武汉大学动物细胞工程复习题.

1 《动物细胞工程》的基本概念及主要研究内容。

动物细胞工程是通过细胞及其组分的人工操作，来研究生命活动规律，实现遗传改造，结合非生物材料等手段，生产用于治疗疾病的人工器官、代谢产物等或用于深入研究的材料。

动物细胞工程所涉及的主要技术有细胞培养、细胞融合、染色体或染色体组转移、基因转移以及动物胚胎工程等，从细胞整体水平、核质水平、染色质水平和基因水平上对细胞进行遗传操作。

2 人造细胞概念及技术。

1 从山羊身上取出支原体细菌体，再将该细菌体的内部掏空，备用。

2 研究人员通过邮购目录购买DNA片段，随后用4个瓶子装上含此DNA片段不同序列的物质。

3 含DNA片段不同序列的瓶装物质被放入酵母液中，使其重新组合形成人造DNA。

4 人造DNA被植入备用的支原体细菌体中，随后该细菌体会分裂成两个子细胞，一个含人造DNA，一个具有天然DNA。

5 向培养皿中加入抗生素，导致具有天然DNA的细胞被杀死，而含人造DNA的细胞得以存活。

6 支原体细菌体中的原有天然DNA被彻底清除，最终由人工DNA支撑其恢复生命机能，自此“人造细胞”得以生成。

能够自我复制的人造细胞诞生 2010年05月22日13:59 科技日报本报讯据英国《泰晤士报》5月21日(北京时间)报道，有“科学怪人”之称的美国生物学家克雷格·文特尔领导的研究小组宣称，他们已经在实验室制造出了首个完全由人造基因指令控制的细菌，这标志着“人造生命”这个梦想已经走进现实。

文特尔研究小组将制造生命的研究分“三步走”，而整个过程从四瓶化学物质开始。

第一步，研究人员制造出丝状支原体(Mycoplasma mycoides)细菌的4个DNA碱基，合成出108万个DNA片段。

第二步，将这些片断“组装”成完整的基因组。

第三步，将人造基因组注入另一种剔除了遗传物质的近亲细胞山羊支原体(Mycoplasma capricolum)中，并且激活了该细胞，最终得到了一个新的、完全被人造基因组控制的人造细胞Synthia。

到目前为止，新细胞已经分裂了10亿多次。

文特尔指出，这个名为Synthia的人造细胞是能够自我复制的生物，它的出现意味着，人类能够制造出自然界从来不曾出现的、具有特定功能的生物有机体。

研究人员希望使用这项技术制造生物燃料、海藻以及更好的疫苗等。

文特尔的技术进展“一石激起千层浪”。

有些科学家承认，在人工合成迄今为止最大的DNA方面，在足以替代细菌自己的DNA方面，文特尔都取得了巨大的进步。

但也有人持不同的意见。

据美国《纽约时报》20日报道，诺贝尔生理学与医学奖获得者大卫·巴尔的摩教授认为，除了组装出一块大的DNA外，文特尔的实验没有取得新的突破，“他并没有制造生命，仅仅模拟了生命。

人类要制造出人造生命，还有很长的路要走”。

另外，该项研究也引发了公众有关伦理道德的忧虑。

批评人士担心这种技术会带来“生物恐怖主义”，威胁环境和人类健康。

他们希望政府出台更加严格的管理政策。

对此，据《纽约时报》报道，美国总统奥巴马要求白宫生物伦理委员会于6个月内提供一份有关合成生物学的详尽研究报告。

奥巴马表示，新的技术进展提出了“真正的忧虑”。

早在2002年9月，美国科学家艾克德·魏玛领导的研究小组曾合成出脊髓灰质炎病毒的全基因组序列，该病毒基因组不仅可以指导合成出与天然病毒蛋白质同样的蛋白质，而且同样具有侵染宿主细胞的活力。

文特尔的实验原理上同魏玛的一样，只不过，魏玛的病毒的基因组仅有7500个片段，而文特尔的细菌的基因组拥有的基因片段更多而已。

加拿大生物伦理学组织ETC主任帕特·穆尼表示，文特尔的技术是一个潘多拉的魔盒，我们都必须面对其可能会引发的巨大震动。

(刘霞)在生物学界被称作“坏小子”，文特尔有时的确挺不招人待见，但巴尔的摩作为一位令人尊敬的诺奖得主，如此评价这项成果也嫌偏颇。

较之近年来屡屡公布的相关进展，文特尔的人造细胞除基因片段显著增加外，更实现了分裂，而细胞的分裂和进化才是生命体最重要的功能和特征。

所以，我们与其讨论它是不是新的突破，还不如心平气和地关注其目标指向，特别是这个曾狂言“基因没有好坏”的人，最终究竟是想造出一千个爱因斯坦，还是一千个希特勒。

3 显微镜的由来1604年荷兰人詹森把两块磨好的透镜同轴间隔一定距离装在铜管子里，用它来看书本上的字，字被放得很大。

詹森因此成为显微镜的奠基人。

后来，伽利略通过两个玻璃透镜形成一个圆柱体工具，观察到了昆虫的眼睛，并绘制几何图，成为了第一个通过原始显微镜记录生物的学者。

1665年，英国人Robert Hooke用自制显微镜观察软木栓，观察到了“小室”结构，并定名为cell再后来，1674到1683年之间，荷兰人安东尼·范·列文虎克用自制的所谓高倍显微镜观察了许多物体，并发现了细菌，此后两个世纪没有人看到比细菌更小的细胞。

随着技术的进一步发展，现在又出现了荧光显微镜、电子显微镜等放大倍数更高的显微镜。

4 相差显微镜，荧光显微镜, 透射电子显微镜和扫描电子显微镜的特点和用途。

相差显微镜：利用光的衍射和干涉原理，将光透过样品后产生的光程差转换成振幅差，从而产生明暗差异，立体感强，不需染色。

可进行活体观察、连续观察。

荧光显微镜：染色简便，彩色图像，明亮，效果好，灵敏度高。

用途：通过荧光素的标记观察物体构造；用抗体荧光标记后，通过荧光的有无、色调比较进行物质判别；通过发荧光量的测定对物质定性、定量分析。

透射电子显微镜：用波长很短的电子束作为光源，穿透样品，需制作超薄切片，用来观察样品内部结构，二维。

扫描电子显微镜：收集电子束激发样品产生的二次电子，用来观察样品表面结构，立体感强，三维。

5 什么时候需要使用显微镜的相差，荧光功能。

6 如何理解细胞形态由其功能所决定？细胞的形态结构与功能的相关性与一致性是很多细胞的共同特点,在分化程度较高的细胞更为明显.这是生物漫长进化过程的产物,从进化观点看有一定的合理性.如红细胞，细胞体积小,呈扁圆形,非常有利于在血管内快速运行,体积小则相对表面积大,有利于提高气体交换效率.细胞内主要是血红蛋白,有助于结合更多的氧气与二氧化碳.因此,红细胞的形态和结构装置与其运输的功能的关系是非常合理的.7 GFP技术及其特点。

GFP最早是从水母中分离出来的, 当其受到紫外或蓝光激发时，可以发出绿色荧光。

而其基因可在异源组织中表达并产生荧光。

由于其良好的物理特性及荧光特性而成为良好的报告基因和荧光标记分子,并在探索生命现象过程中得到了非常广泛的应用。

特点：(1) 可用在活细胞中直接观察蛋白质在细胞器中的运动.(2) 既具有敏感的标记检测率，又没有放射性的危害.(3) 易于构建载体且对活细胞无毒害，对目的基因的功能也没有影响.(4) 转化后细胞可以继续传代。

8 报告基因的使用技巧。

报告基因的选择取决于特定的研究目的以及分析的可行性（敏感性、可信度、可检测性以及动力学性质），报告基因的稳定性将决定其是否适合转录的动态研究、高通量研究以及在转基因实验中全或无式的基因表达研究。

例如，萤火虫Luc和海洋腔肠Luc由于对蛋白质水解的敏感性，其半衰期较氯霉素乙酰转移酶（CAT）要短,这样的特性使其更适合转染效率和动力学研究；再如，野生型GFP 与Luc相比，荧光信号的线性范围较窄，这就不大适合转录的定量研究；GFP 由于缺乏酶促扩大效应，因此其灵敏性较Luc要差，这就使其局限于那些只有高表达的基因研究，而且GFP在细胞内的累积使其更不适合高通量的筛选。

目前已使用双报告基因系统，例如：萤火虫和海洋腔肠双LUC9 细胞组分的几种分离技术。

用超速离心技术分离细胞器与生物大分子及其复合物:用低渗匀浆,超声破碎或研磨等方法可使细胞膜破碎,形成细胞核,线粒体,叶绿体,内质网,高尔基体,溶酶体等细胞器和细胞组分的混合匀浆,再通过差速离心和密度梯度离心将各种亚细胞组分和各种颗粒分开.10 细胞类型的分离技术及其特点。

差异沉降differential sedimentation:根据大小、密度差异附着differential adhesion:免疫吸附，磁性分离抗体选择antibody selection流式细胞分离flow cytometry11 Fiber FISH技术。

Fiber FISH是近几年发展起来的一项高分辨率和高灵敏度的荧光原位杂交技术,已被广泛应用于人类及动植物基因组的研究。

荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization)将DNA用特殊修饰的核苷酸分子标记(如biotin-dUTP或dig-oxigenin-Dutp)作为探针分子特异结合来检测该DNA染色体上的位置。

具有不需放射性同位素、实验周期短和检测灵敏度高的优点。

已被广泛应用于动植物基因组结构的研究,染色体结构的分析和DNA谱的构建等。

12 细胞周期。

由一个细胞增殖分裂为两个细胞的过程.在这个过程中染色体复制一次,随后随着细胞分裂平均分配到两个子细胞中,这个周期分为G1;S;G2;M四个时期,G1,S,G2为细胞间期,M为分裂期.13 细胞周期的关键调控点。

G1--→S(存在于G1之内,控制细胞进行复制的关键点)G2--→M(存在于G2之内,控制细胞进行分裂关键点)14 G0期细胞及其生物学意义。

位于细胞周期中G1后段,而且存在G1--→G0的转化过程,G0细胞处于静止状态,不进行分裂.在G1--→S关键点,细胞要做出是否进入下一次分裂或处于静止状态G0的决策.如,部分肝脏细胞,一定时期乳腺细胞.另外有一部分细胞属于终端分化细胞,如神经细胞,肌肉细胞等总之,分裂细胞+终端分化细胞+G0细胞=机体和组织细胞活动多样性.15 细胞系及其特性。

在体外培养条件下,可以永久进行繁殖的细胞,这种细胞可以无限传代,称为细胞系.特点:1>可以提供大量的同一类型的细胞,有利于研究工作2>可以大量分离细胞产物,用于企业化生产3>可以长期并存于液氮之中,需要时可以解冻复苏4>细胞系细胞多数为非整倍染色体,个别为二倍体,如WI-38.16 细胞操作的无菌技术的原则，含义及其内容。

原则:保证细胞培养皿,培养瓶内部,吸管包装层内部,以及培养基的无菌状态,这一点十分重要,它包括:1>工作环境以及表面处理2>实验者的操作技术3>细胞培养所用的玻璃以及塑料制品的处理4>培养基的无菌处理消毒与灭菌1>超净工作台:用75%乙醇擦洗,紫外灯灭菌30-50分钟2>无菌间:用30W的紫外灯30-50分钟3>玻璃器皿:新器皿用5%HCl泡12h用过的器皿用酸剂浸泡,煮沸,清洗,浸泡,清洗,晾干,灭菌4>其它器皿:橡胶,塑料器皿用专用洗涤剂清洗以后,2%NaOH浸泡过夜,5%HCl泡30分钟,清洗晾干,灭菌.金属器皿洗净后,用酒精棉球擦,灭菌.灭菌方法:1>物理方法:干热,湿热,过滤2>化学方法:消毒剂,抗菌素17 细胞冻存与复苏技术要点。