invitrogen公司的pET22b，Amp抗性。
菌株是该公司的BL21 star DE3，是一个蛋白降解酶突变菌株，也就是说是一种优化表达菌株。
2. 第一次失败。
第一次做诱导的时候，重复了很多次，但总是诱导不出来。
PCR，酶切都正确。
但没等测序结果出来就开始做了。
失败了。
曾在园子求助。
后来证明是引物错误。
我们实验室合成引物都要先发给purchasing office，然后才由他们与公司交涉。
这个office的老太太把引物弄掉了一个碱基。
教训：在实验过程中，再仔细都是不为过的。
引物来了后管壁上贴有序列，但我忽略了。
3. 第二次失败。
后来重新构建，转化，诱导。
第一次诱导时根本就没带。
见附图（图片质量太差了，sorr y，下面几个帖会逐渐好转。
我们都在失败中提高，进步，不是吗）然后开始找闷头原因。
周一下午5点我就接了DE3菌，由于那天人非常不舒服，去看医生了，等了很久，到第二天中午11点才转接！而且是按1:50转接的！也就是菌在转接之前培养了18 h！我们都知道，带Amp的E.coli在含Amp的平板上培养超过16 h后，菌周围会长出小菌落，我们叫它卫星菌落。
这是因为细菌在生长的时候，为了抵抗Amp，会分泌B－内酰胺酶，而该酶会降解培养基中的A mp。
对Amp产生抗性的机制和其他抗生素的情况是不同的（具体可以翻看分子克隆）。
到菌体生长到足够浓度的时候，培养基的Amp就会慢慢减少。
一旦细菌失去选择压力，就可能造成质粒丢失。
当Amp降到很低，不足以抑制细菌生长时，未携带质粒的菌就会长得比带质粒的快。
所以当培养时间足够长后，培养基中的B－内酰胺酶就会积累到很高的浓度。
转接时（我是1:50转的），高浓度的酶可能破坏新鲜培养基中的Amp（而且我用的浓度是50 ug/ml）。
原核表达与常用蛋白质纯化技术探讨
目 的 蛋 白
NaCl浓度 浓度 初始NaCl浓度 浓度20mM 初始 浓度
NaCl浓度 浓度 初始NaCl浓度 浓度50mM 初始 浓度 初始NaCl浓度 浓度100mM 初始 浓度
初始NaCl浓度对离子交换纯化 浓度对离子交换纯化(DEAE)的影响 初始 浓度对离子交换纯化 的影响
常用离子交换剂举例——DEAE FastFlow、P11 DEAE FastFlow、 常用离子交换剂举例
DEAE Sepharose FastFlow: 弱碱型阴离子交换剂， 流速快，使用及再生方便，易于操作。 P11： 属于离子交换纤维素，强酸型阳离子交换剂 交换容量大，回收率高。成本相对低廉。 填料需经过酸洗、减洗等处理步骤，使用前需要充分平衡，操作较 复杂
未知蛋白纯化方法的选择
根据载体选择纯化方法 根据蛋白质性质 热稳定蛋白---热变性初分离 抗体-抗原，底物-抑制剂，例如RNase Inhibitor 纯化----CNBr-activated Sepharose 硫酸铵沉淀与透析 蛋白的稳定与活性——Glycerol 不同纯化方法的组合
pET载体诱导表达 载体诱导表达——经典的表达系统 载体诱导表达 经典的表达系统
表达条件的优化：蛋白不表达，或表达量低，如何解决？ 表达条件的优化：蛋白不表达，或表达量低，如何解决？
温度对表达的影响 培养基对表达的影响（e.g. Glucose 对表达的影响） 对表达的影响） 培养基对表达的影响（ 菌株的选择 不同克隆表达水平的差异 溶氧量与培养体积
原核表达与常用蛋白质纯化技术探讨
北京全式金生物技术有限公司
比较 pET、pMAL、pGEX 表达系统表达和纯化的 pET、pMAL、 优缺点。 优缺点。 介绍pET 表达系统表达条件的优化，纯化技巧。 介绍pET 表达系统表达条件的优化，纯化技巧。 离子交换纯化技巧 未知蛋白如何选择纯化方法，纯化方法如何组合？ 未知蛋白如何选择纯化方法，纯化方法如何组合？ 组合
原核表达及蛋白质的纯化
原核表达及蛋白质的纯化原核表达及蛋白质的纯化与浓度测定之一原核表达一( 实验材料1.大肠杆菌BL21.DH5a2.高盐LB:蛋白胨10g，酵母浸出物5g，NacL10g(低盐LB为5g)，溶于双蒸水，然后定容至1000ml中，121.6?高压灭菌25min-30min后备用3.LB固体培养基:按上述方法配制的液体培养基，每100ml加1.5g琼脂粉，高压灭菌25min-30min，待培养基温度降至常温左右时(一般为不烫手即可)，在无菌状态加入抗生素(3g/200ml)并铺平板，冷却凝固后放入4?备用4.IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷):在8ml蒸馏水中溶解2g IPTG后，用蒸馏水定容至10ml，用0.22μm滤器过滤除菌，分装成1ml小份贮存于-20?，这时配好的。
IPTG浓度为0.8m/mL5.氨苄青霉素(ampicillin)(100mg/ml): 溶解1g氨苄青霉素钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。
分装成小份于-20?贮存。
常以25ug/ml,50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。
6.卡那霉素(carbenicillin)(50mg/ml): 溶解0.5g羧苄青霉素二钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。
分装成小份于-20?贮存。
常以25ug/ml,50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。
7.考马斯亮兰染色液:称取1g考马斯亮蓝R-250,置于1L烧杯中，量取250mL 的异丙醇加入上述烧杯中，搅拌溶解。
加入100mL的冰乙醋酸，均匀搅拌。
加入650mL的去离子水，均匀搅拌。
用滤纸出去颗粒物质后，室温保存。
8.考马斯亮兰脱色液:量取下列溶液，醋酸(冰乙酸)45mL;甲醇 50mL;dH2O10mL,充分混合后使用。
9.10%过滤酸铵 :把1g过硫酸铵溶解于终量为10ml的水溶液中，该溶液可在4 ?保存数周。
10. 5×Tris-GlycineBuffer (SDS-PAGE电泳缓冲液)配制方法 :称取下列试剂，置于1L烧杯中。
纯化实验报告模板
一、实验目的1. 学习纯化实验的基本原理和方法。
2. 掌握常用纯化技术，如离心、过滤、沉淀等。
3. 提高实验操作技能，确保实验结果的准确性。
二、实验原理纯化实验是利用物质的物理和化学性质差异，通过一系列分离、提纯操作，将目标物质从混合物中分离出来。
常见的纯化方法有：离心、过滤、沉淀、萃取、结晶等。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 原始混合物- 纯化试剂（如沉淀剂、萃取剂等）- 水或其他溶剂2. 实验仪器：- 离心机- 烧杯- 玻璃棒- 漏斗- 筛网- 蒸发皿- 烧瓶- 紫外-可见分光光度计（可选）四、实验步骤1. 样品准备- 称取适量原始混合物，加入适量溶剂溶解或悬浮。
2. 离心分离- 将溶解后的样品置于离心管中，以适当转速离心一定时间，分离出固体和液体。
3. 过滤- 将离心后的液体通过滤纸或滤网过滤，去除不溶性杂质。
4. 沉淀- 向过滤后的液体中加入适量沉淀剂，充分搅拌后静置，使目标物质沉淀。
5. 滤取沉淀- 使用漏斗和滤纸将沉淀物与液体分离。
6. 洗涤沉淀- 向沉淀物中加入适量洗涤液，搅拌后静置，再次滤取沉淀。
7. 萃取（可选）- 将滤取的沉淀物加入适量萃取剂，充分搅拌后静置，分离出有机相和水相。
8. 结晶（可选）- 将有机相或水相置于低温环境中，使目标物质结晶。
9. 收集纯化产物- 将结晶或沉淀物过滤、洗涤、干燥，得到纯化产物。
五、实验结果与分析1. 观察实验过程中出现的现象，如沉淀形成、颜色变化等。
2. 记录纯化产物的产量、纯度、物理性质等数据。
3. 分析实验结果，与预期目标进行比较，找出实验中存在的问题和改进方向。
六、实验总结1. 总结实验过程中遇到的困难和解决方法。
2. 评价实验结果的准确性和可靠性。
3. 对实验操作技巧和注意事项进行总结。
七、参考文献[1] 张三，李四. 纯化实验技术[M]. 北京：化学工业出版社，2018.[2] 王五，赵六. 纯化实验原理与方法[M]. 上海：上海科学技术出版社，2019.注：以上实验报告模板仅供参考，具体实验内容和步骤可能因实验目的、材料和方法的不同而有所调整。
原核表达及检测
原核表达及检测摘要：本实验采用IPTG诱导GFP在大肠杆菌中的表达，表明随着时间的推移GFP的表达量越来越多。
随后用SDS-PAGE检测蛋白纯化情况关键词：原核表达SDS-PAGE凝胶电泳广义的原核表达，是指发生在原核生物内的基因表达。
狭义的原核表达，常出现于生物工程中。
是指通过基因克隆技术，将外源目的基因，通过构建表达载体并导入表达菌株的方法，使其在特定原核生物或细胞内表达。
一个完整的表达系统通常包括配套的表达载体和表达菌株。
如果是特殊的诱导表达还包括诱导剂，如果是融合表达还包括纯化系统或者Tag检测等等。
因为只有融合体蛋白才具有生物活性，所以还要进行融合体/包涵体检测。
选择表达系统通常要根据实验目的来考虑，比如表达量高低，目标蛋白的活性，表达产物的纯化方法等等。
绿色荧光蛋白( green fl uorescent protei n, GFP)是238个氨基酸组成的单体蛋白, 其分子量为27kDa 。
1974年由Morie等从海洋生物水母中分离出来[ 1], 并且Prasher等在1992年从水母Aequoreavictoria中成功克隆出了GFP的cDNA[ 2 ]。
GFP作为一种新的报告基因,与以往lacZ、CAT等报告基因相比, 有很多无可比拟的优越性: GFP不具有种属依赖性, 在多种原核和真核生物细胞中都表达;荧光强度高, 稳定性高; 不需要反应底物与其他辅助因子,受蓝光激发产生绿色荧光, 尤其适用于体内的即时检测; 另外GFP分子量小,易于融合, 适用于多种转化方式,对受体无毒害,安全可靠; 并且通过替换一些特殊氨基酸,可以使之产生不同颜色的光,从而适应不同的研究需要。
SDS-PAGE的原理：组成蛋白质的氨基酸在一定pH的溶液中会发生解离而带电，带电的性质和带电量的多少取决于蛋白质的性质及溶液的pH值和离子强度。
聚丙烯酰胺凝胶在催化剂过硫酸铵（简称Ap）和加速剂N,N,N’N’-四甲基乙二胺（简称TEMED）的作用下，聚合形成三维的网状结构。
实验报告DNA提取与纯化
实验报告DNA提取与纯化实验报告：DNA 提取与纯化一、实验目的本次实验的主要目的是从不同的生物样本中提取并纯化 DNA，以获取高纯度、高质量的 DNA 用于后续的分子生物学实验，如 PCR 扩增、基因测序等。
二、实验原理DNA 存在于细胞核内，与蛋白质等成分结合形成染色质。
在提取过程中，需要通过裂解细胞，使 DNA 释放出来，然后去除蛋白质、RNA 等杂质，从而获得纯净的 DNA。
常用的提取方法包括酚氯仿抽提法、盐析法、硅胶膜吸附法等。
本次实验采用的是试剂盒提取法，其原理是基于硅胶膜对 DNA 的特异性吸附，在特定的缓冲液条件下，DNA 能够结合到硅胶膜上，而蛋白质、多糖等杂质则被去除。
经过洗涤去除杂质后，用洗脱液将 DNA 从硅胶膜上洗脱下来，从而得到纯化的 DNA。
三、实验材料与设备1、实验材料新鲜的动物组织（如肝脏、肌肉）植物叶片细菌培养液DNA 提取试剂盒无水乙醇异丙醇氯仿蛋白酶 KRNA 酶 A2、实验设备离心机移液器恒温振荡器电泳仪紫外分光光度计四、实验步骤1、样本处理动物组织：称取适量的动物组织，剪碎后加入裂解液和蛋白酶 K，在 55℃恒温振荡器中孵育，直至组织完全裂解。
植物叶片：取新鲜的植物叶片，用液氮研磨成粉末，加入提取缓冲液和蛋白酶 K，在 65℃水浴中孵育。
细菌培养液：离心收集细菌沉淀，加入裂解液和溶菌酶，重悬后在37℃孵育。
2、 DNA 提取将处理后的样本加入到吸附柱中，离心使液体通过吸附柱，DNA 被吸附到硅胶膜上。
加入洗涤液，离心洗涤吸附柱，去除杂质。
加入洗脱液，离心洗脱 DNA，收集洗脱液。
3、 DNA 纯化向洗脱液中加入等体积的异丙醇，混匀后离心沉淀 DNA。
用 70%的乙醇洗涤 DNA 沉淀，离心去除乙醇。
干燥 DNA 沉淀，用适量的 TE 缓冲液溶解 DNA。
4、 DNA 质量检测取少量 DNA 溶液，用紫外分光光度计测定其在 260nm 和 280nm 处的吸光度，计算 A260/A280 的比值，以评估 DNA 的纯度。
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模块二原核表达和纯化一、实验目的1、获得最佳的表达条件和纯化方法。
2、学习和掌握SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白技术。
二、实验原理聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体和少量交联剂甲叉双丙烯酰胺通过化学催化剂过硫酸胺，TEMED作为加速剂或光催化聚合作用形成的三维空间的高聚物。
聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成的网状结构。
具有浓缩效应、电荷效应、分子筛效应，适用于不同相对分子质量物质的分离，且分离效果更好。
外源基因通过表达载体进入宿主细胞后，会利用宿主的蛋白表达体系表达外源蛋白。
理论上看，只要载体具有良好的表达调控元件，就能成功地表达。
但实际情况不是这么简单。
(1)每次转化获得的菌落，其表达外源蛋白的潜力可能是不一样的。
我们一般认为，同样的质粒和感受态细胞，虽然长出来了不同菌落，但显然它们的遗传物质是一模一样的，所以蛋白表达潜力也应该是一模一样的。
因此认为不同菌落具有不同表达外源蛋白潜力这种说法显然是经验之谈。
可以多挑几个菌落做后续测试。
(2)因此，无论何种条件下外源蛋白表达出来了，接下去的工作是在-70℃冰箱好好地保存菌种。
(3)IPTG是控制外源基因表达的开关，外源蛋白的表达将占用细菌本身的蛋白合成机器和能量，自身的繁殖将减弱。
在更高OD600时诱导，有更高的生物量，通常可以产生更多的外源蛋白。
但IPTG诱导的时间点并非可以无限地延迟，有的细胞在高OD600时诱导可以达到很好的表达的效果，但有的细胞诱导时机一旦OD600 > 0.5，就不表达外源蛋白。
适中的诱导时间点可以设置OD600 = 0.8。
(4)IPTG浓度？通常不是主要因素。
在0.2mM诱导不出的即使加到1mM也不会出来。
(5)诱导时间要进行测试，诱导之后每隔2hr取样检测。
(6)小体积（<200ml）摸索出来的最佳诱导条件，在大体积中（>1L）经常不适用。
所以每次改变系统，通常要重新来过。
(7)当测试完以上条件，还无法表达出蛋白，那么只能重新构建载体，改造外源基因让其更长或更短，还要重新检查外源基因是否有大肠杆菌不喜欢的密码子。
以上测试涉及多个因素多个条件。
需要安排一个试验流程，以求跨过最可能的陷阱。
一般有这些步骤：第一步，固定诱导点（OD600 = 0.8）和诱导时间（2hr），测试多个菌株；第二步，固定测试菌株（前一步骤地最优菌株），测试诱导点（OD600 = 0.3，0.6，0.9，1.2）与诱导时间（1hr，2hr，4hr，8hr）的最佳组合；第三步，大体积培养的诱导条件确认。
确立大体积诱导条件的同时，有外源蛋白表达的菌体，将离心、破碎并进入外源蛋白分离纯化环节。
三、实验方法1．重组质粒在E.coli中的诱导表达试剂材料：转化有表达载体的BL21(DE3)pLys S菌株；IPTG 1M；2×YT培养基: Tryptone 16g/L; Yeast extract 10g/L; NaCl 5g/L; Glucose 2g/L；步骤：a)挑单菌落至0.6ml LB/Amp(50ug/ml)液体培养基，37℃摇菌过夜b)按1：100比例转接到2×YT/Amp(50ug/ml)，37℃振荡培养2－4hrsc)OD600 = 0.8时（此条件可以变动，按照实际情况安排）加IPTG至终浓度0.2－0.5mM，37℃振荡培养d)诱导2hrs后，取1ml，准备SDS-PAGE检测。
2．不连续凝胶SDS-PAGE试剂器材：a)30％Acr-Bis：30g acryamide、0.8g bisacrylamide、ddH2O up to 100ml, filter througha 0.45 um filter, store at 4℃. pH=< 7.0,棕色瓶子保存，每个几个月重新配制b)4×lower buffer（分离胶Tris缓冲液）：150ml ddH2O + 45g Tris base, 1M HCl 调pH 8.8, 补水至250ml，高温灭菌，在无菌工作台中加1g SDS，室温保存（1.5MTris.HCl, pH8.8, 0.4%SDS）c)4×upper buffer（沉积胶Tris缓冲液）：30ml ddH2O + 6.05g Tris base, 1M HCl 调pH至6.8，补水至100ml，高温灭菌，在无菌工作台中加0.4g SDS，室温保存（0.5M Tris.HCl, pH6.8, 0.4%SDS）d)AP （过硫酸铵）10％，现配，或分装保存于－20℃e)10×Running Buffer （Tris－甘氨酸电泳缓冲液）：15g Tris base、72g Glycine，补水至500ml，高压灭菌，在无菌工作台中加5g SDSf)loading buffer（2×SDS凝胶加样缓冲液）：5ml 4×upper buffer、4ml 甘油、0.8g SDS、40mg 溴酚蓝，补ddH2O至20ml，混匀，常温保存g)考马斯亮蓝染色液（500ml）：1.25g考马斯亮蓝R-250溶于250ml甲醇，加50ml乙酸、200ml H2Oh)脱色液：50％甲醇、10％乙酸、40％ddH2Oi)TEMEDj)Bio-Rad电泳系统k)带平嘴针头的25ul或100ul注射加样器l)玻璃纸步骤：i.把玻璃板洗净，用无水乙醇过一下，加快晾干。
在灌胶装置上把玻璃板夹好，一定要对平ii.配5ml 15％分离胶（分离范围12－43kD）：1.1ml ddH2O、2.5ml 30％Acr-Bis、1.35ml 4×lower buffer、最后加50μl 10％AP、2μl TEMED，边加边混匀iii.把分离胶用微量移液器沿一侧夹层垫片灌进夹层，注意枪头不要用力压玻璃板。
灌至液面离外层玻璃顶端约2.5cmiv.加ddH2O约1cm高v.30min后，胶凝固，有明显的折射线。
倒掉水，用滤纸吸干vi.配2ml 5％浓缩胶：1.4ml ddH2O、330μl 30％Acr-Bis、270μl 4×uper buffer、最后加20μl 10％AP、2μl TEMED，灌胶至满vii.将梳子斜着下插，可以防止气泡，插入约1cmviii.配300ml1×Tris－甘氨酸电泳缓冲液ix.约20－30min后凝固，小心拔出梳子，用1×Tris－甘氨酸电泳缓冲液冲洗并覆盖x.待样品处理完毕，将胶板安到电泳槽中，灌1×Tris－甘氨酸电泳缓冲液，先倒里面，淹没上槽的钵金电极，剩下的倒入下槽xi.用注射加样器取10－15ul样品等体积加入加样孔，速度要快，减少样品扩散。
剩余空样品孔加入等体积1×SDS凝胶加样缓冲液xii.80V电泳，等染料从浓缩胶进入分离胶，将电压调至120V，继续电泳至染料到达凝胶底部xiii.在装有蒸馏水的盆子中，小心把胶剥下。
把胶转移到盛有适量考马斯亮蓝染色液的9cm平皿中，摇动染色40min以上xiv.回收考马斯亮蓝染色液，用脱色液摇荡清洗2hrs以上xv.蒸馏水清洗。
在装有蒸馏水的盆子中，用玻璃纸把胶包住，里面不准有任何气泡。
平整地夹在玻璃板或塑料板上，干燥约一天。
3．SDS-PAGE 样品处理a)对于菌液，取200μl 12,000rpm离心30’’，弃上清，倒置离心管充分流干b)加50μl ddH2O，震荡均匀，加入50μl 2×SDS凝胶加样缓冲液，5μl 2－ME，沸水煮5minc)12，000rpm 5min，取上清10－20ul上样SDS-PAGE4．Bradford法测蛋白浓度试剂：1）BSA 1ug/μl TaKaRa公司2）Bradford试剂：100mg 考马斯亮蓝G-250 溶于50ml 95％乙醇，加入100ml 85％磷酸，用蒸馏水稀释到1000ml，滤纸过滤。
最终试剂中含有0.01%考马斯亮蓝G-250，4.7%（W/V）乙醇，8.5%(W/V)磷酸。
步骤：1）取1－2ul细胞提取液，加入499μl 双蒸水，500μl Bradford试剂，混匀2）室温5－10min，放置时间不超过1hr为佳。
3）在595处相对空白读出吸光度。
同时用BSA建立标准曲线。
（0，2，4，6，8，10，12，15 μl BSA）5．金属螯合层析试剂材料：Chelating Sepharose Fast Flow介质；PD-10柱；buffer A(20mM Tris-HCl, pH8.0, 0.5M NaCl)；ddH2O；0.2M NiSO4；含80mM咪唑的bufferA；含200mM咪唑的bufferA；透析袋；AgNO3步骤：1.装柱和平衡：洗净PD-10柱（体积约15ml），安装好流通及速度调节器；加入10mlddH2O，缓慢加入稀糊状Chelating Sepharose Fast Flow介质，同时打开速度调节器，液体以4s/滴的速度缓慢流出。
介质均匀沉降至离PD-10上口5cm处时停止加介质。
同时连通上口的导管，用ddH2O平衡几个小时。
流速2ml/min。
2.上镍：20ml(两倍柱床体积) 0.2M NiSO4过柱，流速约10ml/hr。
bufferA平衡。
3.加样和洗脱：加入蛋白样后，用bufferA平衡。
用80mM咪唑的bufferA洗脱。
再用200mM咪唑的bufferA去除其他蛋白。
恢复层析柱。
4.透析除盐：将洗脱峰装入合适的透析袋，夹紧袋口，放入1000ml蒸馏水的烧杯，电磁搅拌，30min－1hr换水一次，4－6次后，检查Cl－离子是否除尽。
检查方法：2－3滴透析外液于1ml AgNO3中，如无沉淀，即透析完全。
四、实验结果与分析本次实验最终得到SDS-PAGE拍胶结果如下：有些条带呈现两边翘中间凹下，原因可能是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，以后可待凝胶充分凝固再作后续实验。
而凝胶中也出现了拖尾现象，可能是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。
可在加样前离心或选择适当的样品缓冲液，或降低凝胶浓度。
出现的纹理现象可能是样品不溶性颗粒引起的。
但总体来说，还是可以看出诱导前后有明显差异，诱导后出现明显的蛋白质条带。
本次实验虽然有结果，但在第一次跑SDS-PAGE时由于漏胶，而且当时没有足够的药品，因而跑胶结果并不好，幸而最后总结了前面的错误经验，跑胶成功。
通过这一模块的实验，深深感到做实验要有一个清晰的思路，要熟悉各个步骤的操作和原理，以后还有很多不足之处有待改进。