兽医生物制品学

结核疫苗相关研究现状与展望结核病是由结核分枝杆菌引起的一种流传广、危害大的人畜共患传染病。

近年来，随着流通的增加，结核杆菌耐药株的不断增加、卡介苗（BCG）免疫效果欠佳、以及人们对结核杆菌研究的忽视等，导致结核病的发病率和死亡率不断上升，它又一次严重地威胁人畜健康与公共卫生。

这些都给此病的防御与治疗带来新的挑战，为此人们不可不对它再次提高警惕。

至今，卡介苗仍是预防结核病唯一可用疫苗，但其免疫保护效果极不稳定。

过去20年中，分子生物学技术的应用使得新型候选疫苗大量涌现，其中重组BCG疫苗和DNA疫苗被认为是最有前途的候选疫苗。

但所有疫苗共同的致命缺点是免疫保护力低。

佐剂的研究将大大改观这一现状。

因此，结核疫苗研究的努力方向还是在研究分支杆菌免疫机制和免疫失败的基础上，进一步增强现有候选疫苗的免疫效力或研制更为有效的新型疫苗。

一.结核疫苗相关领域的研究自从20世纪90年代以来，人们不仅重新掀起了结合疫苗的研究热潮，而且极大地加快了结核病的全面研究工作。

通过深入研究结核杆菌的生物学及生物化学、致病机制、及其感染与免疫过程，得到许多关于结核致病性及抗结核免疫保护的新假说，用来指导新疫苗的研制。

在机体抗结核免疫方面，一般认为，免疫保护作用归功于细胞介导的免疫，其中CD4+T 细胞具有极其重要的地位，CD8+Tc细胞也是机体必要的免疫保护成分，同时*δT细胞以及CD1限制性T细胞免疫也是重要的抗结核免疫保护成分，而体液免疫应答不起作用［1］。

这就引发人们考虑，结核免疫设计的靶位应集中在动员结核特异性T细胞免疫方面，理想的疫苗应能激活全面的T细胞亚群，以诱导机体多方位的抗结核免疫。

值得注意的是，这些年也有一些研究对这个传统观点提出挑战，认为一些抗体也能减轻结核感染的不同方面［2］。

也许对发展结合疫苗最大的促进来自于结核杆菌H37Rv株全基因测序的完成，以及结核杆菌后基因组（包括比较基因组、转录组、蛋白质组）的研究。

这些研究成果可以使人们更深入了解结核杆菌的毒力因子及其他关键性蛋白，通过比较分支杆菌各菌株之间基因组及蛋白质的差异，为设计开发新抗结核疫苗奠定了坚实的基础。

二.免疫相关细胞与因子研究2. I L - 4 / I L - 17 / I L - 23ROOK等[3]发现过量表达的白细胞介素4（IL-4）通过下调诱导型一氧化氮合酶( inducible nitricoxide synthaseiNOS)表达与巨噬细胞的调亡来削弱Th1介导的效应机制。

有MTB潜伏于体内的健康人并不表达IL-4δ2 ( I L - 4的一种拮抗剪接变体)，因此对于潜伏的MTB的长期有效控制就需要抑制I L - 4的活性[4]。

LANGRISH等[5]研究发现I L - 17主要作用是诱导炎症前介导因子的分泌。

急性感染过程中，这种介导因子可以促进中性粒细胞的迅速募集来参与感染的控制。

HAPPEL等[6]将IL- 23的基因克隆到有复制缺陷的腺病毒载体中，其表达产物能够促进肺部组织中干扰素γ与IL-17的表达，可以作为肺结核疫苗研究的又一新靶点。

1.调节性T细胞一个有效的结核疫苗应该能够诱导长期持续的Ⅰ类T辅助细胞( Th1)介导的免疫反应，但从更长远的意义上讲应该抑制或者下调Ⅱ类T辅助细胞( Th2)介导的效应反应。

调节T 细胞控制Th1与Th2细胞的成熟与其功能的发挥。

R I BEI RO - RODR IGUES等[7]研究的CD25+的T细胞证明记忆性T细胞(Tm)与调节T细胞在调节免疫反应方面起着重要的作用。

三.结核分支杆菌耐药方式与逃逸机制研究结核分支杆菌(mycobacteria tuberculosis，MTB)与多数细菌耐药方式相似。

但与其他人类致病菌最显著差别在于MTB不存在质粒，即无法通过质粒的介导从其他细菌或分支杆苗获得耐药性。

因此，染色体介导的耐药性是MTB产生耐药的主要形式。

多重耐药MTB的研究揭示染色体多个相互独立基因自发突变的逐步累加是其耐药的分子基础。

各国学者采用分子生物学技术对结核杆菌耐药机制进行深入研究，定位了结核杆菌耐药基因的位置和基因突变位点，从而促进了第一代快速鉴定耐药突变菌株方法的建立和新型抗结核药物的开发。

此外，MTB发展了复杂的机制逃逸免疫系统的清除。

MTB可以在寄主巨噬细胞吞噬后仍然生存，并通过外排的分泌蛋白与机体免疫系统产生反应，导致病理反应，不易杀灭，且少量的MTB可形成潜伏期病灶，以休眠状态或L型菌形式存在的MTB能够在宿主体内长期生存。

MTB利用其耐酸性细胞壁保护自己，并抑制吞噬小体与溶酶体的融合来保证自身在宿主细胞内存活。

RUSSELL等[8]发现它能够将其细胞壁表面的脂释放到宿主细胞中，诱导肉芽瘤的形成，通过控制自身增殖速度与感染速度来阻止吞噬细胞的吞噬作用。

CHAN等[9]研究表明肉芽瘤在有免疫活性宿主中可以维持数年，并成功地保持MTB处于休眠状态。

四.各类疫苗研究现状1.DNA疫苗：此疫苗能够很有效地激活免疫系统清除病菌，并且对经一段时期的化学疗法后再接受DNA疫苗的患者，那些潜伏于体内并对免疫系统或者许多抗菌治疗药物有特别耐受性的病毒也能够被清除。

DNA疫苗的治疗作用主要是增强以细胞毒作用为特征的Ⅰ型细胞免疫反应，从而减少菌量。

但目前还没有在小鼠/豚鼠模型中得到理想的治疗效果。

此类疫苗能有效地降低结核模型小鼠的细菌负载量。

张海等[10]构建的MTB ES2AT6-CFP10融合蛋白DNA疫苗在小鼠体内能够诱导较强的细胞免疫应答，诱导的IFN-γ与BCG相比也无明显差距，表明该疫苗免疫效果较好，可在TB防治中发挥重要作用。

但不同的实验室利用不同的动物模型检测其效果却得到千差万别的结论，其效果不能重复，且导致了严重的肺坏死。

NEIGH等[11]提供更多的证据表明目前模型动物饲养的条件并不有利于刺激正常免疫反应。

将表达单一抗原的疫苗或者将多个抗原基因插入到一个载体上而成的嵌合DNA疫苗表现了较好的保护作用。

DERRICK等[12]研究证明此类嵌合DNA疫苗在表现CD4 ( - / - )的鼠中表现更好的保护性。

在重重矛盾结论中，我们也能看到新的希望，SILVA等[13]提出DNA疫苗可以更有效清除病毒并能够阻止结核病的复发，可以考虑DNA疫苗与传统的药物治疗联合应用来治疗和防止疾病的再发作。

DNA疫苗的这些优点曾使许多研究者认为，DNA疫苗可以取代其他一切疫苗。

但是，随后人们也发现，在小鼠、豚鼠等小型动物试验中非常成功的DNA疫苗一旦应用到牛等大型动物或人身上就失去了原有的神奇。

因此，我们还要想办法提高DNA疫苗的免疫效力。

2.亚单位疫苗：此类疫苗建立在假说“一种或者几种保护性抗原能够激发有效的免疫反应”的基础上。

蛋白亚单位疫苗是由一种或多种MT B蛋白组分与免疫佐剂联合应用而成的疫苗。

主要有培养滤液蛋白( culture filtrate protein,CFP)混合物疫苗、单一蛋白亚单位疫苗、复合蛋白亚单位疫苗、嵌合蛋白亚单位疫苗以及表位亚单位疫苗。

MTB培养滤液中包含约200种蛋白，目前已经鉴定多种可以用做疫苗开发的蛋白组分，其中Ag85和ESAT的保护力最强，并验证了约40种此类疫苗均有免疫保护力，与强烈的Th1反应诱导佐剂联合应用效果更明显。

人们希望将此类疫苗开发成能够加强BCG疫苗保护性免疫反应且不引起病理反应的疫苗。

但BAS ARABA等[14]发现连续三次用BCG免疫会引起器官的严重衰竭。

两种重组亚单位疫苗即将进入人体临床实验，分别由SKEIKY等[15]研究的基于Mtb32/Mtb39 融合蛋白疫苗与LANGERMANS等[16]研究的基于ES AT6 /Ag85B两个抗原的疫苗。

后者已在动物模型中证明其保护效力[17]。

3.细菌或病毒为载体的重组疫苗：据报道，将MT B的主要保护性抗原引入减毒的沙门氏菌或病毒内制成疫苗，其保护力与BCG相当。

由GOONETI LLEKE等[18]构建的表达Ag85A蛋白且有复制缺陷的减毒重组牛痘病毒疫苗，在动物模型中表现出能够增强BCG的免疫保护反应。

孙海峰等[19]构建含MTB Ag85A基因的2型重组腺相关病毒，对于防止MTB感染，尤其是作为结核病的治疗性疫苗可能具有潜在的应用价值，值得进一步深入研究。

4.减毒活疫苗：此类疫苗利用其能够同时表达多种MTB抗原的特点来刺激不同T细胞群体，从而激发强烈的免疫刺激反应。

对此疫苗的研究还处于早期实验阶段，但人们希望找到能够取代BCG的减毒活疫苗。

这就必然要求其有效性与安全性都要更高。

目前，NASSER EDD I NE等[20]研究的MTB基因敲除突变体已经得到了进一步的发展，希望在保留诱导免疫保护的作用下减少毒性或抗性。

K AMA TH等[21]发现的两个非回复独立突变体也得到了广泛认同。

5. 重组BCG疫苗：此类疫苗研究出发点是为了弥补BCG疫苗的缺陷，对BCG疫苗本身进行改造，使其能够表达MTB的某些重要抗原来增强BCG的免疫原性。

由GRODE等[22]研究的典型的重组疫苗rBCG ureC:hly:表达李斯特菌细胞溶解素( listeriolysinO, LLO)增强免疫原性。

LLO是单核细胞增生症李斯特菌( listeria monocyto2genes, LM) hly基因表达的一种结合胆固醇、活化巯基的细胞溶解素，是LM的主要致病因素，它通过溶解细胞吞噬体膜而使LM逃离吞噬体。

所以，该重组BCG疫苗能够在细胞外部逃逸吞噬体的吞噬而进入到细胞溶质中。

此疫苗对实验室保藏的H37Rv菌株和临床分离的MTB菌株都有很强的杀伤作用，并计划在2007年进行一期临床试验。

培养滤液蛋白10 (CFP10)也是免疫优势抗原，能诱导机体产生强烈免疫应答。

陈全等[23]构建了重组rBCG-ES2A T-6-CFP10疫苗，免疫印迹结果显示，肺结核患者血清以及兔抗ESAT-6血清均可识别该菌体蛋白。

由HORWITZ等[24]研究的通过一期临床试验的重组BCG疫苗(rBCG30):过量表达Ag85B蛋白增强抗原性。

rB2CG30是惟一的保护力超过BCG的候选疫苗，但环境分支杆菌会不会导致这类疫苗免疫失败还是一个疑问。

五.佐剂的研究一类主要诱导Th1细胞和胞毒T淋巴细胞(CTL)的新型佐剂正在研究过程中。

细菌DNA 中含有非甲基化胞嘧啶-鸟嘌呤(CpG)基序(CpG模体)的某些寡核苷酸具有免疫调节作用。

它可激活多种免疫细胞、诱导其分泌各种细胞因子及免疫球蛋白、激发非特异性免疫应答、增强抗原特异性免疫应答、诱导Th1免疫应答并抑制Th2免疫应答等，被认为是一种有前途的、安全的、有效的佐剂。

将人工合成的多聚L -精氨酸与含有CpG模体的多聚脱氧核苷酸联合应用，能够增强抗原特异性免疫应答[25]。