2018-大肠杆菌菌种活化步骤-推荐word版 (6页)

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大肠杆菌菌种活化步骤

篇一：抑菌实验步骤

抑菌实验：待测菌金色葡萄球菌；枯草芽孢杆菌；大肠杆菌；绿脓杆菌

菌种活化：菌种，进行活化，可以划线，也可以涂布，

划线：直接用接种环在酒精灯上烧过之后，等之冷却，蘸

取进行划线！

涂布：用枪头吸取100ul的菌液涂布既可！本实验采用涂

布法

1.金色葡萄球菌最佳生长条件(过夜培养一般为12h)

2. 枯草芽孢杆菌培养条件（过夜培养）

3.绿脓杆菌最佳培养条件（14-17h）

培养基

MH（A）培养基( Mueller-Hinton Agar)成分：牛肉浸粉（牛肉膏） 5g；酪蛋

白水解物 17.5g；淀粉 1.5g；琼脂 12.5g

MH液体培养基配制方法：称取本品36.5克，加入1000ml蒸馏水中，加热煮沸

溶解，分装，121℃高压灭菌15分钟备用。

牛肉膏蛋白胨固体培养基（LB培养基）：牛肉膏10 g，蛋白胨10 g，琼脂15g，NaCl 5 g，双蒸水1000mL，pH 7.2-7.5，121℃灭菌20min。

牛肉膏蛋白胨液体培养基：不加琼脂，其他同牛肉膏蛋白胨固体培养基。

菌悬液的配制

将冰箱保存的大肠杆菌移接到牛肉膏蛋白胨固体培养基上，置于37℃恒温培养

箱中培养24 h，用接种环挑取少许菌体与装有无菌生理盐水的试管中，震荡均匀，制成菌悬液。具体为用接种环挑取一环（本实验是吸取100uL菌悬液）于

5 mL的无菌生理盐水中，每10倍稀释一次地逐级稀释，取（10-8、10-9、10-

10 、10-11）的浓度100μL做涂布实验，每个梯度平行三组，加100μL药品

溶剂（二甲基亚砜）的空白对照3个平板，完全不加任何样品即只是LB培养基的完全空白对照1个平板，调整菌悬液浓度，用平板菌落法测定其菌液浓度，

使其含菌体数为103 cfu/mL，即为供试菌悬液。

抑菌作用初步筛选

将灭菌固体培养基加热至熔化，待冷却至50℃时，每20ml培养基倒入无菌培

养皿中。待平板自然晾干后，分别移取0.1ml待测药品，0.1 mL供试菌悬液，

均匀涂布于加药平板上，每个处理3次重复。(涂布30min后再倒置)另设置对

照组，涂菌，以等量无菌水（溶解药品物质）代替药液。上述操作在超净工作

台内进行。将做好的细菌平板在37℃恒温培养24 h，统计菌落个数，按照下式计算抑菌率。

抑菌率=对照菌落数-处理菌落数?100% 对照菌落数

实验结果表示为：平均数±标准误差（Mean±SDE）。

菌种活化：37℃培养；约24H

挑取两环于50ml 液体培养基上活化：先恒温150r/min震荡12h,再静置培养

8-12h。达到稳定期后，4度保藏，备用。

生理盐水：8.5gNaCl加入到1000ml 蒸馏水中，121度高压蒸汽灭菌15-20min

即可。

篇二：大肠杆菌电击转化流程

大肠杆菌感受态制备及电转化流程

1. 细菌电转化感受态细胞的制备

准备：50mL离心管3个 10%甘油≥200mL

灭菌蒸馏水≥100mL 冰盒（50mL离心管预冷）2个

1）由-80℃冰箱保存的菌种划单菌落，过夜培养16-20h。晚上将新鲜的菌落接

种于装有20mLLB培养基的250mL三角瓶中，37℃振荡培养过夜（约12h），转

速控制在200rpm；

2）第二天，取过夜培养物以1%接种量（可适当加大）转接入2个含50mLLB培

养基的 250mL三角瓶中，37℃剧烈振荡（200rpm）培养至OD600约为0.5~0.6；

3）将2瓶细菌培养物分别倒入两个预冷的50mL离心管，然后至于冰水混合物

中骤冷，一定要骤冷，冰水混合物中冷却至少15min（需要的话这种方式可以

存放培养液数小时）

3）将离心管于4℃，4000rpm，离心10min，收集菌体，弃上清；

4）用50ml灭菌蒸馏水(预冷至4℃)轻轻重悬菌体，先加入少量水重悬菌体，

然后把水加满，4℃，4000rpm离心10min，弃上清，再重复一次；

5）再用10%甘油重复步骤4）两次，4000rpm离心10min，最后一次倒尽上清后，再用残存管底的甘油悬浮细胞，分装ep管，100μL/支（一般，25mL起始培养

物最终用200-250μL l0%甘油悬浮）；

6）放入-80℃冰箱中速冻。或者立即用于电转化。

注意：

1）菌种最好是-80℃冻存的，活化后生长状态较好。

2） 20ml培养过夜，振荡速度不要过高（一般应该是37℃，300rpm，6h，当天转接，这样一天内工作量太大，这里我们选择过夜培养，时间长，转速控制在200rpm，可以适当缩短时间，前一天晚接种，第二天早转接）

3）培养完毕后一定要骤冷，是培养物在短时间内迅速冷却。冰水混合物中摇

动瓶子，大约15min。

4）使用的器皿一点要非常干净，没有化学物质残存，可以先用餐洗净洗，

再加入NaOH固体和蒸馏水产热，最后用蒸馏水反复冲洗干净。注意pH值检测

5）培养完毕后的离心操作一定要低温，所用的水和甘油，离心管都要冰上预冷。 6）整个过程尽量不要用枪吹打。

7）器皿和试剂最好最后用重蒸水涮洗和配置。

8）控制好菌体的OD600值，收菌以半对数期合适，一般OD为0.5~0.6最佳，过则不佳。

9）最后一次务必倒尽上清后，用残存管底的甘油悬浮细胞，一般每管仅剩

200μL左右。切勿用过多甘油也悬浮细胞，我曾用350-500μL10%的甘油/25mL 出发菌液，导致细

胞浓度下降，电转效率低2-3个数量级。

2 电转化

准备：冰盒、1.5mL离心管、电击杯、37℃的LB培养基