酶联免疫吸附详解
酶联免疫吸附法原理
酶联免疫吸附法原理酶联免疫吸附法（ELISA）是一种常用的免疫学实验技术，广泛应用于生物医学研究、临床诊断和生物制药等领域。
它通过酶与抗原或抗体的特异性结合来检测样品中特定的蛋白质分子，具有高灵敏度、高特异性和简便易行的特点。
下面将详细介绍酶联免疫吸附法的原理。
首先，酶联免疫吸附法的基本原理是利用酶标记的抗体或抗原与待检测的抗原或抗体结合，再通过酶底物的作用来间接或直接检测样品中的特定蛋白质。
整个实验过程可以分为固相吸附、特异性结合、非特异性结合和酶底物反应等步骤。
固相吸附是酶联免疫吸附法的第一步，通常将待检测的抗原或抗体通过物理吸附或共价结合的方式固定在固相载体（如微孔板）上。
这样做的目的是为了使待检测的抗原或抗体能够与酶标记的抗体或抗原发生特异性结合。
特异性结合是酶联免疫吸附法的关键步骤，它是指将酶标记的抗体或抗原与待检测的抗原或抗体发生特异性结合。
在这一步骤中，酶标记的抗体或抗原将与待检测的抗原或抗体形成免疫复合物，而非特异性结合则会被洗涤去除。
非特异性结合是指除了特异性结合外，固相载体上还可能存在一些非特异性结合的情况。
为了减少非特异性结合的干扰，需要通过洗涤的方式将非特异性结合的物质去除，以保证后续的酶底物反应的准确性和特异性。
最后，酶底物反应是酶联免疫吸附法的最后一步，当酶标记的抗体或抗原与待检测的抗原或抗体发生特异性结合后，加入酶底物后，酶将催化底物的变化，产生可测量的信号。
通过测定信号的强度或颜色的变化，可以间接或直接检测样品中特定蛋白质的含量或存在情况。
总的来说，酶联免疫吸附法是一种基于酶与抗原或抗体的特异性结合来检测特定蛋白质的技术。
它通过固相吸附、特异性结合、非特异性结合和酶底物反应等步骤，实现对样品中特定蛋白质的高灵敏度、高特异性的检测。
在实际应用中，酶联免疫吸附法已经成为生物医学研究和临床诊断中不可或缺的重要技术手段。
酶联免疫吸附测定技术
酶联免疫吸附测定技术酶联免疫吸附测定技术（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）是一种常用的分析方法，广泛应用于生物医学研究和临床诊断。
该技术的原理是利用特异性抗体与待测物发生特异性结合，通过酶的催化作用产生颜色反应或荧光信号，从而得到定量或半定量的结果。
下文将详细介绍ELISA的原理、反应步骤以及其应用领域。
一、ELISA的原理ELISA的原理基于抗原与抗体的特异性结合。
它包括固定期（Coating）、阻断期（Blocking）、结合期（Binding）、洗涤期（Washing）和检测期（Detection）五个关键步骤。
1. 固定期（Coating）首先，在微孔板中将待测物固定在表面，这一步又称为固相抗原法。
通常使用多糖、蛋白质等具有反应性的物质将待测物固定在微孔板上。
固定完毕后，洗去多余的待测物。
2. 阻断期（Blocking）为避免非特异性结合和降低背景干扰，需要在上一步后加入阻断缓冲液，如牛血清白蛋白（BSA）或鱼明胶等，使孔洞表面被占满，阻断非特异性吸附位点。
3. 结合期（Binding）加入待测样本和特异抗体，特异抗体可与待测物发生特异性结合，形成抗原-抗体复合物。
一般将待测物样本加入微孔板后，经过一段时间的孵育，使抗原与特异抗体发生结合。
4. 洗涤期（Washing）在结合期后，需进行洗涤步骤以去除未结合的物质。
洗涤缓冲液通常使用含有洗涤剂的磷酸盐缓冲液，洗涤次数及力度需充分保证去除干净。
5. 检测期（Detection）在洗涤期后，加入与特异抗体结合的酶标记二抗，例如辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗兔IgG。
经过孵育后，待测物与酶标记二抗形成复合物。
最后，加入底物使酶催化反应产生颜色或荧光信号。
二、ELISA的应用领域ELISA技术在生物医学研究和临床诊断中具有广泛的应用。
1. 生物医学研究ELISA被用于检测生物样本中的特定蛋白质、肽、抗体和核酸等。
酶联免疫吸附实验 (ELISA)
酶联免疫吸附实验(ELISA)1.实验目的酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay 简称ELISA）是在免疫酶技术（immunoenzymatic techniques）的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术,ELISA过程包括抗原（抗体）吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体（抗原）, 再加相应酶标记抗体（抗原）,生成抗原（抗体）－－待测抗体（抗原）－－酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。
借助分光光度计的光吸收计算抗体（抗原）的量。
待测抗体（抗原）的定量与有色产生成正比。
2.实验原理用于免疫酶技术的酶有很多，如过氧化物酶，碱性磷酸酯酶，β－D－半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰胆碱酯酶，6－磷酸葡萄糖脱氧酶等。
常用于ELISA法的酶有辣根过氧化物酶，碱性磷酸酯酶等，其中尤以辣根过氧化物酶为多。
由于酶催化的是氧化还原反应，在呈色后须立刻测定，否则空气中的氧化作用使颜色加深，无法准确地定量。
辣根过氧化物酶（HRP）是一种糖蛋白，每个分子含有一个氯化血红素（protonhemin）区作辅基。
酶的浓度和纯度常以辅基的含量表示。
氯化血红素辅基的最大吸收峰是403nm，HRP酶蛋白的最大吸收峰是275nm，所以酶的浓度和纯度计算式是（已知HRP的A（1cm 403nm 1%）＝25，式中1％指HRP百分浓度为100ml含酶蛋白1g，即10mg/ml，所以，酶浓度以mg/ml 计算是HRP的A（1cm 403nm mg/ml=2.5）HRP纯度（RZ）=A403nm/A275nm 纯度RZ（Ｒeinheit Zahl）值越大说明酶内所含杂质越少。
高纯度HRP的RZ值在3.0左右，最高可达3.4。
用于ELISA检测的HRP的RZ值要求在3.0以上。
ELISA的基本原理有三条：（1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性；（2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；（3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。
常见酶联免疫吸附试验及注意事项
常见酶联免疫吸附试验及注意事项在医学诊断领域中，酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种非常常见的技术方法，用于检测体液中的特定物质，如抗体、抗原、蛋白质等。
ELISA技术的广泛应用使得它成为了医学研究和临床诊断中不可或缺的工具。
本文将探讨ELISA技术的原理、分类、应用、优缺点及在实验中的注意事项。
一、ELISA的原理ELISA技术通过酶标记的抗体、抗原或其他蛋白质与待检测物质发生特异性反应，然后通过酶底物的变色反应来定量检测待检测物质的浓度。
根据不同的酶标记物，ELISA技术可以分为直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA和间接竞争ELISA等不同类型。
每种类型的ELISA 技术都有其特定的优点和适用范围，研究者需要根据具体的实验目的来选择合适的ELISA技术。
二、ELISA的分类1.直接ELISA直接ELISA是最简单的一种ELISA技术，它利用酶标记的抗体直接与待检测物发生特异性反应。
直接ELISA通常用来检测抗原或抗体，用于病原微生物和病原体的检测及特异性抗体的筛查。
2.间接ELISA间接ELISA利用待测抗体与被测物特异性结合后再加入酶标记的第二抗体结合，从而达到信号放大的目的，常用于病毒感染、免疫球蛋白筛查等领域。
3.竞争ELISA竞争ELISA通常用于检测浓度较低的抗原，其原理是待检测抗原与固定在板上的特异性抗体争夺酶标记抗体结合位点，由于酶标记的抗体数量一定，可根据酶底物底物的变色反应来计算出待检测抗原的浓度。
4.间接竞争ELISA间接竞争ELISA结合了间接ELISA和竞争ELISA的原理，可以用于检测抗体和病原微生物。
三、ELISA的应用ELISA技术在医学检验中具有广泛的应用，可以用于各种疾病的诊断、病原微生物的检测、血清学调查、感染性疾病的筛查等。
ELISA技术也被应用于生物医药领域，用于药物检测、蛋白质定量和特异性蛋白质筛查等。
四、ELISA的优缺点ELISA技术具有操作简便、灵敏度高、特异性强、多重自动化等优点，但也存在一些缺点，如试剂价格昂贵、结果受外界因素干扰、样本处理过程中易受污染等。
酶联免疫吸附测定名词解释
酶联免疫吸附测定名词解释酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一种用于检测生物样本中特定抗原或抗体的定量分析方法。
该方法结合了免疫学技术和酶学技术，可广泛应用于临床诊断、药物研发和生物学研究等领域。
ELISA的基本原理是利用特异性抗体与待测物质（抗原或抗体）结合，在固定的固相支持物上进行特异性结合。
通常情况下，ELISA方法包括四个主要步骤：涂覆、孵育、洗涤和检测。
1.涂覆：将特异性抗体或待测物质固定在微孔板的底部或其他固相材料上。
涂覆后，待测物质能够与后续加入的样本中的抗原或抗体结合。
2.孵育：将待测样本加入到涂覆好的微孔板中，样本中的抗原或抗体能够与固定在底部的特异性抗体结合。
3.洗涤：通过反复加入缓冲液并倒掉的方法，去除非特异性结合的物质，以减少干扰。
4.检测：加入与被测抗原或抗体结合的酶标记抗体，形成免疫复合物。
随后，再加入酶底物，使酶催化产生反应物。
根据反应物的产生量，可以定量测定待测物的浓度。
ELISA方法使用方便、操作简单，能够高效地进行大规模样本的处理和分析。
根据具体的检测目的和待测物质性质的不同，ELISA方法可分为直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA、夹心ELISA等不同类型。
此外，近年来还发展了一些改进的ELISA方法，如荧光ELISA和化学发光ELISA等。
ELISA方法在临床诊断中广泛应用，可以用于检测感染性疾病、自身免疫病、肿瘤标记物等。
此外，ELISA方法还可以用于药物研发，如筛选药物靶点、评估药物吸收、分布、代谢和排泄等。
在生物学研究中，ELISA方法可以用于分析蛋白质相互作用、表达水平的检测和鉴定、细胞因子测定等。
简述酶联免疫吸附测定的原理
简述酶联免疫吸附测定的原理酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一种高度敏感、高通量的免疫技术，常用于检测微量生物分子或抗体的存在与浓度。
ELISA的原理基于抗体与抗原之间高度特异性的结合，以及酶底物反应的可见色素反应。
ELISA的基本原理如下：1. 酶联：先将抗原或抗体固定在固相载体（如微孔板）上。
最常用的固相载体是聚丙烯酸酯（polystyrene），可以牢固地吸附抗原或抗体。
2.结合：在固相载体上固定的抗原与样品中的分子结合，以形成特异性的抗原-抗体复合物。
3.洗涤：为了去除非特异性结合的物质，需要进行反复的洗涤步骤。
4.检测：加入与目标分子相关的抗体，这些抗体经过标记，通常是酶标记。
这些标记的抗体与复合物中的目标分子结合。
5.洗涤：再次进行洗涤步骤，以去除非特异性结合的物质。
6.底物-酶反应：加入合适的底物，底物与酶标记的抗体发生反应，并产生可见的色素物质。
7.读数：用光度计测量反应物的吸光度，吸光度的强度与样品中目标物的浓度成正比。
ELISA的优点是具有高度的特异性和敏感性，可以检测极低浓度的物质。
此外，ELISA还可以同时检测多个样品，并且操作相对简单，不需要昂贵的设备。
ELISA的应用广泛，特别是在医学诊断领域。
例如，ELISA可以用来检测一些疾病的标志物，如乳腺癌、艾滋病、流感等。
此外，ELISA还用于酶抗体检测、药物监测、细菌和病毒的检测等领域。
虽然ELISA是一种非常有用的技术，但也存在一些局限性。
ELISA对样品中的杂质比较敏感，可能会导致假阳性结果。
此外，ELISA只能检测已知的抗原或抗体，无法发现新的目标分子。
此外，ELISA需要时间较长（通常需要2-4小时）。
综上所述，酶联免疫吸附测定（ELISA）是一种重要的免疫技术，通过抗原与抗体的特异结合和酶底物反应，可以准确、敏感地检测微量生物分子或抗体的存在与浓度。
酶联免疫吸附试验
技术创新：新型的酶联免疫吸附试验技术不断涌现如荧光标记技术、量子点标记技术等提高了检测的灵敏度和特异性。
市场需求：随着生物技术的不断发展酶联免疫吸附试验在临床诊断、食品安全、生物医药等领域的需求不断增长。
发展趋势：随着检测技术的不断进步酶联免疫吸附试验将朝着更快速、更准确、更自动化的方向发展。
应用领域拓展：酶联免疫吸附试验的应用领域不断拓展如肿瘤标志物检测、病毒检测、食品安全检测等为各领域的发展提供了有力支持。
荧光标记技术：提高灵敏度降低背景干扰
磁珠分离技术：快速分离抗原抗体提高试验速度
酶联免疫吸附试验在交叉学科领域的应用前景
酶联免疫吸附试验在生物医学领域的应用
酶联免疫吸附试验在环境监测领域的应用
酶联免疫吸附试验在农业科技领域的应用
酶联免疫吸附试验在食品安全检测领域的应用
酶联免疫吸附试验的市场需求与发展趋势
联合检测：将酶联免疫吸附试验与其他检测方法相结合提高检测的灵敏度和特异性。
标准化和规范化：建立酶联免疫吸附试验的标准化和规范化操作流程确保试验结果的准确性和可靠性。
酶联免疫吸附试验的发展趋势
PRT SIX
酶联免疫吸附试验的技术创新与突破
自动化技术：提高试验效率降低人为误差
微孔板技术：简化操作减少样本用量
PRT TWO
酶联免疫吸附试验的定义
酶联免疫吸附试验是一种常用的免疫分析技术
通过酶与抗体或抗原的结合实现对目标分子的定量或定性检测
酶可以放大信号提高检测的灵敏度和特异性
酶联免疫吸附试验广泛应用于生物学、医学等领域
酶联免疫吸附试验的原理
洗涤去除未结合的成分后加入底物显色通过颜色反应判断待测物的浓度。
阻断酶联免疫吸附试验：将抗体先固定在固相载体上再用酶标记的抗原进行检测最后加入底物显色。
酶联免疫吸附反应ELISA
假阳性或假阴性
05
ELISA实验数据分析和结果解读
通常采用四参数或三参数拟合曲线，以获得样品中目标抗原或抗体的浓度。
定量数据分析
阳性/阴性判断
数据方差分析
根据曲线设置的阈值，确定样本是阳性还是阴性。
比较不同样本间数据的变异程度，判断实验的重复性和稳定性。
03
数据分析方法
02
ห้องสมุดไป่ตู้01
当样本中存在目标抗原或抗体时，ELISA实验出现阳性反应，浓度高于阈值。
临床诊断
食品安全
生物毒素检测
科学研究
用于检测食品中的抗生素、农药残留等。
用于检测环境中的重金属、有机污染物等。
用于研究免疫系统、疾病发病机制等。
02
ELISA实验原理
免疫吸附反应
酶标记的抗原或抗体
底物显色
酶联免疫吸附反应原理
双抗原夹心法
适用于检测半抗原和小分子抗原，如病毒、细菌等，操作较复杂，特异性较好。
包被
将抗原或抗体包被到酶标板孔中，以便与样本中的相应抗体或抗原结合。
封闭
加入封闭液，封闭酶标板孔中的未结合位点。
实验操作技巧
选择合适的抗原和抗体
确保抗原和抗体与待检测的样本高度特异性结合。
优化洗涤步骤
洗涤是ELISA实验的关键步骤，需要保证洗涤液的量和洗涤次数，以避免交叉反应。
选择合适的底物和终止液
双抗体夹心法
适用于检测大分子抗原，如蛋白质、多糖等，操作简单，特异性较强。
竞争法
适用于检测小分子半抗原抗原和游离抗原，如药物、激素等，操作简单，特异性较好。
酶联免疫吸附反应类型
包被：将抗原或抗体包被到固相载体表面。洗涤：去除未结合的抗原或抗体。加样：加入待测样本和酶标记的抗原或抗体。孵育：让抗原或抗体与固相载体上的抗体或抗原结合。洗涤：去除未结合的酶标记的抗原或抗体。加底物显色液：加入底物显色液，静置一段时间。终止反应：加入终止液，停止显色反应。测定：用酶标仪测定样本的光密度值，根据标准曲线计算抗原或抗体的浓度。
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游离的和结合的酶标记都存在于液相中，需用分离剂 分开后测结合状态的酶标记物的活性。
固相酶免疫测定
通过载体将结合状态的酶标记物吸附在固相支持物上， 只需洗涤就可将游离的酶标记物去除。以ELISA最常用。
酶联免疫吸附测定
(enzyme-linked immunosorbent assay ，ELISA)
常用的酶及显色底物
常用酶
底物
辣根过氧化物酶 （HRP）
碱性磷酸酶（AP）
邻苯二胺（OPD）
四甲基联苯胺 （TMB）
对硝基苯磷酸酯 （p-NPP）
加终止液前 颜色
橙黄色
蓝色
黄色
加终止液后 颜色
橙黄色
黄色
黄色
酶免疫技术类型（按抗原抗体系统的定位划分）
酶免疫组化
酶免疫技术
均相酶免疫测定（EMIT、CEDIA）
ELISA过程
1、包被 抗原(抗体)吸附在固相载体上称为包被。 2、复合物的形成 加待测抗体(抗原), 再加相应酶标记抗体(抗原), 生成抗原(抗体)--待测抗体(抗原)--酶标记抗体 的复合物。
3、酶与该酶底物反应 抗原(抗体)--待测抗体(抗原)--酶标记抗体复合 物与该酶的底物反应生成有色产物。 4、检测 借助分光光度计的光吸收计算抗体(抗原)的量。 待测抗体(抗原)的定量与有色产物成正比。
酶免疫增强测定技术（EMIT）
酶活性的抑制是由于标记抗原与抗体结合后空间位阻了酶 与底物结合的部位而造成的。反应模式竞争法，当未标记 抗原和标记抗原与限量的抗体竞争结合时，未标记抗原多， 竞争性的与抗体结合多，则标记抗原与抗体结合少，酶的 活性受到抑制少，酶活性高。最终测的酶活性与未标记的 抗原含量呈正相关。
ELISA的试剂
三个必要的试剂： （1）固相的抗菌素原（抗原）或抗体，即
“免疫吸附剂” （immunosorbent）； （2）酶标记的抗原或抗体，称为“结合物”
（conjugate）； （3）酶反应的底物。
完整的剂盒包含以下各组分：
（1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）； （2）酶标记的抗原或抗体（结合物）； （3）酶的底物； （4）阴性对照品和阳性对照品（定性测定中），参 考标准品和控制血清（定量测定中）； （5）结合物及标本的稀释液；
标本中抗原
+
抗体
ED
ED标记抗原
ED
+
EA
X
ED EA
活性酶
异相酶免疫测定
抗原抗体反应平衡后，体系中同时存在游离的和结合的酶 标记物，两种标记物上的酶都具活性，而只有结合的酶标 记物的形成与含量才代表待测物的存在与含量。故需将游 离的和结合的酶标记物分离，测定结合状态的酶标记物的 活性推算待测物的含量。由于分离方法不同，又分为
（6）洗涤液； （7）酶反应终止液。
1免疫吸附剂
已包被抗原或抗体的固相载体在低温（2-8℃） 干燥的条件下一般可保存6个月。 1.1 固相载体 固相载体在ELISA测定过程中作为吸附剂和容器，不 参与化学反应。 ELISA载体的形状主要有三种：微 量滴定板、小珠和小试管。国际上标准的微量滴定 板为8×12的96孔式。
1.5 包被的条件 抗体和蛋白质抗原一般采用pH9.6的碳酸盐缓冲液 作为稀释液，也有用pH7.2的磷酸盐缓冲液及pH7-8 的Tris-HCL缓冲液作为稀释液的。 通常在ELISA板孔中加入包被液后，在4-8℃冰箱中 放置过夜，37℃中保温2小时被认为具有同等的包 被效果。 一般蛋白质的包被浓度为100ng/ml-20ug/ml。 为防止包被后载体上留有未包被的空隙而导致本底 过高，常用1%--5%BSA封闭空隙。
2 结合物
酶标记的抗体（或抗原），是ELISA中最关键的试剂。 良好的结合物应具备： 既保有酶的催化活性，也保持了抗体（或抗原）的 免疫活性。 结合物中酶与抗体（或抗原）之间有恰当的分子比 例，在结合试剂中应尽量不含有或少含有未结合的 酶或抗体（或抗原）。 结合物要有良好的稳定性。
是在免疫酶技术(immunoenzymatic techniques)
的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术,
可用于测定抗原，也可用于测定抗体 。
ELISA的原理
将过量抗体（抗原）包被于载体上，通过抗原 抗体反应使酶标记抗体（抗原）也结合在载体 上，经洗涤去除游离的酶标记抗体（抗原）后 ，加入底物显色，定性或定量分析有色产物从 而确定待测物的存在与含量。
1.2 包被的方式 包被即是抗原或抗体结合到固相载体表面的过程。 IgG对聚苯乙烯等固相具有较强的吸附力，其联结 多发生在Fc段上，抗体结合点暴露于外，因此抗 体的包被一般均采用直接吸附法。 蛋白质抗原大多也可采用与抗体相似的方法包被。 可以采用间接的捕获包被法，即先将针对该抗原 的特异抗体作预包被，其后通过抗原抗体反应使 抗原固相化。
酶免疫技术 EIA
拟探讨的问题
酶免疫技术的定义 酶免疫技术的类型 ELISA的原理 ELISA的类型 ELISA的试剂（三个必要试剂） ELISA的过程
ELISA的操作要点 酶免疫技术的发展
概念
以酶标记的抗体（抗原）作为主要试剂，将抗原抗体反应 的特异性和酶催化底物反应的高效性和专一性结合起来的 一种免疫检测技术。
酶
抗体
酶
抗体
底物
酶 标记抗原
半抗原 （未标记）
克隆酶供体免疫分析（CEDIA）
酶是以供体和受体两个片段存在的，只有两个片段结 合在一起形成全酶才具有活性，当标记了供体酶的抗 原与抗体结合后就空间位阻了酶供体（ED）与酶受体 （EA）的结合，从而不能形成有活性的全酶，酶活性 受到抑制。反应模式为竞争性结合。最终测的酶活性 与未标记抗原的含量呈正相关。
DNA抗原的包被 紫外线照射（例如30W紫外灯，75cm照射12小时）
固相载体先用碱性蛋白质，如聚赖氨酸、鱼精蛋 白等作预包被，也可提高核酸的结合力。
用亲和素先包被载体，然后加入生物素化的DNA
脂类物质的包被
可将其在有机溶剂（例如乙醇）中溶解后加入 ELISA板孔中，开盖置冰箱过夜或冷风吹干，待 酒精挥发后，让脂质自然干固在固相表面。 抗心磷脂抗体的ELISA试剂一般采用这种包被方式。
酶免疫测定
液相酶免疫测定
异相酶免疫测定
固相酶免疫测定 （如ELISA）
均相酶免疫测定
利用酶标记物结合抗原抗体复合物后，标记酶的活性就 受到抑制，因而反应后不需分离结合的和游离的酶标记物， 直接测定系统中的总标记酶的活性的变化，即可确定结合 的酶标记物的数量，从而得到待测物的含量。常用于半抗 原如药物、激素、毒品、兴奋剂等的测定。