蛋白质飞行质谱技术在肝癌早期诊断中的应用_韦霄剖析

702Guangxi Medical Journal , May .2006 , Vol .28 , No .5 ○综述与讲座蛋白质飞行质谱技术在肝癌早期诊断中的应用△广西医科大学公共卫生学院(南宁530021)韦霄综述何敏＊张志勇审校原发性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是最常见的恶性肿瘤之一,严重的威胁着人们的健康。

全世界每年大约有50 万人患肝癌,而我国占全世界肝癌发病的一半以上〔1〕,其中每年约11万人死亡,占全世界肝癌死亡人数的45%〔2〕。

据卫生部统计,20世纪原发性肝癌已上升为我国第二位癌症杀手,在城市和农村都仅次于肺癌〔3〕。

由于目前对肝癌的病因还不是很清楚,且尚无有效的治疗手段,所以对肝癌的二级预防就显得尤为重要。

1目前肝癌的诊断技术目前肝癌的主要诊断依据是血清学和影像学。

甲胎蛋白(Alphafetoprotein, AFP)是临床上常用的血清学指标, 但近1 3的肝癌患者AFP阴性,且其特异性较差〔4,5〕。

超声也是肝癌诊断的重要手段,但超声只能发现 1 cm以上的病灶,对弥漫型和转移性小结节型肝癌容易漏诊〔6〕。

因此,临床工作者试图寻找其它肿瘤标志物来帮助诊断,如配合谷氨酰转肽酶(γ- GT)、α- L-岩藻糖苷酶(AFU)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和DR-70TM等检测,虽灵敏度大大提高,但特异度仍较差〔7〕。

肝癌早期没有明显体征,绝大多数病人在晚期才被发现。

因此,探索和建立一种简单、快速、灵敏度高和特异性强的早期诊断技术已成为临床上的迫切需要。

2蛋白质飞行质谱技术蛋白质飞行质谱技术又称表面增强激光解析及电离飞行时间质谱(Surface Enhanced Laser Desorption Ionization Time of Flight-Mass Spectrom, SELDI-TOF-MS)技术,该技术整合了芯片和质谱技术,将蛋白样品的制备、生化反应和检测分析等过程集成在芯片上进行。

它的出现促进了肿瘤蛋白质组学的研究,在寻找新的肿瘤标记物用于早期诊断、筛查和监测治疗效果方面展示了自身特色。

其原理是样品经过简单的预处理后直接地加到表面经过特殊修饰的芯片上,不同芯片可以选择性地捕获阳离子蛋白、疏水性蛋白和金属结合蛋白等,结合能量吸收分子(Energy Absorbing Molecules,EAMs)后的蛋白质在真空管中经激光轰击吸收能量后电离,带有电荷的蛋白质在加速电场的作用下,脱离芯片表面向阴极飞去,荷质比(Mass Charge ,M Z)大的飞行时间长, M Z 小的飞行时间短,以此标记蛋白质的分子量,绘出蛋白质图谱,再经专用蛋白图谱统计软件分析,可直接显示样品中各种蛋白质的含量、大小等信息。

SELDI 蛋白芯片技术具有直接用粗样本(可直接检测不经处理的尿液、血液、脑脊液、关节腔滑液、支气管洗出液、细胞裂解液和各种分泌物等)、不需任何标记或加尾、所需样品体积少(0.5～400μL)、简便易行、分析速度快(整个测定过程一般可以在 5 min内全部完成)、高通量、灵敏度高(检测范围为1～50 fmole蛋白质)、特异度高、重复性好、检测分子量范围广(500 Da～500 kDa)和所得蛋白质信息多等特点〔8～10〕。

在寻找卵巢癌、前列腺癌、肺癌、乳腺癌、大肠癌等疾病的诊断标志物方面已经取得了较大进展〔11～15〕。

3蛋白质飞行质谱技术在肝癌早期诊断中的应用研究Poon 等运用蛋白质飞行质谱技术,从肝癌患者血清中筛选出差异蛋白,并建立了相应肝癌蛋白质指纹图谱。

然后应用这一图谱预测未知血清样品,包括肝癌患者、肝良性病变患者(肝硬化和肝炎)和正常人,达到较高的灵敏度和特异度〔16～19〕,为肝癌的早期诊断提供了一条新的途径。

同时还发现,不同亚型肝癌细胞与正常肝细胞蛋白质谱比较存在共同的差异蛋白,而不同亚型肝癌细胞之间的蛋白质谱表达也有差别〔2,20〕,这为了解肝癌的发生机理提供了新线索。

比较各学者在使用检测样品种类、芯片类型、样品的处理和数据分析系统等方面的差异,总结如下。

3.1 检测样品种类对肝癌研究目前所使用的检测样品只有血清和细胞裂解液。

由于血清中蛋白部分来源于组织细胞的分泌和代谢,组织细胞发生病理改变时,其细胞内改变的成分包括肽类、蛋白质、酶类和代谢产物等可分泌到血液中,比如肝癌可在血清中检测甲胎蛋白,卵巢癌可在血清中检测CA125 抗原,前列腺癌可在血清中检测PSA 抗原等〔21～23〕。

因此,Poon等〔16～19〕从肝癌血清中检测到较多的肝癌蛋白标志物。

值得一提的是, Valerie等还从筛选出来的肝癌蛋白标志物中分离、纯化出了一个P值最有意义的蛋白(8 900 Da),并进行了测序鉴定。

当然细胞内发生改变的蛋白有的可释放入血作为临床诊断的标志蛋白,但也有许多蛋白只存在于细胞内并不分泌或代谢到细胞外,这部分蛋白也可能是与癌症的发病密切相关的功能蛋白和调节蛋白,而在血清中不能检测出来。

因此,肖雪媛等〔2,20〕应用蛋白质芯片技术对体外培养的肝癌细胞株进行了检测,初步筛查肝癌细胞株的标志蛋白。

体外培养的肿瘤细胞株虽然不能完全反应体内肿瘤细胞的生长状态和生物学特性,但它具有细胞成分单一、均质性好和实验条件容易控制等特点。

尤其在做对比性研究时,可避免由组织细胞成分复杂、细胞异质性高等缺点造成的结果不真实和不可靠,还可用以验证肝癌细胞中的标志蛋白是否与肝癌病人血清中筛选出的标志蛋白一致。

△ 广西壮族自治区自然科学基金资助项目(合同号:桂科攻0322025-2;0428005-12)＊广西医科大学医学科学实验中心广西医学2006年5月第28卷第5期7033 .2 检测芯片类型蛋白质芯片的固相层析表面可分为两类,即化学色谱表面和生物表面。

化学色谱芯片包括弱阳离子亲和芯片(Weak Cation Exchange Array,WCX2)、强阴离子亲和芯片(Strong Anion Exchange Array,SAX2)、疏水蛋白结合芯片(Hydrophobic, H4)、金属离子型芯片(Immobilized Metal Affini-ty Capture Array With Copper Surface , IMAC-Cu、Immobilized Metal Affinity Capture Array With Copper Surface , IMAC-Zn)等多种类型,主要用于表达蛋白的分析;而生物芯片是利用抗体-抗原、受体-配体、酶-底物和蛋白质-DNA之间特异性的分子识别机制,从复杂的蛋白混合物中捕获相应蛋白质或经过特殊修饰的蛋白质,达到分离提取靶蛋白的目的。

目前〔2,16～20〕应用蛋白质芯片技术对肝癌患者血清或肝癌细胞进行分析时多采用弱阳离子亲和芯片和金属离子型芯片,因为这两种芯片捕获件。

Proteinchip Software软件系统主要是进行数据库的建立、对内部信息及外部信息的校准、获取数据并得到蛋白质的相对含量和质荷比。

Biomarker Wizard软件是一个较为简单的统计学软件,可对数据进行预处理,过滤一些噪声及实验本身造成的误差,通过方差分析和ROC曲线下面积对Proteinchip Software 软件得到的数据进行特征选择和提取,为决策树模型或人工神经网络模型软件提供数据。

最后应用决策树模型或人工神经网络模型软件进行分类器的设计,采用交叉验证的方法对训练集和测试集进行分类的决策,从而实现利用蛋白质指纹图谱在肿瘤诊断中的应用。

国内外学者〔16～19〕使用的分析软件各有不同,但不管用决策树模型软件还是人工神经网络模型软件进行分析,都能够得到相类似的、较稳定的结果〔24〕。

所不同的是,前者是一个数据挖掘软件,其采用的是的蛋白数量更多。

虽然各学者从肝癌患者血清或肝癌细胞中决策树模型,而后者是以计算机网络系统模拟生物神经网络检测出的标志物不尽相同,但是至少说明这些标志物的一些的一种智能化信息处理系统软件。

相对于人工神经网络模共同的生物学特性,就是这些标志物蛋白的表面物质等电点型,决策树的优点是比神经网络易理解。

高、带正电(如赖氨酸、精氨酸和组氨酸),且还可以通过其表3.5 检测的灵敏度和特异度虽然从目前所筛选出来的差面的组氨酸、色氨酸、半胱氨酸或磷酸化氨基酸和金属离子发异蛋白来看,一个共同点就是,对肝癌的诊断的特异度明显优生螯合。

于相同灵敏度时血清学诊断中AFP等指标和一些影像学诊3 .3 样品的处理虽然蛋白质芯片技术可以直接对粗样品断方法,但其实各研究小组在使用的芯片类型,样本的处理、(包括血液、细胞裂解液等)进行检测。

但也有学者〔2,16,20〕先数据分析系统及选择蛋白峰建立诊断模型时却不尽相同(见把血清或细胞裂解液样品用阴离子交换柱进行梯度洗脱分离表1)。

这说明可能由于疾病本身的复杂性和病人年龄、性后,再用蛋白质芯片进行检测。

由于离子交换层析是基于所别、饮食、基因等个体差异的影响,很难从两组病人血清中成带电荷的蛋白分离方法,故在阴离子交换柱中,带负电的肽或千上万的潜在蛋白标志物里面寻找到完全相同的差异峰,即蛋白(缓冲液pH值高于pI值时)可与阴离子交换物(柱子基使使用相同的仪器,由于此种方法检测血清中的潜在蛋白对质中耦合的正电基团)结合,然后目的蛋白就可用低pH值或实验操作过程及血清的储存条件非常敏感,也可能会出现不高盐的缓冲液洗脱下来,可以用于分离酸性蛋白(pI值<6)。

同的结果。

另外Poon等以全部250个蛋白差异峰建立的肝样品预处理的好处是,样品中富集的蛋白分离成几个限定的癌与慢性肝病完整诊断模型和Valerie等以其中的6个蛋白差部分,减小了高分子量蛋白和低分子量蛋白与芯片的竞争结异峰建立的简化诊断模型的诊断灵敏度和特异度相比,两者合及高丰度蛋白对低丰度蛋白的信号抑制。

结果表明,分离差别不大,但明显高于以单一蛋白差异峰建立的诊断模后从肝癌血清和肝癌细胞裂解液中可检测到更多有意义的蛋型〔17〕。

胡跃等〔24〕也分别用乳腺癌完整诊断模型和简化诊断白差异峰,且多为酸性蛋白。

模型盲测乳腺癌,发现两模型的灵敏度和特异度差异无统计3 .4 数据分析系统蛋白质芯片数据分析系统使整个操作学意义。

虽然在实际应用中简化模型的可操作性更强,但肿过程变得自动化、简捷化和人性化。

且软件控制分析系统不瘤是一种多阶段演进、多基因参与的极其复杂的异质性疾病, 断地处于研发过程,目前所用的软件系统有Proteinchip Soft- 其发展演进过程绝非一种简单的模式所能概括,仅依靠一个ware、Biomarker Wizard、Biomarker Pattern(决策树模型)和 Artifi- 或几个标志物来完成癌和非癌的鉴别也是不完善且不现实cial Neural Networks Model(人工神经网络模型)软件等几个软的。