酶联免疫分析技术的发展
免疫学检验技术的研究进展
细胞 ，产生 Ｃ Ｋ或 Ｉ。细胞下方 的固相单克隆抗体就会捕获 Ｃ ｇ Ｋ
１ 研 究进展
１１ 荧光 素 标 记 抗体 技 术 ．
或Ｉ ｇ物质。 细胞被清洗后 ， 加入生物素化 的第二抗体 ， 抗体 和 Ｃ Ｋ
或 Ｉ 物质结合后 ， ｇ 再加以酶做标记的生物素或亲和素反应 ， 以酶 流式荧光免 疫微 球分析技 底物显色 ， 阳性细胞就可形成直径约 ５ ～２ ０ Ｔ大小不等的圆 ０ ０ Ｉ Ｉ
现 代 免 疫 学 检 验 技术 源 于标 记 技 术 在 免 疫 学 中 的应 用 。科
１ ． 酶 联 免疫 斑 点 技 术 ．２ ２
酶 联 免 疫 斑 点 技 术 是 一 种用 于测 定
技 的进步推动免疫检 验技术 的迅速发展 ，正从单一 的免疫诊断
Ｂ细 胞 分 泌 免 疫 球 蛋 白 、 Ｔ细胞 分 泌 细 胞 因 子功 能 的分 析 技 术 ，
定 阳性 Ｔ Ｂ细胞族群 的产生则可以通过斑点直径 的大小 可以直 、 接反映。酶联免疫斑点技术既可用于分泌抗体的 Ｂ细胞 ， 也可用
于分 泌各 类 Ｃ Ｋ的 Ｔ细胞 。 联 免疫 斑 点 技 术 也是 Ｔ细胞 功 能检 酶 测 的标 准 技 术 ， 有 较 高 的检 测 灵 敏度 日 具 。
技术 向单细胞 、 多基 因、 微量化等方面发展 。而哮喘 、 器官和骨髓
移植 、 自身免疫性疾病 、 变态反应 、 淋巴细胞和浆细胞 的恶性肿 瘤 以及 继发性 和原 发性免疫 缺陷 的临床诊 断都客 观要求 免疫
学 检 验 技术 更 加 精确 ， 且能 够 定 量 评 价 临床 治 疗 的 有 效性 。 并
１ ． 元素标记免疫检 验技术 ．１ ３
元素标记 免疫 检验技术 中的标
ivd行业发展历程
IVD（ 体外诊断）行业是医疗领域的一个重要分支，主要涉及到体外诊断试剂和设备。
体外诊断是指在体外进行的诊断检测，包括临床实验室检测、急诊检测、分子诊断等。
以下是IVD行业发展的一般历程：1.（起步阶段：20世纪初，体外诊断的概念逐渐形成，最早的试剂和设备开始应用于实验室诊断。
这个阶段主要集中在基本的生化分析和血液学检测。
2.（免疫学的引入：20世纪50年代至70年代，免疫学的发展推动了IVD行业的进步。
ELISA 酶联免疫吸附试验）等技术的应用使得检测范围更加广泛。
3.（分子诊断的兴起：20世纪80年代至90年代，分子生物学的飞速发展带来了分子诊断技术的突破。
聚合酶链式反应 PCR）的发明和应用成为体外诊断的重要工具，使得基因检测和病原体检测变得更为精准。
4.（自动化与数字化：21世纪初，IVD行业经历了自动化与数字化的革命。
自动化的实验室设备和数字化的信息管理系统大幅提高了检测效率和数据管理能力。
5.（个性化医疗的兴起：进入21世纪后期，随着基因组学和生物信息学的发展，IVD行业逐渐朝向个性化医疗迈进。
个体基因信息的获取和利用成为临床决策的重要因素。
6.（新技术的涌现：当前，IVD行业正不断涌现新技术。
包括高通量测序、液体生物标志物检测、纳米技术等在内的新技术正在改变诊断和监测的方式，使得检测更为精准、快速、便捷。
7.（全球市场的扩张：随着医疗水平的提升和对早期诊断的重视，IVD行业在全球范围内市场需求不断扩大。
亚太地区、拉丁美洲等新兴市场成为IVD企业关注的热点。
8.（面临的挑战与机遇：IVD行业面临着监管要求的提升、数据安全性的关切、技术标准的制定等挑战。
同时，随着精准医学理念的深入，IVD行业也有望在癌症早期诊断、慢性病管理等领域找到更多机遇。
总体而言，IVD行业的发展历程经历了从基础生化分析到免疫学、分子诊断的发展，再到自动化、数字化和个性化医疗的转变。
未来，随着科技的不断进步和医疗需求的提升，IVD行业仍然充满着机遇和挑战。
酶联免疫分析技术
室 温 温 育 的 反 应 ， 操 作 时 的 室温 应 严格 限 制 在 规 定 的 范围 内 ， 标准 室 温温 度 是指 20-25℃ ， 应注 意 温育的温度和时间应按规定力求准确。为保证这一点， 一个人操作时，一次不宜多于两块板同时测定。
AP的底物为磷酸酯酶，一般采用对 硝基苯磷酸酯 作 为底物。产物为黄色的对硝基酚，在 405nm 波长处 有吸收峰。用 NaOH 终止酶反应后，黄色可稳定一时 间。 AP也有发荧光底物（磷酸 4- 甲基伞酮），可用 于 ELISA作荧光测定，敏感度较高于用显色底物的 比色法。
洗涤液
常用的稀释液为含 0.05% 吐温 20磷酸盐缓冲液。
异相法：
?Ab* A* *g*和Ab 分离，然后测定 Ab Ag 或Ab 的量， 从而推算出 Ag量。
*
A
过量 Ab
g
*
Ab *
Ab A g
均相法 ：
?Ab *Ag中的标记物 *失去特性，直接测定游离 Ab *的量，从而推算出 Ag量。
*
A
过量 Ab
g
* Ab *
Ab A g
1 特异性
抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结 合位点之间。化学结构和空间构型互补关系，具有高 度的特异性。
2013-8-13
免疫检验
? 利用免疫检测原理检测与免疫相关的 物质（抗原、抗体、补体、细胞因子 等）
? 利用免疫检测原理检测体液中的微量 物质（激素、酶、血浆中的微量蛋白、 药物浓度等） 这些检测结果为临床上确定诊断， 分析病情，调整治疗方案和判断预后 提供有效的实验依据 。
酶联免疫分析技术
酶联免疫法和化学发光法
酶联免疫法和化学发光法
酶联免疫法（ELISA）和化学发光法（CLIA）是两种常用的免疫分析技术，用于检测和定量生物分子，如蛋白质、抗体、激素等。
它们在实验室和临床诊断中广泛应用。
酶联免疫法是一种基于酶催化反应的免疫分析方法。
其基本原理是将待测物（抗原或抗体）与固相载体（如微孔板）上的抗体或抗原结合，然后加入酶标记的抗体或抗原，形成三明治复合物。
当加入底物时，酶会催化底物发生反应，产生可检测的信号，通常是颜色变化或荧光强度。
通过测量这些信号，可以定量待测物的浓度。
酶联免疫法具有灵敏度高、特异性好、操作简便等优点，适用于大规模样本的检测。
它可以用于检测多种生物分子，如蛋白质、激素、药物、病原体等。
常见的酶联免疫法包括间接法、夹心法和竞争法等。
化学发光法是一种基于化学发光反应的免疫分析方法。
其基本原理是将待测物与固相载体上的抗体或抗原结合，然后加入标记有发光物质的抗体或抗原，形成三明治复合物。
当加入触发剂时，发光物质会被激发并产生光信号。
通过测量光信号的强度，可以定量待测物的浓度。
化学发光法具有灵敏度高、线性范围宽、快速等优点，适用于微量和痕量分析。
它可以用于检测多种生物分子，如蛋白质、激素、药物、病原体等。
常见的化学发光法包括间接法、夹心法和竞争法等。
总的来说，酶联免疫法和化学发光法都是常用的免疫分析技术，它们各有优缺点，适用于不同的应用场景。
选择哪种方法取决于待测物的特性、检测要求以及实验室的设备和技术水平。
酶联免疫反应的原理和步骤
酶联免疫反应的原理和步骤一、酶联免疫反应的原理酶联免疫反应是一种常用的实验技术，用于检测和定量分析抗原或抗体的存在和浓度。
其原理基于抗原与抗体之间的特异性结合反应，通过将酶标记的二抗与特异性抗体结合形成免疫复合物，再利用酶的催化作用产生可定量检测的产物，从而实现对抗原或抗体的检测和定量。
酶联免疫反应的原理可以简单概括为以下几个步骤：1. 免疫吸附：将待测物（抗原或抗体）吸附在固相载体（如酶标板、磁珠等）上，使其与固相载体结合。
2. 阻断：为了防止非特异性结合，需要在免疫吸附之前或之后对固相载体进行阻断处理，通常使用牛血清蛋白（BSA）或牛血清白蛋白（BSA）来阻断非特异性结合位点。
3. 特异性结合：加入特异性抗体与待测物进行结合反应，形成抗原-抗体复合物。
4. 二抗结合：加入酶标记的二抗，该二抗与特异性抗体结合，形成二抗-抗原-抗体复合物。
5. 底物反应：加入底物，该底物受酶的催化作用产生可定量测量的产物。
常用的底物有TMB（三甲基苯胺）、ABTS（2,2'-联氨基丙烷磺酸）等。
6. 反应终止：加入适当的反应终止液，停止底物反应过程。
7. 测量：通过光度计或荧光计测量产物的光吸收或荧光强度，以反映抗原或抗体的浓度。
二、酶联免疫反应的步骤酶联免疫反应通常包括以下几个步骤：1. 表面处理：将固相载体（如酶标板）表面进行处理，以增强待测物的吸附能力和特异性结合。
常用的方法有物理吸附、化学共价结合、亲和结合等。
2. 阻断处理：为了防止非特异性结合，需要对固相载体进行阻断处理，通常使用牛血清蛋白（BSA）或牛血清白蛋白（BSA）来阻断非特异性结合位点。
3. 特异性结合：加入待测物（抗原或抗体），与固相载体上的特异性抗体进行结合反应，形成抗原-抗体复合物。
4. 二抗结合：加入酶标记的二抗，该二抗与特异性抗体结合，形成二抗-抗原-抗体复合物。
5. 底物反应：加入底物，该底物受酶的催化作用产生可定量测量的产物。
数字酶联免疫方法学(单分子免疫)
数字酶联免疫方法学(单分子免疫)数字酶联免疫方法学，又称为单分子免疫技术，是一种应用于生物学研究和临床诊断的先进技术。
它可以帮助科研人员更加准确地检测和定量分析微量目标物质，如蛋白质、核酸等，从而推动科学研究和临床应用的进步。
数字酶联免疫方法学的核心是单分子免疫技术，它利用高灵敏度的酶联免疫检测方法，将目标物质与酶标记物结合，通过酶催化反应的产物生成的荧光或颜色信号来间接测定目标物质的含量。
与传统的酶联免疫方法不同的是，数字酶联免疫方法学能够在单个分子水平上进行检测和分析，具有更高的灵敏度和准确性。
数字酶联免疫方法学具有许多优势。
首先，它具有较低的检测限度，能够在低浓度的目标物质中进行可靠的检测。
其次，它可以检测多种不同的目标物质，如蛋白质、核酸等，具有广泛的应用价值。
此外，数字酶联免疫方法学还具有样本处理简便、操作灵活和结果可视化等优点。
在研究领域，数字酶联免疫方法学已经被广泛应用于蛋白质的表达和定量、蛋白质相互作用的研究、细胞信号通路的调控等方面。
它不仅可以提供准确的实验数据，还可以帮助科研人员加深对生命科学的理解。
在临床领域，数字酶联免疫方法学也有着巨大的潜力。
它可以用于早期癌症的诊断、药物治疗效果的监测、感染病原体的检测等。
由于数字酶联免疫方法学在样本处理和分析过程中减少了人为误差，因此可以提供更加准确和可靠的诊断结果，为临床医生的决策提供有力支持。
尽管数字酶联免疫方法学在科研和临床应用方面取得了重大进展，但仍面临着一些挑战。
例如，技术的复杂性和仪器设备的昂贵性限制了其在实际应用中的普及。
此外，对于一些复杂样品的处理方法和分析标准仍需要进一步研究和优化。
总之，数字酶联免疫方法学作为一种高灵敏度、高准确度的检测技术，为生物学研究和临床诊断带来了巨大的突破。
随着技术的不断发展和完善，相信数字酶联免疫方法学将会在科学研究和医学实践中发挥越来越重要的作用，为人们的健康福祉做出更大的贡献。
ELISA技术方法原理
是检测抗体最常用的方法, 本法主要用于对病原体抗 体的检测而进行传染病的 诊断
只要变换包被抗原就 可利用同一酶标抗抗 体建立检测相应抗体
小分子抗原如激素和药物 快，只有一次保温洗 等ELISA测定多用此法。 涤过程
竞争法测抗体
当抗原材料中的干扰物质 不易除去，或不易得到足 够的纯化抗原时，可用此 法检验特异性抗体
--
Y
酶标仪450nm波长 或双波长450/630nm
固 相 抗 体 抗 原 酶 标 抗 体 免 疫 复
Y 合 YYYYYY 物
OD值
加终液50ul 37℃育温15分钟 加底物液A和底物液B各50ul
洗板5次 37℃育温（ ）分钟
酶工作液50ul 血清样本
根据校准品浓度对应的 OD值，使用双对数线 拟合方式 log（x）-log
（Y）计算结果 =concentration（浓度） ×样品稀释倍数＝样品
最终浓度
高特异性高敏感性鼠人抗（ ）单克隆抗体作为包被抗体
CRP、ALB、BTAA
•双抗夹心法适用范围
待测抗原须有两个可以与抗体结合的部位，其一端与包被于固相 载体上的抗体结合，另一端与酶标记的特异性抗体结合。
此法适用于检验各种二价或二价以上的大分子抗原，如HBsAg、 HBeAg、AFP、hCG、CRP、ALB、BTAA等。不能用于分子量 小于5000D的半抗原或小分子单价抗原的测定。
㈠ 磁珠碱性磷酸酶标记的化学发光免疫分析 碱性磷酸酶标记化学发光免疫分析示意图
三、电化学发光免疫分析
电化学发光免疫分析（electrochemiluminescence immunoassay， ECLIA）是以电化学发光剂三联吡啶钌标记抗体(抗原)，以 三丙胺(TPA)为电子供体，在电场中因电子转移而发生特异性 化学发光反应，它包括电化学和化学发光两个过程。
医学检验技术的新进展
医学检验技术的新进展引言随着医疗技术的飞速发展，医学检验技术也在不断地更新换代。
近年来，基因检测、免疫组化和生化分析等技术的应用和改进，给医学检验技术带来了新的进展。
本文将从不同类别的技术，介绍医学检验技术的新进展。
一、基因检测技术基因检测是指通过分析人体DNA中的遗传信息，对人体疾病风险和基因型进行检测和分析。
基因检测技术的发展，提供了一种全新的预防和治疗疾病的方式。
1. 基因测序技术基因测序技术是将DNA样本进行全片段或者目标区域的高通量测序，以获取个体基因组信息，并对基因的变异、突变和载体等进行分析。
随着二代大规模测序技术的应用，该技术的分析速度和精度得到了大幅度的提升。
目前，基于基因测序技术的癌症遗传突变检测，成为肿瘤早期筛查和治疗的重要手段。
2. 基因芯片技术基因芯片技术是通过在芯片上固定大量的探针，来快速、同时地检测多个基因或者SNPs位点的技术。
因此，基因芯片技术也叫做基因微阵列技术。
基因芯片技术具有高通量、高效和高信息含量的特点，可用于快速、准确地分析疾病发生、发展及其变化的机制等方面。
3. PCR技术PCR技术是一种用于扩增DNA序列的方法，具有高敏感、高特异性和高效率的特点。
PCR技术已被广泛应用于基因突变、基因表达、DNA序列分析等方面。
特别是在感染病和遗传疾病方面得到广泛的应用。
PCR技术也是分子诊断技术中最常用的技术之一。
二、免疫组化技术免疫组化技术是一种检测细胞或组织内特定蛋白质的分布和表达水平的技术。
它通过利用抗体与特定抗原的特异性结合，利用染色等手段可对样本中的抗原进行定位和检测。
目前，免疫组化技术被广泛应用于细胞和组织的病理诊断、病理生理学等方面。
1. 免疫荧光技术免疫荧光技术是利用荧光染料标记的抗体与特定的抗原结合，通过观察发出的荧光信号的方式，来检测和定位细胞或组织中的特定蛋白质。
免疫荧光技术具有高分辨率、高灵敏度和高特异性的特点，尤其适用于癌症诊断和治疗等方面。
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酶联免疫分析技术的发展
酶联免疫吸附试验（ELISA/EIA，简称“酶免试验”）是一项现代医学临床检验基本的、常规的检测技术。
尽管在90年代初期，由于以聚合酶链反应（PCR）技术为代表分子生物学水平技术的发明，人们纷纷预测，酶免试验将被更高灵敏度、数百万级信号放大的、病原体水平检测的核酸放大试验（NAT）所取代。
但由于免疫临床标志物（抗原/抗体）具有无法替代的临床意义，以及酶免试验具有操作简便、技术可靠，特别是，90年代末期ELISA检测系统的灵敏度和特异性以及检测过程的自动化得到了显著提高与完善，因此，酶免试验再也没人怀疑将被淘汰，而成为传染病血清学标志物（如肝炎、艾滋、致畸病原Torch）、肿瘤标志物及内分泌等各种临床免疫指标检测的主导技术。
支持酶免试验技术的进步，酶标板检测仪器朝着二个方向快速发展。
一方面，侧重酶免试验的光学检测系统----酶标仪，到90年代末已达到至臻完美状态；随着纳米技术微量加样的发展，酶标仪将很容易由检测传统的96微孔板，转化为检测384微孔板，甚至1536微孔板，达到更高的检测效率。
另一方面，侧重酶免试验处理过程技术----酶标分析系统，到90年代末也已充分发展；随着多任务软件，如O/S2，Unix及Windows NT等操作平台的完善，满足现代实验室GMP/GLP要求的全自动酶标分析系统，正在世界各种实验室普及。
应当指出，在发达国家全自动酶标分析系统的进步，是由法规要求严格、酶免试验结果至关重要的血站实验室需求推动的。
这是因为，不同于临床病人检测结果，仅是医生诊断的参考数据，血站血液筛查实验室的检验结果判定，将直接决定血液的安全性。
以日本为代表的“全面实验室自动化”（TLA）运动，对于全自动酶免分析系统产生了巨大的需求。
在90年代初期，手工酶免试验操作曾经成为TLA的主要障碍。
目前，由于全面实验室自动化具有标准化、高效率、高质量的自动化与网络化特征，正成为临床实验室发展
的新趋势。
酶免试验自动化与网络化的时代已经到来，全面实验室自动化不再是一种模型。
了解这些技术进步将有助于高效临床实验室的建设与发展。
一、样本处理自动化
根据美国临床病理学院（CAP）的调查报告，实验室误差（ERROR）产生原因的79%因素，是因为实验过程中样本处理不当造成的。
区别与其他临床检验技术针对于每一反应单元对应于一份标本，酶免试验的样本处理必须基于批量化操作----96孔酶标板。
第一代多功能（Robotic）样本处理机，是由瑞士哈美顿（HAMILTON）公司开发于1985年上市的Microlab 2200。
这是一台基于机械臂运动和稀释分配器（Diluter）原理，采用8或12根固定距离的特弗隆探针，由BASIC程序控制的样本处理机。
随着酶免试验的普及，基于稀释分配器原理的样本处理机得到快速发展，先后有数家厂商开发了十余种样本处理机，以满足实验室液体处理需要。
如瑞士哈美顿公司的Microlab 4000等。
1989年，哈美顿公司独树一帜地开发上市了以专利技术的可抛弃塑料活塞注射器（Micro-syringe）原理的批量样本处理机Microlab AT，试图满足更快的加样（12针）、无污染地加样、主动抛弃可能失去精度的加样针、屏弃不可预测的管路污染与稀释等实验室需求。
1997年，该公司将AT系列增强改进为Microlab AT plus 2型。
这种原理的酶标板样本处理机，具有全面的标本质量监测系统、加样质量保障系统和全过程控制（Total Process Control）系统，是唯一获得美国FDA许可，用于血液筛查实验室的产品。
在中国自1996年开始引进AT样本处理机，迄今为止已有100余台。
样本处理自动化的最新技术进步，是以瑞士哈美顿公司于2000年8月推出的第五代斯达尔全自动随机式批量样本处理机（Microlab StarTM Automatic Robotic Batch Sampler）为标志的。
其主要技术特征是：
---采用专利的压缩导入-O形环扩张（CO-RE）核心技术，实现标准加样枪的智能化、自动化
---理想的加样体系----气动置换加样原理ADP的实现
---实现任意加样动作同时使用不同的加样头（抛弃型加样尖和永久型探针）
---实时实现液体双传感（△C-△P）技术
---全方位液面传感应用
---活性洗涤工作站（Active Wash Station），是提高加样速度的关键
---最多同时16独立通道处理系统
---智能增强的容错。