实验一_鸡新城疫血凝(HA)和血凝抑制(HI)抗体水平测定法讲解
血凝(HA)和血凝抑制试验(HI)
1、注意抗原相的差异
2、注意消除非特异性因素
禽类血清中，尤其是水禽血清，往往含有非 特异性血凝抑制因子，在做禽流感血凝抑制 试验时会出现2-3孔有凝集现象。 因此，在利用血凝抑制试验进行血清抗体测 定之前，有必要对血清中非特异性因子进行 排除。
常用消除方法（FAO推荐）
1、鸡的红细胞吸附法 1.1试剂 鸡的红细胞：要充分洗涤； PBS： pH7.5，4℃保存； 阳性对照血清； 阴性对照血清。 1.2方法 加入25µL鸡的红细胞到100µL血清中； 4℃，用微量振荡器振荡20-30min； 加入100µL灭菌PBS (用RDE处理的血清除外)； 4000转离心1min； 取出上清，进行HI试验； 用阳性对照血清和阴性对照血清验证处理的彻底性 用于消除除鸡以外的其它禽类的血清非特异性反应。
3、 热灭活法
3.1鸡血清 取100µL血清样品放入一灭菌离心管中； 各取100µL阳性血清和阴性血清加入到另2个灭菌离心管 中； 56℃水浴30min。 3.2 其它禽类血清 血清用鸡的红细胞处理后，分别取100µL样品、阳性血 清、阴性血清放入灭菌离心管中，56℃水浴30min。 热灭活是一种排除非特异性因子的有效方法，但对特异 性抗体破坏较大。
三、实验步骤
（以禽流感为例，参照禽流感防治技术规范）
1 阿氏（Alsevers）液配制 称量葡萄糖2.05g、柠檬酸钠0.8g、柠檬酸 0.055g、氯化钠0.42g，加蒸馏水至100mL， 散热溶解后调pH值至6.1，69kPa 15min高压 灭菌，4℃保存备用。
2 1%鸡红细胞液的制备
2.2原理 特异性抗体与相应病毒结合，使病毒失去凝 集红细胞的能力，从而抑制血凝现象。
鸡新城疫实验—HA与HI实验
某些病毒（如新城疫病毒，减蛋综合症）能凝集某些动物的红细胞，这种现象 虽非抗原抗体，但利用这一现象可检查样品中是否有病毒存在，测病毒滴度， 病毒红细胞血凝由于能被相应抗体所抑制，因此可以通过病毒的血凝抑制试验 测定抗体的效价。
实验试剂与器材
1、实验器材 小烧杯、电子天平、离心机、离心管、采血针、玻璃棒、微量移液器（50µl）、枪
实验步骤
孔口项 目
1
2
3
4
567
8
稀释液 50 50 50 50 50 50 50 50
病毒液
50
→ 50
→ 50
→ 50
→ 50
→→ 50 50
→ 50
9 10 11 12
50 50 不加 50
→ 50
→50 ，弃 50
50
不加
病毒液 稀释倍
数
1： 1： 1： 24 8
ห้องสมุดไป่ตู้
1： 1： 1： 1： 1： 16 32 64 128 256
实验试剂与器材
3*3 抗体制备 （1）、从鸡翅取血，放入离心管中（2000rmp , 3~5min） （2）、吸取上清，即为抗体（黄色清亮） 3*4 抗原制备 （1）、取新城疫病毒干粉，加生理盐水（灭菌过） （2）、溶解，即为抗原
实验步骤
1、HA实验步骤 （1）、前10孔与第12孔，每孔加50µl生理盐水 （2）、第11孔加50µl病毒液，第12孔不加，前10空依次倍比 （3）、每孔加入50µl红细胞 （4）、放37 ℃恒温箱20min，观察结果
……
1
10
11
12
每孔50µl生理盐水
50µl病 毒液
50µl生 理盐水
鸡新城疫血凝和血凝抑制试验作业指导书
鸡新城疫血凝（HA）和血凝抑制（HI）试验作业指导书1、血凝试验1.1 材料与试剂1.1.1 器材：普通天平、分析天平、普通离心机、微型振荡器、煮沸消毒器、冰箱、高压灭菌器、微量移液器、滴头、96孔V 形血凝反应板。
1.1.2 pH7.2磷酸盐缓冲液（PBS)配制方法参见附录A。
1.1.3 1%鸡红细胞悬液配制方法参见附录B。
1.1.4标准新城疫病毒抗原、购入的标准新城疫病毒应检测其血凝效价并进行无菌检验，以检查与所标HA效价是否相符。
若不符，应重复检测并到相关实验室验证。
2、血凝试验操作程序2.1 血凝试验操作程序如下：2.1.1 取96孔V形微量反应板，用微量移液器在1孔-12孔每孔加0.025mLPBS；2.1.2 吸取0.25mL病毒悬液加入第1孔中，吹打3次-5次充分混匀；2.1.3 从第1孔中吸取0..25mL混匀后的病毒液加到第2孔，混匀后吸取0.025mL加入到第3孔，依次进行系列倍比稀释到第11孔，最后从第11孔吸取0..25mL弃之，设第12孔为PBS对照；2.1.4 每孔再加入0.25mLPBS。
2.1.5 每孔均加入0.25mL体积分数为1%鸡红细胞悬液；2.1.6 振荡混匀反应混合液，室温20℃-25℃下静置40min 后观察结果，若环境温度太高，放4℃静置60min,PBS对照孔的红细胞成明显的纽扣状沉到孔底时判定结果。
2.2 结果判定2.2.1 在PBS对照孔出现正确结果的情况下，将反应板倾斜，观察红细胞是否完全凝聚。
以完全血凝的病毒最大稀释度为该抗原的血凝滴度。
完全凝集的病毒的最高稀释倍数为1一个血凝单位（HAU）。
2.2.2 如果没有血凝活性或血凝效价很低，则采用SPF鸡胚用初代分离尿囊液继续传两代，若仍为阴性，则认为新城疫病毒分离阴性。
2.2.3 对于血凝试验呈阳性的样品应采用新城疫标准阳性血清进一步进行血凝抑制试验。
3、血凝抑制试验3.1 材料与试剂3.1.1 器材同1.1.1.3.1.2 试剂同1.1.2.3.1.3 标准抗NDV血凝抑制抗体（血清）。
血凝及血凝抑制实验
1、在稀释移取混匀的操作过程中动作要慢，以免损坏红细胞（表现为分离是上清液为淡红色，正常情况第一次分离后上清液为淡黄色，之后直至清亮为清洗干净）。 2、在吸取过程中一定要将中间的白细胞层吸取干净。
血凝(HA)与血凝抑制(HI)试验
一、实验目的 二、实验内容 三、实验原理 四、实验材料 五、实验方法与结果判定 六、注意事项 七、红细胞制备
一、实验目的
1、掌握血凝和血凝抑制试验的基本原理、操 作方法和结果判定方法 2、了解新城疫有关背景知识
二、实验内容
1、血凝试验(HA)检测新城疫抗原的效价 2、血凝抑制试验(HI)检测新城疫抗体（疫苗注射后的抗体检测）
三、实验原理
1、血凝试验（HA）原理：某些病毒或病毒的血凝素能选择性地使某种动物地红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的现象称为血凝（HA）,也称直接血凝反应。
病毒颗粒
红细胞
2、血凝抑制试验（HI）原理：当病毒的悬液中加入特异性抗体，且这种抗体的量足以抑制病毒颗粒或其血凝素时，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或血凝素直接接触。这时红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制（HI）反应，也称血凝抑制反应。
结果判定标准
1、＋＋＋＋：红细胞呈细沙样均匀铺于孔底，即100％凝集； 2、＋＋＋：红细胞均匀铺于孔底，当边缘不整齐而稍向孔底集中，即75％凝集； 3、 ＋＋ ：红细胞形成一个环状，四周有凝集块，即50％凝集； 4、 ＋ ：红细胞于孔底形成圆团，边缘不够光滑，四周稍有凝集块，即25％凝集； 5、－ ：红细胞于孔底形成圆团，边缘光滑整齐，即无凝集；
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
新城疫抗体测定技能
新城疫抗体测定（一）血凝试验（HA）：取96孔板，按以下步骤操作：1、第一排1-12孔各加生理盐水50ul，第二排1-12孔加生理盐水50ul为红细胞对照（20分）；2、吸50ul病毒液于第一排第1孔，混匀后取50ul至第2孔，依次稀释至第12孔，弃去50ul，各孔经倍比稀释后稀释度依次为2-1-2-12（25分）。
3、第一排1-12孔及第二排1-12孔各加1%鸡红细胞50ul，微型震荡器震荡2min混匀（25分）。
4、室温静置10-30分，观察结果（10分）。
5、结果判定：红细胞对照组红细胞完全沉降，以试验排中能使等量红细胞发生完全凝集的病毒最高稀释倍数，作为病毒的血凝价，即HI效价，用2n表示。
结果判定：以出现完全凝集的抗原最大稀释度为该抗原的血凝滴度（20分）。
注意:由于新城疫病毒含有神经氨酸酶，它能破坏红细胞表面的血凝素受体，使凝集的病毒从红细胞上解脱下来，所以要及时观察结果。
（二）血凝抑制试验（HI）：取一96孔板，按以下步骤操作：1、4个单位抗原的制备：按HA试验测出的病毒血凝价乘4即为4个单位血凝素的稀释度（10分）。
2、待检血清的稀释：第一、二、三排1-12孔各加生理盐水50ul，于第一排第1孔中加入50ul待检血清，反复吹吸3-5次混匀后，取50ul至第2孔混匀，吸取50ul至第3孔…,依次稀释至第12孔，弃去50ul，经倍比稀释，血清的稀释度为2-1-2-12（20分）。
3、第一、二排1-12孔各加4个单位血凝素50ul，微量震荡器震荡2min混匀（20分）；4、室温静置20min（5分）；5、第一、二、三排1-12孔各加1%鸡红细胞50ul，微量震荡器震荡2min混匀混匀（15分）。
6、室温静置10--30分，观察结果（10分）；结果判定：以完全抑制红细胞凝集的最大稀释度为该血清的血凝抑制（HI）滴度（20分）。
鸡群HI滴度的高低在一定程度上反映了免疫保护水平的高低。
鸡群HI滴度的高低在一定程度上反映了免疫保护水平的高低。
鸡新城疫血凝(HA)及血凝抑制(H1)试验
鸡新城疫血凝（HA）及血凝抑制(H1)试验（一）目的意义：1.掌握血凝试验（HA）与血凝抑制试验（HAI）的基本方法；2.了解HA与HI在新城疫病毒及其它病毒诊断和鉴定中的应用。
(二)基本原理：许多病毒表面具血凝素，具有凝集某些动物或人红细胞的特性，称为血凝现象，可用于鉴定病毒。
血凝现象可以被特异性抗体所抑制，称为血凝抑制现象，利用这种特性可进行血清学试验，称为血凝抑制试验。
（三）器材及试剂:待检病毒:鸡新城疫病毒鸡胚尿囊液；待检血清：抗鸡新城疫病病毒阳性血清；生理盐水、1%鸡红细胞、96孔V形微量血凝板、加样器等。
（四）实验步骤：一、血凝试验（HA）取96孔板，按以下步骤操作：1、第一排1-12孔各加生理盐水50ul，第二排1-12孔加生理盐水50ul 为红细胞对照；2、吸50ul病毒液于第一排第1孔，混匀后取50ul至第2孔，依次稀释至第12孔，弃去50ul，各孔经倍比稀释后稀释度依次为2-1~2-12 。
3、第一排1-12孔及第二排1-12孔各加1%鸡红细胞50ul，微型震荡器震荡2min混匀。
4、室温静置10-30分，观察结果（见下表）。
5、结果判定：红细胞对照组红细胞完全沉降，以试验排中能使等量红细胞发生完全凝集的病毒最高稀释倍数，作为病毒的血凝价，即HI 效价，用2n表示。
二、血凝抑制试验（HI）取一96孔板，按以下步骤操作：1、4个单位抗原的制备：按HA试验测出的病毒血凝价除以4即为4个单位血凝素的稀释度。
2、待检血清的稀释：第一、二、三排1-12孔各加生理盐水50ul，于第一排第1孔中加入50ul待检血清，反复吹吸3-5次混匀后，取50ul至第2孔混匀，吸取50ul至第3孔，依次稀释至第12孔，弃去50ul，经倍比稀释，血清的稀释倍数为21~212 。
3、第一、二排1-12孔各加4个单位血凝素50ul，微量震荡器震荡2min混匀；4、室温静置20min；5、第一、二、三排1-12孔各加1%鸡红细胞50ul，微量震荡器震荡2min混匀混匀。
血凝和血凝抑制实验[1]..
![血凝和血凝抑制实验[1]..](https://img.taocdn.com/s3/m/a03bb264fe4733687e21aa4a.png)
2019/2/22
血凝价的判定
以出现＋＋（50％凝集）的抗原最高稀释 倍数为该抗原的血凝价（1:128）。 25ul 1:256稀释的病毒抗原为该抗原的一 个血凝单位。
稀释 倍数 结果 2× 4× 8× 16 × 32 × 64× 128 × ＋ ＋ ＋ ＋＋ 256 × ＋ 512 × — 1024 × — 2048 × — 细胞 对照 —
• 重者出现精神沉郁，呼吸困难，黄绿色稀粪， 喉头、气管粘膜充血、出血，个别病例出现 消化道病变。
2019/2/22
5、诊 断
1 、血凝抑制试验（ HI ）：监测鸡群中的 HI 抗体，评价疫苗的免疫效果及鸡体内的 抗体水平。 2、分离病毒： 鉴别弱毒及野毒。 （1）分离病毒：强毒：24～72小时鸡胚死亡， 弱毒一般不死。
2019/2/22
有的病鸡表现眼结膜炎
2019/2/22
（ 3 ）亚急性型（非典型 ND ，以侵害呼吸道 为主）也称肺脑炎型： 其主要的特点：是症状及病变不典型。
症状：多见 4～35日龄鸡，25日龄前后最常发 病。 • 呼吸困难，精神沉郁，
• 继而较早地出现神经症状，此时出现歪头， 扭颈，角弓反张，倒地不能起立。
孔 号 1 2 × 生 理 盐 水 抗 原 红 细 胞 25 2 4 × 25 3 8 × 25 4 16 × 25 5 32 × 25 6 64 × 25 7 128 × 25 8 256 × 25 9 512 × 25 10 1024 × 25 11 2048 × 25 12 红细 胞对 照 25
2019/2/22
四、实验材料
1、血凝板（2人/块）； 2、新城疫标准抗原、阳性血清； 3、被检血清（1份）； 4、1％红细胞悬液； 5、稀释液； 6、移液器（10～100ul, 2人/把）； 7、枪头； 8、3.8%枸橼酸钠溶液、阿氏液； 9、5ml注射器一支/人。
鸡新城疫的实验室诊断及免疫效果的评价
一、鸡新城疫的血凝试验(HA)
（二）加样
1. 在96孔微量反应板上进行，自左至右各孔加50L 生理盐水。
2. 于左侧第1孔加50L病毒液，混合均匀后，吸 50L至第2孔，依次倍比稀释至第11孔，吸弃50L； 第12孔为红细胞对照。
3. 自右至左依次向各孔加入0.5% 鸡红细胞悬液 50L，在振荡器上振荡，室温下静置后观察结果。
血凝试验（HA）和血凝抑制试验 (HI)
HA和HI的原理
⒈HA试验：许多病毒表面有血凝素，能与各种动物的红细胞表面受 体结 合，而出现红细胞凝集现象，简称为病毒的血凝现象 。
2.HI试验：病毒的红细胞凝集现象，可以被特异性免疫血清所抑制， 称HI试验。
一、鸡新城疫的血凝试验(HA)
• 【材料】
• 新城疫病毒鸡胚接种尿囊液 1份
二、鸡新城疫的血凝抑制试验(HI)
• 【结果判定】 • 以100％抑制凝集（完全不凝集）的被检血清最大稀释
度为该血清的血凝抑制效价，即HI效价。凡被已知新 城疫阳性血清抑制血凝者，该病毒为新城疫病毒。 • 从表4-2看出，该血清的HI效价为1:64，用以2为底的 负对数(-log2)表示，即6log2。
一、鸡新城疫的血凝试验(HA)
• 【病毒血凝试验的操作方法（单位：L）】
孔号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
病毒稀释 度
1:2
1:4
1:8
1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 1:1024 1:2048 对照
50 50 50 50
50 50 50
50
50
50
实验一_鸡新城疫血凝(HA)和血凝抑制(HI)抗体水平测定法讲解
鸡新城疫血凝（HA）和血凝抑制（HI）抗体水平测定法1．本次实验的目的和要求掌握鸡新城疫血凝（HA）和血凝抑制（HI）抗体水平测定法，以便检查疫苗使用效果和制定合理免疫程序。
2．实验内容或原理某些病毒(如新城疫病毒，禽流感病毒等)能够与动物的红细胞发生凝集，此即为红细胞凝集现象(HA)。
这种红细胞凝集现象可于病毒悬液中加入特异免疫血清所抑制，即为红细胞凝集抑制试验(HI)。
3．需用的仪器或试剂等动物健康成鸡2-5只，被检鸡15-25只。
器材高压灭菌器、滤纸、试管、试管架、离心机、离心管、三棱针、内径2mm聚乙烯塑料管100cm、酒精灯、石蜡、96孔V型微量凝集试验板、0.025mm微量吸液器、微型振荡器、微量移液器、脱脂棉等。
药剂（1）浓缩抗原；（2）生理盐水或磷酸缓冲盐水（PBS）；（3）Alsever细胞保存液；（4）红细胞悬液；（5）待检血清4．实验步骤(1)发现与鉴定病毒：鸡新城疫和禽流感病毒分离后，这些病毒能凝集鸡的红细胞，又能被特异性的已知免疫血清抑制其凝集反应，即可鉴定此病毒。
(2)诊断病毒性疾病：如取同一发病的动物早期和恢复期血清进行红细胞凝集抑制实验，如抗体效价有4倍以上升高，即有诊断意义。
（3）免疫机体抗体效价的测定：3.鸡新城疫（ND）的HA和HI（1）试验准备①抗原：一般以鸡新城疫Ⅱ系或LaUra系冻干苗作为已知抗原，进行试验。
② 0.7％细胞悬浮液：由鸡翅静脉或心脏采血，放入含有抗凝剂的灭菌试管(按每毫升血加入3.8％灭菌柠檬酸钠0.2毫升做抗凝剂)内，迅速混匀。
如当时不用，可直接采血放入红细胞保存液内(保存液2份，血液1份)于4℃冰箱内可保存两周。
红细胞悬液的配制：将血液注入离心管中，经3000转／分钟，离心5-10分钟，用吸管吸去上清液和红细胞上层的白细胞薄膜，将沉淀的红细胞加稀释液(生理盐水)洗涤。
再用离心机3000转／分钟离心5-10分钟，弃上清，再加稀释液洗涤，如此反复洗涤三次，将最后一次离心后的红细胞泥，按0.7％的稀释度加入稀释液(0.7毫升红细胞泥加99.3毫升稀释液)。
血凝（HA）-血凝抑制（HI）试验操作要点
摘要院兽医实验室检测禽流感和鸡新城疫抗体采用血凝渊匀粤冤原血凝抑制渊匀陨冤试验遥 该试验有些因素会影
响试验结果袁是试验的关键环节袁如配制 员豫鸡红细胞时其浓度的高低会影响抗体滴度的高低曰源 单位抗
原的配制需要回滴正确曰试验的反应时间和温度也要符合要求遥 只有掌握好试验的关键点袁才能得出准
确无误的试验结果遥 对该试验的操作要点及注意事项进行了介绍遥
员 试剂配制
. Al员l援员 R称阿i量g氏h葡液ts萄配糖制Re圆s援园e缘r早v尧e柠d.檬酸钠 园援愿园 早袁 柠檬酸
园援园缘缘 早尧氯化钠 园援源圆 早袁加蒸馏水至 员园园 皂蕴袁加热溶 解后调 责匀 至 远援员袁高压灭菌袁源 益保存备用遥
员援圆 员豫鸡红细胞液的制备 因为每只鸡的血红细胞的结合性不一样袁 所以
要取 猿耀源 只公鸡血袁要求是 杂孕云 鸡袁每 猿 个月换一次 鸡遥 采血与等量阿氏液混合均匀袁放入离心管中遥 鸡 红细胞的洗涤院将离心管中的血液经 圆 缘园园 则 辕 皂蚤灶 离 心 缘 皂蚤灶袁用吸管移去上清液及沉淀红细胞上层的白 细胞薄膜袁再重复 圆 次以上过程后袁用生理盐水配成 员豫红细胞悬液袁源 益保存备用袁不超过 缘 凿遥 离心的时 间尧转速不一样袁红血球压积不一样遥 红血球浓度低袁 检测出的抗体效价就低袁反应时间变长遥 红血球浓度 高袁检测出的抗体效价就高袁会偏离正常值遥 转速不
灾燥造援 37 No.12 December 圆园16
鸡大肠杆菌病的诊治
刘家龙
渊江苏省连云港市赣榆区塔山镇农业技术服务中心袁江苏省 连云港 圆圆圆员圆猿冤
摘要院对鸡大肠杆菌病的流行病学尧预防及治疗措施进行了介绍袁供相关人员参考遥
关键词院鸡大肠杆菌病曰流行病学曰预防曰治疗
中图分类号院杂愿缘愿援猿员
实验一鸡新城疫血凝(HA)和血凝抑制(HI)抗体水平测定法讲解
鸡新城疫血凝（）和血凝抑制（）抗体水平测定法1．本次实验的目的和要求掌握鸡新城疫血凝（）和血凝抑制（）抗体水平测定法，以便检查疫苗使用效果和制定合理免疫程序。
2．实验内容或原理某些病毒(如新城疫病毒，禽流感病毒等)能够与动物的红细胞发生凝集，此即为红细胞凝集现象()。
这种红细胞凝集现象可于病毒悬液中加入特异免疫血清所抑制，即为红细胞凝集抑制试验()。
3．需用的仪器或试剂等动物健康成鸡2-5只，被检鸡15-25只。
器材高压灭菌器、滤纸、试管、试管架、离心机、离心管、三棱针、内径2聚乙烯塑料管100、酒精灯、石蜡、96孔V型微量凝集试验板、0.025微量吸液器、微型振荡器、微量移液器、脱脂棉等。
药剂（1）浓缩抗原；（2）生理盐水或磷酸缓冲盐水（）；（3）细胞保存液；（4）红细胞悬液；（5）待检血清4．实验步骤(1)发现与鉴定病毒：鸡新城疫和禽流感病毒分离后，这些病毒能凝集鸡的红细胞，又能被特异性的已知免疫血清抑制其凝集反应，即可鉴定此病毒。
(2)诊断病毒性疾病：如取同一发病的动物早期和恢复期血清进行红细胞凝集抑制实验，如抗体效价有4倍以上升高，即有诊断意义。
（3）免疫机体抗体效价的测定：3.鸡新城疫（）的和（1）试验准备①抗原：一般以鸡新城疫Ⅱ系或系冻干苗作为已知抗原，进行试验。
② 0.7％细胞悬浮液：由鸡翅静脉或心脏采血，放入含有抗凝剂的灭菌试管(按每毫升血加入3.8％灭菌柠檬酸钠0.2毫升做抗凝剂)内，迅速混匀。
如当时不用，可直接采血放入红细胞保存液内(保存液2份，血液1份)于4℃冰箱内可保存两周。
红细胞悬液的配制：将血液注入离心管中，经3000转／分钟，离心5-10分钟，用吸管吸去上清液和红细胞上层的白细胞薄膜，将沉淀的红细胞加稀释液(生理盐水)洗涤。
再用离心机3000转／分钟离心5-10分钟，弃上清，再加稀释液洗涤，如此反复洗涤三次，将最后一次离心后的红细胞泥，按0.7％的稀释度加入稀释液(0.7毫升红细胞泥加99.3毫升稀释液)。
鸡新城疫血凝和血凝抑制实验PPT课件
• 【病毒血凝抑制试验的操作方法（单位：L） 】
孔号 滴度lg2 材料
8单位病毒 4单位病毒 被检鸡血清
0.6%红细胞
结果观察
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
病
1
2 3 4 56 78
9
10
毒对 照
对照
50 50 50 50 50 50 50 50
50 50 50 50 50 50 50 50
50 50 50 50 50 50 50 50 震荡混匀，室温30-40min - - - - - - + ++
50 50 50 50
50 50
+++
++ ++
50
生理盐水 50
弃50 50 50
++ ++ ++ ++
以100％抑制凝集（完全不凝集）的被检血清最大稀释度为该血清的血凝抑制效价，即HI效价14。
10
二、鸡新城疫的血凝抑制试验(HI)
• 【材料】 除血球凝集试验所用材料外，血清
取鸡免疫血清。
11
鸡群卵黄抗体的制备
1.取鸡蛋卵黄20ml，加入等量生理盐水， 振荡，摇匀。
2.加入等量氯仿40ml，振荡30分钟。 3.取振荡的卵黄液3000～4000rpm30分
钟。 4.取上清液作为抗体检测材料
2019/10/25
9
一、鸡新城疫的血凝试验(HA)
• 【 结果判定 】
• 置于振荡器上振荡1分钟，静置后30 min开始观察结果，待对照 孔红细胞已沉淀即可进行结果观察。红细胞全部凝集，沉于孔底， 平铺呈网状，即为100% 凝集（++++），不凝集者（-）红细胞 沉于孔底呈点状。
1---血凝和血凝抑制实验
血凝效价测定
1 2 ×
生 理 盐 水 抗 原 生 理 盐 水 红 细 胞 结 果
2 4 × 25
3 8 × 25
4 16 × 25
5 32 × 25
6 64 × 25
7 128 × 25
8 256 × 25
9 512 × 25
10 1024 × 25
11 2048 × 25
12 红细 胞对 照 25
血凝(HA)与血凝抑制(HI)试验
一、实验目的 二、实验内容 三、实验原理 四、实验材料 五、实验方法与结果判定 六、注意事项 七、红细胞制备
一、实验目的
1、掌握血凝和血凝抑制试验的基本原理、操 作方法和结果判定方法 2、了解新城疫有关背景知识
二、实验内容
1、血凝试验(HA)检测新城疫抗原的效价 2、血凝抑制试验(HI)检测新城疫抗体（疫 苗注射后的抗体检测）
三、实验原理
1、血凝试验（HA）原理：某些病毒或病毒的血凝 素能选择性地使某种动物地红细胞发生凝集，这种 凝集红细胞的现象称为血凝（HA）,也称直接血凝 反应。
病 毒 颗 粒
红 细 胞
2、血凝抑制试验（HI）原理：当病毒的悬液中加入 特异性抗体，且这种抗体的量足以抑制病毒颗粒或其 血凝素时，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或 血凝素直接接触。这时红细胞的凝集现象就被抑制， 称为红细胞凝集抑制（HI）反应，也称血凝抑制反应。
1、＋＋＋＋：红细胞呈细沙样均匀铺于孔底，即100 ％凝集； 2、＋＋＋：红细胞均匀铺于孔底，当边缘不整齐而 稍向孔底集中，即75％凝集； 3、 ＋＋ ：红细胞形成一个环状，四周有凝集块，即 50％凝集； 4、 ＋ ：红细胞于孔底形成圆团，边缘不够光滑，四 周稍有凝集块，即25％凝集； 5、－ ：红细胞于孔底形成圆团，边缘光滑整齐，即 无凝集；
1---血凝和血凝抑制实验
注意事项
• 1、在稀释移取混匀的操作过程中动作要慢， 以免损坏红细胞（表现为分离是上清液为淡 红色，正常情况第一次分离后上清液为淡黄 色，之后直至清亮为清洗干净）。 • • 2、在吸取过程中一定要将中间的白细胞层吸 取干净。
1、＋＋＋＋：红细胞呈细沙样均匀铺于孔底，即100 ％凝集； 2、＋＋＋：红细胞均匀铺于孔底，当边缘不整齐而 稍向孔底集中，即75％凝集； 3、 ＋＋ ：红细胞形成一个环状，四周有凝集块，即 50％凝集； 4、 ＋ ：红细胞于孔底形成圆团，边缘不够光滑，四 周稍有凝集块，即25％凝集； 5、－ ：红细胞于孔底形成圆团，边缘光滑整齐，即 无凝集；
血凝(HA)与血凝抑制(HI)试验
一、实验目的 二、实验内容 三、实验原理 四、实验材料 五、实验方法与结果判定 六、注意事项 七、红细胞制备
一、实验目的
1、掌握血凝和血凝抑制试验的基本原理、操 作方法和结果判定方法 2、了解新城疫有关背景知识
二、实验内容
1、血凝试验(HA)检测新城疫抗原的效价 2、血凝抑制试验(HI)检测新城疫抗体（疫 苗注射后的抗体检测）
血凝抑制效价测定
1 2 ×
生理 盐水 血清 4单 位抗 原 红细 胞 结果
2 4 × 25 25 25 25
－
3 8 × 25 25 25 25
＋
4 16 × 25 25 25 25
＋＋
5 32 × 25 25 25 25
＋＋ ＋
6 64 × 25 25 25 25
＋＋ ＋
7 128 × 25 25 25 25
血凝价的判定
以出现＋＋（50％凝集）的抗原最高稀释 倍数为该抗原的血凝价（1:128）？？？。 25ul 1:256稀释的病毒抗原为该抗原的一 个血凝单位。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
如果某鸡群的 10 份样品中， HI 抗体效价为 8 的有 3 份样品，为 7 的有 5 份样品，为 6 的有 2 份样品，它们的平均值为：
平均水平在 4(log2) ，说明该鸡群为免疫鸡群。若在检样中 HI 抗体效价的最高值与最低 值相差太大时， 则不能用上法计算平均水平， 应根据临界水平以下的样品数在全部样品中所 占的百分比决定免疫与否。 ④ 大型养鸡场， 每次进行抽测时，抽样率一般不低于 0.1％～ 0.5％，小型鸡群，抽样率应有 所增加，一般认为理想的抽样率应为 2％。 ⑤ 鸡群接种新城疫疫苗后，经 2～ 3 周 测血清中的 HI 抗体效价，若提高 2 个滴度以上，表 示鸡的免疫应答良好，疫苗接种成功；若 HI 抗体效价无明显提高，表示免疫失败。 附注： ①采用 HA 试验对各生物药厂生产的新城疫疫苗产品有质量检测作用。 ②采用 HI 试验对各厂家生产高免血清及卵黄抗体有质量检测作用。
一次离心后的红细胞泥， 按 0.7％的稀释度加入稀释液 (0.7 毫升红细胞泥加 99.3 毫升稀释液 )。
③ 被检血清：将被检鸡群编号登记，用消毒过的干燥注射器采血，注入洁净干燥试管内
(微
量法可用孔径 2-3 毫米塑料管由翅静脉采血 )，在室温中静置或离心，待血清析出后使用。
每只鸡应更换一个注射器，严禁交叉使用。
鸡新城疫血凝（ HA）和血凝抑制（ HI）抗体水平测定法
1．本次实验的目的和要求
掌握鸡新城疫血凝（ HA ）和血凝抑制（ HI ）抗体水平测定法，以便检查疫苗使用效果
和制定合理免疫程序。
2．实验内容或原理
某些病毒 (如新城疫病毒，禽流感病毒等 ) 能够与动物的红细胞发生凝集，此即为红细胞 凝集现象 (HA) 。这种红细胞凝集现象可于病毒悬液中加入特异免疫血清所抑制，即为红细
抗原液为 0.05 毫升内须含 4 个凝集单位，则应将原病毒液作成 64／4=16 倍的稀释液。
孔号： 滴度：
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11 12
1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:517 1:1024 1:2048 对照
稀释液
25 25 25
25 25 25 25
器材：测瞳尺、磁反应板、磁蒸发皿、乳钵、分液漏斗、分液漏斗架、离心机、培养
皿、玻璃容器、量筒、棕色玻璃、玻棒、微量吸管、
25ml 滴管、注射器、针头、听诊器、
体温计、定性滤纸、新华滤纸、试纸、纱布、脱脂棉、剪刀、解剖器械、载玻片、皮筯等。
药物试剂：氯仿、氯化乙酰胆碱、溴麝香草酚蓝、无水乙醇、干燥马血消化、饱和溴
理盐水溶液。必要时重复使用。
1. 阿托品（ Atropinum ）抗胆碱药。
2. 氯磷定（ Pyraloximi Methy Chloriaum ，PAM-CL或 2-PAMCL）为胆碱酯酶复活剂。
3. 解磷定（ Pyraloximi Methiodidum ， PAM）胆碱酯酶复活剂。
4. 双复磷（ Toxogoninum ，DMO-4 ）亦为胆碱酯酶复活剂。
能将 4 单位病毒物质凝集红细胞的作用完全抑制的血清最高稀释倍数，
称为该血清的红
细胞凝集抑制效价，用被检血清的稀释倍数或以
2 为底的对数 (log2) 表示。如上例，该血清
的红细胞凝集抑制效价为 1：64 或 HI 效价为 6(log2) 。第十一孔仅含稀释液和红细胞为不凝 集对照孔，第十二孔含稀释液，病毒液和红细胞为凝集对照孔。 结果分析如下：
25
25 弃去
25 25 25
25 25 25 25
25
25
25
50
25
25 25 25
25 25 25 25
25
25
25 弃去
25 25 25
25 25 25 25
25
25
25
25
作用时间
振荡 1-2min ，静置 20 min
与温度
红细胞悬液
25 25 25
25 25 25 25
25
25
25
25
胞凝集抑制试验 (HI) 。
3．需用的仪器或试剂等
动物 健康成鸡 2-5 只，被检鸡 15-25 只。
器材 高压灭菌器、滤纸、试管、试管架、离心机、离心管、三棱针、内径
2mm 聚乙
烯塑料管 100cm、酒精灯、石蜡、 96 孔 V 型微量凝集试验板、 0.025mm 微量吸液器、微型
振荡器、微量移液器、脱脂棉等。
25
25
25
25
25
抗原 (病毒 ) 25 25 25
25 25 25 25
25
25
25
25
红细胞悬液 25 25 25
25 25 25 25
25
25
25
25
25
作用时间与温度
轻轻振荡 1-2min
静置 30-60min
结 果 +++ +++ +++ +++ +++ +++ ++ ﹣
﹣﹣
﹣
﹣
注意： +++ 为完全凝集 ++为部分凝集
水、 0.4mol/L 氢氧化钠液，二氯甲烷、酒石酸、苯、三氯醋酸、无水硫酸钠、弗罗里矽士、
丙硐、石油醚、蒸馏水、注射用水、精制敌百虫、 0.5%硫酸阿托品、氯磷定、解．实验步骤
一、诊断要点
（一）流行病学调查
（二）生前症状：主要为胆碱能神经受过量乙酰胆碱的作用所引起的过度兴奋现象。
25
作用时间 与温度 结果 1
振荡 1-2min ，静置 30-60 min — — — — — — ++
+++ +++ +++
— +++
结果 2
— —— —— — —
—
— ++ +
— +++
结果观察： 将反应板倾斜成 45℃角，沉于管底的红细胞沿着倾斜面向下呈线状流动者为沉
淀，表明红细胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的红细胞铺平孔底，凝成均匀薄层，倾 斜后红细胞不流动，说明红细胞被病毒所凝集。
（3）免疫机体抗体效价的测定：
3.鸡新城疫（ ND ）的 HA 和 HI （1）试验准备
① 抗原：一般以鸡新城疫Ⅱ系或 LaUra 系冻干苗作为已知抗原，进行试验。
② 0.7％细胞悬浮液：由鸡翅静脉或心脏采血，放入含有抗凝剂的灭菌试管
(按每毫升血加
入 3.8％灭菌柠檬酸钠 0.2 毫升做抗凝剂 )内，迅速混匀。如当时不用，可直接采血放入红细
2.氯磷定（ Pyraloximi Methyl-Chloriaum ， PAM-CL 或 2-PAMCL ）为胆碱酯酶复活剂。 原理：能与磷酰化胆碱酯酶中的有机磷结合，使胆碱酯酶释放并恢复其水解乙酰胆碱 的活性；还能直接与有机磷结合为无毒物质排出体外。
3．需用的仪器或试剂等
动物：有机磷中毒病例，或用试验动物（猪或兔）做人工病例复制。
胞保存液内 (保存液 2 份，血液 1 份 )于 4℃冰箱内可保存两周。
红细胞悬液的配制：将血液注入离心管中，经
3000 转／分钟，离心 5-10 分钟，用吸管
吸去上清液和红细胞上层的白细胞薄膜，将沉淀的红细胞加稀释液
(生理盐水 )洗涤。再用离
心机 3000 转／分钟离心 5-10 分钟，弃上清，再加稀释液洗涤，如此反复洗涤三次，将最后
出现以下三类症候群。
1. 草蕈碱样症状
2. 烟碱样症状
3. 中枢神经症状
（三）有机磷检验
1. 检品的采取和处理
2. 有机磷检验法
（ 1）酶化磷检验法
（ 2） B.T.B 全血试纸片法
（四）病理变化
二、治疗措施
具体方法为：①静脉注射阿托品 1/3 量的 2%溶液以迅速取得效果；②皮下注射阿托品
2/3 量的生理盐水溶液以取得持续效果； ③分点皮下注射氯磷定或其他胆碱酯酶复活剂的生
11
12
被检血清 稀释倍数
稀释液 被检血清
稀释液 标准阳性血清
4 单位病毒
红细胞 抗原 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 1:1024 对照 对照
25 25 25
25 25 25 25
25
25
25
50
25
25 25 25
25 25 25 25
25
2．实验内容或原理 根据典型症状和病变，以及在显微镜下检查组织涂片发现的两极染色的杆菌，可初步
诊断本病。但确诊应依靠病原分离鉴定，病原分离鉴定原理为革兰氏染色法。 3．需用的仪器或试剂等
动物：鸡、小白鼠 器材：外科镊子、外科剪、灭菌纱布、载玻片、糖发酵管等。 药品： 草酸铵结晶紫、 革兰氏碘、 碳酸复红、 瑞特氏染液、 美蓝染液、 棉拭子、 接种环、 葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、甘露醇、鼠李糖、戊醛糖、纤维二糖、绵子糖、菊糖、赤藓 糖、戊五醇、 M —肌醇、水杨苷。胰蛋白酶、 L- 胱胺酸、琼脂粉、酚红。
药剂（ 1）浓缩抗原； （ 2）生理盐水或磷酸缓冲盐水（ PBS ）；（ 3）Alsever 细胞保存液；
（4）红细胞悬液； （5）待检血清
4．实验步骤
(1) 发现与鉴定病毒：鸡新城疫和禽流感病毒分离后，这些病毒能凝集鸡的红细胞，又能被 特异性的已知免疫血清抑制其凝集反应，即可鉴定此病毒。
(2)诊断病毒性疾病：如取同一发病的动物早期和恢复期血清进行红细胞凝集抑制实验，如 抗体效价有 4 倍以上升高，即有诊断意义。