5-氮杂胞苷对小麦生长发育及 DNA 甲基化的影响

5-azaC处理水稻幼苗对基因组DNA 甲基化及水稻生长发育的影响表观遗传学：不需要基因序列改变而产生的可遗传的基因表达改变；主要包括DNA的甲基化修饰和组蛋白氨基酸的末端修饰。

表观遗传变异包括: X－染色体失活、转基因沉默、核仁显性和基因组印记等方面。

表观遗传变异的原因：是由于表观遗传密码的改变，如DNA 甲基化、组蛋白的公家修饰改变等。

DNA 甲基化：在DNA 复制后，经DNA甲基转移酶（DMT）催化，将S-腺苷酰-L-甲硫氨酸(SAM) 上的甲基基团连接到DNA 分子腺嘌呤碱基或胞嘧啶碱基上，进行DNA修饰的过程。

DNA 甲基化的方式胞嘧啶甲基化腺嘌呤甲基化DAM (DNA 腺嘌呤甲基转移酶)识别回文序列GATC, 在此位置两条链的腺嘌呤N-6位置上同时甲基化，同时SAM 转变为SAH(S-腺苷高半胱氨酸)在DMT(DNA甲基转移酶）的作用下，CpG（CNG,CCGG）位点胞嘧啶C5被甲基化DNA 甲基化作用DNA甲基化的生物学意义影响基因表达状态：通过该表基因调控区DNA 甲基化程度调控基因转录参与基因组防御：通过高度甲基化而使外源DNA（如转座子）处于沉默状态提高环境适应能力：在不改变基因型的情况下产生可遗传的新表型DNA 胞嘧啶甲基化的种类和形成从化头甲基化(de novo methylation)DNMT3a ，DNMT3b在完全没有甲基化的DNA 上加上甲基。

维持化甲基化(maintenance methylation)Met1 ，DNMT1较特异地识别半甲基化状态的DNA ，负责在细胞分裂过程中依据DNA 母链的甲基化状态给新合成的DNA 链上加上甲基。

DNA 胞嘧啶甲基化检测方法使用对胞嘧啶5’- 甲基化状态敏感的限制性内切酶进行酶切处理，然后检测多态性：甲基化敏感扩增多态性(MSAP, Methylation SensitiveAmplification Polymorphism)胞嘧啶转化为其它碱基，然后对比测序：重亚硫酸盐测序(Bisulfite sequencing)GCmTACT重亚硫酸钠GCmTATT测序此外，还有单核苷酸法，甲基化接受力的检测法，CpG 岛分离法和基因活性测量法，基因芯片法等表1 甲基化敏感酶对不同甲基化状态DNA 的切割结果CCm GG不切割CCmGG不切割CC GG Msp I不切割CC GG Hpa IICmCGG CCGG 原始序列内切酶? MSAP 流程：提取基因组DNA（注意发育时期和成长状态相同）………ATCCGGTGGCTTGCCmGGAC……………TAGGCCACCGAACGG CCTG……Msp I 酶切+ 接头Hap II 酶切+ 接头ATCC GGTGGCTTGCCm GGAC ATCC GGTGGCTTGCCmGGACTAGG CCACCGAACGG CCTG TAGG CCACCGAACGG CCTGPCR PCRPAGE 电泳PAGE 电泳Msp I5’…CC(m)G G…3’3’…GG C(m)C…5’Hpa II5’…CCGG…3’3’…GGCC…3’? 重亚硫酸盐测序实验目的使用不同浓度的5-azaC 溶液，处理生长早期的水稻幼苗，使其基因组DNA 胞嘧啶甲基化水平发生显著的可遗传改变，使用MSAP 方法检测DNA 胞嘧啶甲基化水平的改变；水稻幼苗因DNA 甲基化水平改变而影响基因表达水平，产生明显的表观遗传表型。

实验材料1、水稻：日本晴(Oryza sativa var japonica, nipponbare)2、所需仪器离心机、PCR仪、气浴摇床、水浴摇床、植物生长箱电泳仪、电泳槽、微量移液器、紫外分析仪、分析天平3、试剂（1）植物基因组DNA 改良CTAB 提取液：buffer A: 0.35mol/L Sorbitol ，0.1mol/L Tris-HCl pH7.5 ，0.5mmol/L EDTA;buffer B: 0.2mol/L Tris-HCl pH7.5 ，0.05mol/L EDTA ，2mol/L NaCl ，2%CTAB;buffer C: 5%N-lauroylsarcosine（2）PCR试剂：Takara rTaq ，10X PCR buffer ，ddH2O ，①预扩增引物：H/M+0: (5´-GACTGCGTACCAATTCA-3´)PCR 引物EcoRI+0: (5´-ATCATGAGTCCTGCTCGG-3´)②选择性扩增引物：H/M+AN: 5´-GACTGCGTACCAATTCAA(T, C, G)-3´EcoRI+AN: 5´-ATCATGAGTCCTGCTCGGA(T, C, G)-3´。

（3）酶切-连接试剂：EcoRI (NEB) ，Hap II (NEB) ，Msp I (NEB) ，T4 DNA ligase ，T4 10 xreaction buffer（4）接头：EcoRI adapter: 5’-CTCGTAGACTGCGTACC-3’CATCTGACGCATGGTTAAHapII/MspI adapter: 5-‘GATCATGAGTCCTGCT-3’AGTACTCAGGACGAGC（5）PAGE 试剂：聚丙烯酰胺，尿素，AgNO 3，Na 2 CO 3，溴酚蓝（6）银染固定/终止液(10% 冰乙酸) ，染色液(2升双蒸水预冷，用时加2克硝酸银，3ml 37% 甲醛) ，显影液(2升双蒸水中溶解60克碳酸钠，冷却至10-12ºC，用时，加入3ml 37% 甲醛，400ul 硫代硫酸钠（10mg/ml）) 。

（7）其它试剂：5-azaC(100mg/mL) ，蒸馏水，PVP (20%) ，氯仿: 异戊醇(24:1)，异丙醇，70% 乙醇，RNA 酶A (DNase-free) ，TE ，TAE ，琼脂糖，EB ，未酶切的λDNA ，1xTBE (0.089M Tris-borate, 0.089 M Boric Acid, 0.002 M EDTA) ，3x loading buffer(300 mM NaOH, 97% formamide, 0.2% bromophenol blue)。

实验方法1、水稻的培养（26 ℃，暗培养）取水稻水稻种子20粒X 7组，将水稻种子用75% 的酒精消毒后用无菌水浸泡数小时，当水稻种子露嘴时，分别置于90mm 培养皿内的双层滤纸上，加15mL蒸馏水浸种24h（第一天）。

2、5-azaC处理水稻幼苗：（1）6组种子分为6个实验组和1个对照组，实验组分别用20mg/mL，40mg/mL, 60mg/mL、80mg/mL、100mg/mL、120mg/mL5-azaC溶液处理，对照组用蒸馏水培养，共处理10天，每2天换处理液1次（第二~ 十一天）。

（2）10 天后每个处理随机取10 株幼苗嫩叶混合提取DNA，其余麦苗移载大田并观察田间生长情况。

2、植物基因组DNA 的提取与纯化改良CTAB法(Kidwell and Osborn, 1992)[8]（1）取不同处理的叶1g，将其在液氮中研磨成粉后转入50ml离心管。

（2）向离心管中加入等体积DNA 提取缓冲液(A:B:C=1:1:0.4混合，加1%PVP于B液)。

（3）置于65℃恒温水浴下摇床，40-50rpm振摇90分钟。

（4）加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1) ，轻轻上下颠倒10-15分钟后，4 ℃3000rpm离心10-15分钟。

（5）取上层水相加入2/3 体积的预冷异丙醇，上下颠倒5分钟并置4℃冰箱内10min。

（6）待DNA 沉淀后于4 ℃3000rpm离心收集DNA于管底。

（7）DNA于70%乙醇中过夜。

（8）取DNA沉淀并风干（第十二天）。

（9）在2ml离心管中加1ml TE溶解沉淀。

（10）待DNA 完全溶解后，加入5ul不含DNA酶的RNA酶，37℃保温30分钟以除去DNA 中的RNA。

（11）加入等量氯仿: 异戊醇(24:1) 纯化DNA ，轻轻上下颠倒10-15分钟后，4℃3000rpm 离心10-15分钟。

（12）取DNA沉淀，用70%乙醇过夜洗涤DNA，并将其溶于DNA 于200-500ul TE中。

（13）取基因组DNA溶液，0.8% 琼脂糖凝胶电泳，检查DNA的质量并据已知的DNA Marker （未酶切的λDNA）估计其浓度；调整DNA 浓度，置于-20℃备用。

3、水稻基因组DNA 酶切（1）甲基化分析采用两种甲基化敏感酶HapⅡ和MspⅠ（NEB）。

在限制性酶切和连接前，先把两个单链的接头复性为双链结构( 序列见试剂部分) ，即100℃变性5分钟，缓慢冷却至室温，-20℃冷冻保存备用。

（2）水稻MSAP限制性酶切和连接体系如下：表2 水稻MSAP限制性酶切、连接体系T4 10 x buffer 2.5ulBSA (10mg/L) 0.1ulEcoR I adaptor (5pM) 0.5ulH/M adaptor (50pM) 0.5ulEcoR I (20U/ul) 0.5ulH/MMspI (10U/ul) 0.5ul HpaII (20U/ul) 0.25ulT4 ligase 0.1ulGenomic DNA 300ng20ul AFLP-Water 补足总反应体积（3）混匀体系，37℃，6小时，8℃，4小时，4℃保存。

（4）共四个处理组，即水稻25mg/mL 处理组，水稻50mg/mL处理组，水稻100mg/mL 处理组，水稻对照组；每组分别用HapII/MspI双酶切，共需切8管（第十五天）。

4、预扩增（1）预扩增：水稻AFLP 预扩增体系如右表(预扩增引物PCR引物部分)：混匀体系，按下列参数进行PCR 扩增反应：表3 AFLP 预扩PCR体系10 x PCR reaction buffer 2.5uldNTPs (2.5mM) 2ulEcoR I primer (5 uM) 1ulH/M primer (5 uM) 1ulTaq DNA polymerase (5U/ uL) 0.2ulPCR water 16.3ulDNA 模板（预扩增稀释产物）2ulTotal volume 25ul（2）PCR 程序：94℃预变性2min, 94℃变性30秒，56℃复性30秒，72℃延伸60 秒, 共进行30 个循环，最后72℃延伸10分钟（第十七天）。

（3）根据检测结果，用0.1x TE buffer稀释预扩增产物1/10~1/40，作为PCR 选择性扩增的DNA模板。

按以下参数进行PCR 扩增反应：表4水稻AFLP 选择性扩增体系10 x PCR reaction buffer 1.5uldNTPs (2.5mM) 0.6ulEcoR I primer (5 uM) 0.6ulH/M primer (5 uM) 0.6ulTaq DNA polymerase (5U/ uL) 0.12ulPCR water 9.58ulDNA 模板（预扩增稀释产物） 2 2ulTotal volume 15ul94℃预变性2 分钟, 94 ℃变性30 秒，65℃复性30 秒，72℃延伸80 秒，以后每轮循环温度递减1℃，扩增10 轮。