食品生物技术-第四章 细胞工程

气体搅拌反应器的优点及存在的问题
优点：剪切力小，对植物细胞损伤小；因没有搅 拌轴而更易保持无菌；操作费用低。
不足：因气体搅拌强度低，高密度培养时混合不够均 匀。靠大量的通气输入动量和能量，以保证反应器内培 养液的良好传质、传热。但过量的通气易排除培养液中 的二氧化碳和乙烯，对于细胞生长有阻碍作用。再是过 高的溶氧对植物细胞合成次级代谢产物不利。
二、细胞培养一般步骤
1.首先，要取材和除菌。用一定的化学试剂对材料进行 严格的表面清洗、消毒。有时还要借助某些特定的酶，对 材料进行预处理，以期得到分散生长的细胞。
常用的消毒灭菌剂:效果较好的有几种化学试剂，如次氯 酸钙、次氯酸钠和氯化汞等。
2.其次，根据各类细胞的特点，配制细胞培养基，对 培养基进行灭菌或除菌。采用无菌操作技术，将生物材料 接种于培养基中。
三、动物细胞工程的应用
1.在疫苗生产上的应用 。 将
乙型肝炎表面抗原基因插入哺乳动物细胞内进行高效表达， 已2. 生生产产单出克乙隆型抗肝体炎疫苗。
单克隆抗体可以检测出多种病毒中非常细微的株间差异，鉴定 细菌的种型和亚种。 3.繁育优良品种。
目前，人工受精、胚胎移植等技术已广泛应用于畜牧业生产。 4. 在干扰素生产上的应用
Jones 在填充床反应器中进行了固定化胡萝卜的培 养，Kargi 采用这种反应器培养长春花
流化床反应器 典型的流化床反应器是利用液体或气体的流 动使支持物颗粒处于悬浮状态。 优点：良好的传质特性。 缺点：剪切力和颗粒碰撞会损坏固定化细胞， 同时，流体动力学的复杂性使之难以放大。
Hamilton 用之培养胡萝卜细胞，研究了转化酶活性。
悬浮培养优势 1）培养细胞与培养基质接触面大，传质效果好。 2）可带走有害的代谢产物，避免了有害产物局部浓度过高 的问题。 3）能充分保证氧的供给。
2.植物细胞固定化培养
固定化培养技术
植物细胞固定化是将植物细胞包裹于一些多糖 或多聚化合物上进行培养，并生产有用代谢物的 技术。
固定化培养优势
（1）有利于次生物质的合成、积累； （2）减弱剪切力损伤； （3）有利于连续培养和产物的收集；
优点：机械搅拌生物反应器最大的优点就是获得高的溶 氧系数 (KLa ＞100h-1)，植物细胞培养一般只需要KLa在520 h-1之间就够了；再是反应器的温度、pH值、溶氧及营养 物质的浓度较易控制。
存在的问题：主要问题是剪切力问题；对只需较低kLa 的植物细胞培养，促进氧传递的机械搅拌，每单位体积消 耗的功率比气体搅拌要大；机械搅拌需搅拌轴，由此又带 来了无菌密封问题。
1756年，Moncean首先发现植物在受 伤愈合的组织皮层能产生芽，因而预言这 一途径可以成为一种繁殖方式
1902年，德国著名植物生理学家Haberlandt, 提出细胞全能性学说，并 首次进行高等植物的细胞培养实验，但细 胞未能发生细胞分裂和增殖。
培养技术建立
植物细胞培养技术应用发展
20世纪40年代：J.Bonner 银胶菊组织培养生产橡胶。 20世纪70年代：植物细胞培养生产药用成份。 20世纪80年代：400多种植物，600多种代谢产物。40多种 植物次生代谢产物达到或超过植株产量。 20世纪90年代：1000多种植物。
氨基酸
虽然植物细胞在培养过程中一般都能合成所需的氨基酸， 但加入L-谷氨酰胺或其他氨基酸混合物是很有好处的。此 外，还使用蛋白酶解产物，如酪蛋白或酪蛋白水解氨基酸。 其它有机添加剂还有如乳蛋白水解物，酵母提取物等
植物生长激素
激素分为两类，生长素和分裂素。生长素促进细 胞生长，最有效和最常用的是吲哚乙酸和萘乙酸； 分裂素促进细胞分裂，常用的是腺嘌呤衍生物。使 用最多的是6-苄氨基嘌呤和玉米素，对芽的诱导具 有重要作用。分裂素和生长素通常一起使用，来促 进细胞的分裂、生长。
第二节、植物细胞培养技术
细胞培养
是指动物、植物和微生物细胞在体外无菌条 件下的生长、分裂和繁殖，并在培养过程中不再 形成组织的一项技术。
一、 植物细胞工程的发展
理论基础和探索
细胞学说的创立：1838～1839年间由德国的 植物学家施莱登（Schleiden）和动物学家施旺 （Schwann）所提出,直到1858年才较完善。
2)固定化细胞生物反应器
固定化细胞：将一定生理功能的生物体用物理或化学方 法使其与适当载体相结合，作为固体催化剂利用。
填充床反应器
优点：单位体积细胞多，受剪切力小。 缺点：由于其混合效果低，对必要的氧传递， pH值、温度控制和气体产物(如C02)的排除造 成了困难。再者支持物颗粒破碎易堵塞填充床。
3.植物细胞培养生物反应器
1）悬浮培养生物反应器
机械搅拌反应器
植物细胞大规模培养的初期（20世纪70年代）， 主要采用微生物培养用的机械搅拌反应器。
1972年，Kato首先用机械搅拌反应器培养烟草细胞 以获取烟碱。Fujita利用这种反应器生产紫草宁。
机械搅拌植物细胞反应器
机械搅拌反应器的优点及存在的问题
• 三个层次：单个细胞培养、组织培养、器官培养 • 微生物一般划分到发酵工程 • 植物细胞和原生质体的培养可以用于育种，优良植株的
快速生长。 • 动物细胞培养多用于产生有价值的细胞产物，如 疫苗。产品检测、疾病治疗。
1）植物细胞和组织培养技术
2）动物细胞和组织培养技术
动物
3）细胞融合技术（体细胞杂交 技术）
6）胚胎工程技术
胚胎工程技术是一项综合性繁殖生物学技术，主要包 括体胚胎移植和分割技术、卵母细胞体外成熟和移植技 术、胚胎冷冻保存、克隆动物及临床移植治疗疾病
7）干细胞和组织工程
8）细胞培养生物反应器
2、植物细胞工程的应用
紫杉醇(taxol)是从红豆杉 属(Taxus L.)植物中分离出 的一个具有独特抗肿瘤活 性的二萜类化合物，现已 应用于临床治疗卵巢癌和 乳腺癌。
四.愈伤组织和悬浮细胞培养技术
愈伤组织：是指外植体组织增生的细胞产生的一团不定型 的疏散的排列的薄壁细胞，是分化的，而且还未形成组织 的结构。
外植体：是指植物组织培养中用来进行离体培养的植物材 料。
愈伤组织的诱导
①选择适宜的外植体：幼胚、下胚轴、子叶 ②选择适宜的培养基：MS，B5，N6
较高激素浓度 丰富的有机附加物。 培养基中有较高含量的无机氮源 较低的蔗糖浓度 ③适当缩短继代培养的间隔时间有利于疏松易碎愈伤 组织的形成。
3. 最后，将接种后的培养基放入培养室或培养箱中，提供 各类细胞生长所需的最佳培养条件。当细胞达到一定生物 量时应及时收获或传代。
三.植物细胞培养基
用于植物细胞培养的基础培养基营养成分基本上与整 个植物的要求一样，但是用于培养细胞、组织和器官 的培养基要满足各自特殊的要求
植物细胞的培养基:通常包括无机盐、碳源、 维生素、生长调节素、有机添加剂等。
植物细胞大规模培养的特点
①植物细胞对剪切力敏感。 ②植物细胞培养通常形成细胞团。 ③植物细胞生长速度慢，操作周期长 ④多泡沫。 ⑤植物细胞在高浓度培养时为假塑性流体。 ⑥植物细胞的需氧量要比微生物要低的多。 ⑦大多数植物细胞培养需要光照。
1.植物细胞悬浮细胞培养
悬浮细胞培养技术 把离体的植物细胞悬浮在液体培养基中进行增殖培养
碳源和能源
培养中的细胞对蔗糖和葡萄糖都能利用， 果糖的利用效果较差。培养基中的蔗糖可迅 速分解成葡萄糖和果糖，葡萄糖首先被利用， 然后再利用果糖。也可采用其它糖作能源， 但效果不佳。
维生素
培养中的植物细胞都需要硫胺素，加入烟 酸、泛酸、生物素和叶酸，效果更好。原生 质体培养通常需要大多数必需维生素。
细胞融合是指利用人工和自然的 方法将两个或几个不同亲本细胞 融合成一个细胞，用于改良或创 造新的物种及生产单克隆抗体。 四个步骤：
细胞标记---融合的细胞进行遗传标记 原生质体的制备---酶法破处细胞壁 诱导细胞融合---两种或两种以上细胞 按一定比例置于高渗溶液，加入诱导 剂或物理方法促进融合 筛选杂合细胞---利用遗传标记，筛选 有双亲遗传特性的的杂合细胞。
观察。筛选效率高、筛选量大、操作简便。 缺点：
通气状况不好，排泄物质易积累造成 毒害或影响组织吸收。
微室培养
在人工制造的无菌小 室中，将一滴悬浮细胞 液培养在少量培养基上， 使其分裂增殖成细胞团 的方法。
优点： 可对培养细胞连续进行显微观察，了解一个细胞的生
长、分裂、分化等过程。 缺点：
培养基少，营养和水分难以保持，pH变动幅度大，培 养细胞仅能短期分裂。
用一块活跃生长的愈伤 组织来促进培养细胞持续 分裂和增殖的方法。
优点： 简便易行，效果好。 缺点： 不能在显微镜下追踪细胞 分裂、生长过程。
平板培养
将悬浮单细胞与融化 的琼脂培养基均匀混合 后平铺一薄层在培养皿 底上的培养法。
平板培养植板率
优点： 单细胞在培养基中分布均匀，便于在显镜下对细胞进行定点
细胞工程的核心技术：细胞培养与繁殖
目的：获得新性状、新个体、新物质
研究范畴
•研究对象：植物细胞、动物细胞、微生物细胞 •根据改造遗传物质的不同层次可分为： •大规模细胞培养 •细胞融合 •细胞拆合（核移植、细胞器移植） •染色体工程 •胚胎工程（胚胎培养、胚胎移植）
1、细胞培养
• 细胞培养是指微生物细胞、植物细胞、动物细胞在人工 提供的体外条件下进行生长和繁殖。
4)细胞拆合
• 细胞拆合是指通过物理或化学的方法将完整细胞的细胞 核和细胞质分离开，或将细胞核吸出来，再将同种或异 种的细胞核和细胞质重新组合起来，培育成新的细胞或 新的生物个体的过程，也包括各种细胞器的分离和重新 组合。
• 最早：紫外线、激光破坏细胞核，再用微吸管将其它细 胞核注入
• 后期：用微吸管将细胞核吸出，再注入其它去核细胞中， 进行融合。
第四章 细胞工程
与食品工业