酶联免疫吸附详解
酶联免疫吸附法原理
酶联免疫吸附法原理酶联免疫吸附法（ELISA）是一种常用的免疫学实验技术，广泛应用于生物医学研究、临床诊断和生物制药等领域。
它通过酶与抗原或抗体的特异性结合来检测样品中特定的蛋白质分子，具有高灵敏度、高特异性和简便易行的特点。
下面将详细介绍酶联免疫吸附法的原理。
首先，酶联免疫吸附法的基本原理是利用酶标记的抗体或抗原与待检测的抗原或抗体结合，再通过酶底物的作用来间接或直接检测样品中的特定蛋白质。
整个实验过程可以分为固相吸附、特异性结合、非特异性结合和酶底物反应等步骤。
固相吸附是酶联免疫吸附法的第一步，通常将待检测的抗原或抗体通过物理吸附或共价结合的方式固定在固相载体（如微孔板）上。
这样做的目的是为了使待检测的抗原或抗体能够与酶标记的抗体或抗原发生特异性结合。
特异性结合是酶联免疫吸附法的关键步骤，它是指将酶标记的抗体或抗原与待检测的抗原或抗体发生特异性结合。
在这一步骤中，酶标记的抗体或抗原将与待检测的抗原或抗体形成免疫复合物，而非特异性结合则会被洗涤去除。
非特异性结合是指除了特异性结合外，固相载体上还可能存在一些非特异性结合的情况。
为了减少非特异性结合的干扰，需要通过洗涤的方式将非特异性结合的物质去除，以保证后续的酶底物反应的准确性和特异性。
最后，酶底物反应是酶联免疫吸附法的最后一步，当酶标记的抗体或抗原与待检测的抗原或抗体发生特异性结合后，加入酶底物后，酶将催化底物的变化，产生可测量的信号。
通过测定信号的强度或颜色的变化，可以间接或直接检测样品中特定蛋白质的含量或存在情况。
总的来说，酶联免疫吸附法是一种基于酶与抗原或抗体的特异性结合来检测特定蛋白质的技术。
它通过固相吸附、特异性结合、非特异性结合和酶底物反应等步骤，实现对样品中特定蛋白质的高灵敏度、高特异性的检测。
在实际应用中，酶联免疫吸附法已经成为生物医学研究和临床诊断中不可或缺的重要技术手段。
酶联免疫吸附测定技术
酶联免疫吸附测定技术酶联免疫吸附测定技术（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）是一种常用的分析方法，广泛应用于生物医学研究和临床诊断。
该技术的原理是利用特异性抗体与待测物发生特异性结合，通过酶的催化作用产生颜色反应或荧光信号，从而得到定量或半定量的结果。
下文将详细介绍ELISA的原理、反应步骤以及其应用领域。
一、ELISA的原理ELISA的原理基于抗原与抗体的特异性结合。
它包括固定期（Coating）、阻断期（Blocking）、结合期（Binding）、洗涤期（Washing）和检测期（Detection）五个关键步骤。
1. 固定期（Coating）首先，在微孔板中将待测物固定在表面，这一步又称为固相抗原法。
通常使用多糖、蛋白质等具有反应性的物质将待测物固定在微孔板上。
固定完毕后，洗去多余的待测物。
2. 阻断期（Blocking）为避免非特异性结合和降低背景干扰，需要在上一步后加入阻断缓冲液，如牛血清白蛋白（BSA）或鱼明胶等，使孔洞表面被占满，阻断非特异性吸附位点。
3. 结合期（Binding）加入待测样本和特异抗体，特异抗体可与待测物发生特异性结合，形成抗原-抗体复合物。
一般将待测物样本加入微孔板后，经过一段时间的孵育，使抗原与特异抗体发生结合。
4. 洗涤期（Washing）在结合期后，需进行洗涤步骤以去除未结合的物质。
洗涤缓冲液通常使用含有洗涤剂的磷酸盐缓冲液，洗涤次数及力度需充分保证去除干净。
5. 检测期（Detection）在洗涤期后，加入与特异抗体结合的酶标记二抗，例如辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗兔IgG。
经过孵育后，待测物与酶标记二抗形成复合物。
最后，加入底物使酶催化反应产生颜色或荧光信号。
二、ELISA的应用领域ELISA技术在生物医学研究和临床诊断中具有广泛的应用。
1. 生物医学研究ELISA被用于检测生物样本中的特定蛋白质、肽、抗体和核酸等。
酶联免疫吸附实验 (ELISA)
酶联免疫吸附实验(ELISA)1.实验目的酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay 简称ELISA）是在免疫酶技术（immunoenzymatic techniques）的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术,ELISA过程包括抗原（抗体）吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体（抗原）, 再加相应酶标记抗体（抗原）,生成抗原（抗体）－－待测抗体（抗原）－－酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。
借助分光光度计的光吸收计算抗体（抗原）的量。
待测抗体（抗原）的定量与有色产生成正比。
2.实验原理用于免疫酶技术的酶有很多，如过氧化物酶，碱性磷酸酯酶，β－D－半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰胆碱酯酶，6－磷酸葡萄糖脱氧酶等。
常用于ELISA法的酶有辣根过氧化物酶，碱性磷酸酯酶等，其中尤以辣根过氧化物酶为多。
由于酶催化的是氧化还原反应，在呈色后须立刻测定，否则空气中的氧化作用使颜色加深，无法准确地定量。
辣根过氧化物酶（HRP）是一种糖蛋白，每个分子含有一个氯化血红素（protonhemin）区作辅基。
酶的浓度和纯度常以辅基的含量表示。
氯化血红素辅基的最大吸收峰是403nm，HRP酶蛋白的最大吸收峰是275nm，所以酶的浓度和纯度计算式是（已知HRP的A（1cm 403nm 1%）＝25，式中1％指HRP百分浓度为100ml含酶蛋白1g，即10mg/ml，所以，酶浓度以mg/ml 计算是HRP的A（1cm 403nm mg/ml=2.5）HRP纯度（RZ）=A403nm/A275nm 纯度RZ（Ｒeinheit Zahl）值越大说明酶内所含杂质越少。
高纯度HRP的RZ值在3.0左右，最高可达3.4。
用于ELISA检测的HRP的RZ值要求在3.0以上。
ELISA的基本原理有三条：（1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性；（2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；（3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。
常见酶联免疫吸附试验及注意事项
常见酶联免疫吸附试验及注意事项在医学诊断领域中，酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种非常常见的技术方法，用于检测体液中的特定物质，如抗体、抗原、蛋白质等。
ELISA技术的广泛应用使得它成为了医学研究和临床诊断中不可或缺的工具。
本文将探讨ELISA技术的原理、分类、应用、优缺点及在实验中的注意事项。
一、ELISA的原理ELISA技术通过酶标记的抗体、抗原或其他蛋白质与待检测物质发生特异性反应，然后通过酶底物的变色反应来定量检测待检测物质的浓度。
根据不同的酶标记物，ELISA技术可以分为直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA和间接竞争ELISA等不同类型。
每种类型的ELISA 技术都有其特定的优点和适用范围，研究者需要根据具体的实验目的来选择合适的ELISA技术。
二、ELISA的分类1.直接ELISA直接ELISA是最简单的一种ELISA技术，它利用酶标记的抗体直接与待检测物发生特异性反应。
直接ELISA通常用来检测抗原或抗体，用于病原微生物和病原体的检测及特异性抗体的筛查。
2.间接ELISA间接ELISA利用待测抗体与被测物特异性结合后再加入酶标记的第二抗体结合，从而达到信号放大的目的，常用于病毒感染、免疫球蛋白筛查等领域。
3.竞争ELISA竞争ELISA通常用于检测浓度较低的抗原，其原理是待检测抗原与固定在板上的特异性抗体争夺酶标记抗体结合位点，由于酶标记的抗体数量一定，可根据酶底物底物的变色反应来计算出待检测抗原的浓度。
4.间接竞争ELISA间接竞争ELISA结合了间接ELISA和竞争ELISA的原理，可以用于检测抗体和病原微生物。
三、ELISA的应用ELISA技术在医学检验中具有广泛的应用，可以用于各种疾病的诊断、病原微生物的检测、血清学调查、感染性疾病的筛查等。
ELISA技术也被应用于生物医药领域，用于药物检测、蛋白质定量和特异性蛋白质筛查等。
四、ELISA的优缺点ELISA技术具有操作简便、灵敏度高、特异性强、多重自动化等优点，但也存在一些缺点，如试剂价格昂贵、结果受外界因素干扰、样本处理过程中易受污染等。
酶联免疫吸附测定名词解释
酶联免疫吸附测定名词解释酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一种用于检测生物样本中特定抗原或抗体的定量分析方法。
该方法结合了免疫学技术和酶学技术，可广泛应用于临床诊断、药物研发和生物学研究等领域。
ELISA的基本原理是利用特异性抗体与待测物质（抗原或抗体）结合，在固定的固相支持物上进行特异性结合。
通常情况下，ELISA方法包括四个主要步骤：涂覆、孵育、洗涤和检测。
1.涂覆：将特异性抗体或待测物质固定在微孔板的底部或其他固相材料上。
涂覆后，待测物质能够与后续加入的样本中的抗原或抗体结合。
2.孵育：将待测样本加入到涂覆好的微孔板中，样本中的抗原或抗体能够与固定在底部的特异性抗体结合。
3.洗涤：通过反复加入缓冲液并倒掉的方法，去除非特异性结合的物质，以减少干扰。
4.检测：加入与被测抗原或抗体结合的酶标记抗体，形成免疫复合物。
随后，再加入酶底物，使酶催化产生反应物。
根据反应物的产生量，可以定量测定待测物的浓度。
ELISA方法使用方便、操作简单，能够高效地进行大规模样本的处理和分析。
根据具体的检测目的和待测物质性质的不同，ELISA方法可分为直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA、夹心ELISA等不同类型。
此外，近年来还发展了一些改进的ELISA方法，如荧光ELISA和化学发光ELISA等。
ELISA方法在临床诊断中广泛应用，可以用于检测感染性疾病、自身免疫病、肿瘤标记物等。
此外，ELISA方法还可以用于药物研发，如筛选药物靶点、评估药物吸收、分布、代谢和排泄等。
在生物学研究中，ELISA方法可以用于分析蛋白质相互作用、表达水平的检测和鉴定、细胞因子测定等。
简述酶联免疫吸附测定的原理
简述酶联免疫吸附测定的原理酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一种高度敏感、高通量的免疫技术，常用于检测微量生物分子或抗体的存在与浓度。
ELISA的原理基于抗体与抗原之间高度特异性的结合，以及酶底物反应的可见色素反应。
ELISA的基本原理如下：1. 酶联：先将抗原或抗体固定在固相载体（如微孔板）上。
最常用的固相载体是聚丙烯酸酯（polystyrene），可以牢固地吸附抗原或抗体。
2.结合：在固相载体上固定的抗原与样品中的分子结合，以形成特异性的抗原-抗体复合物。
3.洗涤：为了去除非特异性结合的物质，需要进行反复的洗涤步骤。
4.检测：加入与目标分子相关的抗体，这些抗体经过标记，通常是酶标记。
这些标记的抗体与复合物中的目标分子结合。
5.洗涤：再次进行洗涤步骤，以去除非特异性结合的物质。
6.底物-酶反应：加入合适的底物，底物与酶标记的抗体发生反应，并产生可见的色素物质。
7.读数：用光度计测量反应物的吸光度，吸光度的强度与样品中目标物的浓度成正比。
ELISA的优点是具有高度的特异性和敏感性，可以检测极低浓度的物质。
此外，ELISA还可以同时检测多个样品，并且操作相对简单，不需要昂贵的设备。
ELISA的应用广泛，特别是在医学诊断领域。
例如，ELISA可以用来检测一些疾病的标志物，如乳腺癌、艾滋病、流感等。
此外，ELISA还用于酶抗体检测、药物监测、细菌和病毒的检测等领域。
虽然ELISA是一种非常有用的技术，但也存在一些局限性。
ELISA对样品中的杂质比较敏感，可能会导致假阳性结果。
此外，ELISA只能检测已知的抗原或抗体，无法发现新的目标分子。
此外，ELISA需要时间较长（通常需要2-4小时）。
综上所述，酶联免疫吸附测定（ELISA）是一种重要的免疫技术，通过抗原与抗体的特异结合和酶底物反应，可以准确、敏感地检测微量生物分子或抗体的存在与浓度。
酶联免疫吸附试验
技术创新：新型的酶联免疫吸附试验技术不断涌现如荧光标记技术、量子点标记技术等提高了检测的灵敏度和特异性。
市场需求：随着生物技术的不断发展酶联免疫吸附试验在临床诊断、食品安全、生物医药等领域的需求不断增长。
发展趋势：随着检测技术的不断进步酶联免疫吸附试验将朝着更快速、更准确、更自动化的方向发展。
应用领域拓展：酶联免疫吸附试验的应用领域不断拓展如肿瘤标志物检测、病毒检测、食品安全检测等为各领域的发展提供了有力支持。
荧光标记技术：提高灵敏度降低背景干扰
磁珠分离技术：快速分离抗原抗体提高试验速度
酶联免疫吸附试验在交叉学科领域的应用前景
酶联免疫吸附试验在生物医学领域的应用
酶联免疫吸附试验在环境监测领域的应用
酶联免疫吸附试验在农业科技领域的应用
酶联免疫吸附试验在食品安全检测领域的应用
酶联免疫吸附试验的市场需求与发展趋势
联合检测：将酶联免疫吸附试验与其他检测方法相结合提高检测的灵敏度和特异性。
标准化和规范化：建立酶联免疫吸附试验的标准化和规范化操作流程确保试验结果的准确性和可靠性。
酶联免疫吸附试验的发展趋势
PRT SIX
酶联免疫吸附试验的技术创新与突破
自动化技术：提高试验效率降低人为误差
微孔板技术：简化操作减少样本用量
PRT TWO
酶联免疫吸附试验的定义
酶联免疫吸附试验是一种常用的免疫分析技术
通过酶与抗体或抗原的结合实现对目标分子的定量或定性检测
酶可以放大信号提高检测的灵敏度和特异性
酶联免疫吸附试验广泛应用于生物学、医学等领域
酶联免疫吸附试验的原理
洗涤去除未结合的成分后加入底物显色通过颜色反应判断待测物的浓度。
阻断酶联免疫吸附试验：将抗体先固定在固相载体上再用酶标记的抗原进行检测最后加入底物显色。
酶联免疫吸附反应ELISA
假阳性或假阴性
05
ELISA实验数据分析和结果解读
通常采用四参数或三参数拟合曲线，以获得样品中目标抗原或抗体的浓度。
定量数据分析
阳性/阴性判断
数据方差分析
根据曲线设置的阈值，确定样本是阳性还是阴性。
比较不同样本间数据的变异程度，判断实验的重复性和稳定性。
03
数据分析方法
02
ห้องสมุดไป่ตู้01
当样本中存在目标抗原或抗体时，ELISA实验出现阳性反应，浓度高于阈值。
临床诊断
食品安全
生物毒素检测
科学研究
用于检测食品中的抗生素、农药残留等。
用于检测环境中的重金属、有机污染物等。
用于研究免疫系统、疾病发病机制等。
02
ELISA实验原理
免疫吸附反应
酶标记的抗原或抗体
底物显色
酶联免疫吸附反应原理
双抗原夹心法
适用于检测半抗原和小分子抗原，如病毒、细菌等，操作较复杂，特异性较好。
包被
将抗原或抗体包被到酶标板孔中，以便与样本中的相应抗体或抗原结合。
封闭
加入封闭液，封闭酶标板孔中的未结合位点。
实验操作技巧
选择合适的抗原和抗体
确保抗原和抗体与待检测的样本高度特异性结合。
优化洗涤步骤
洗涤是ELISA实验的关键步骤，需要保证洗涤液的量和洗涤次数，以避免交叉反应。
选择合适的底物和终止液
双抗体夹心法
适用于检测大分子抗原，如蛋白质、多糖等，操作简单，特异性较强。
竞争法
适用于检测小分子半抗原抗原和游离抗原，如药物、激素等，操作简单，特异性较好。
酶联免疫吸附反应类型
包被：将抗原或抗体包被到固相载体表面。洗涤：去除未结合的抗原或抗体。加样：加入待测样本和酶标记的抗原或抗体。孵育：让抗原或抗体与固相载体上的抗体或抗原结合。洗涤：去除未结合的酶标记的抗原或抗体。加底物显色液：加入底物显色液，静置一段时间。终止反应：加入终止液，停止显色反应。测定：用酶标仪测定样本的光密度值，根据标准曲线计算抗原或抗体的浓度。
酶联免疫吸附试验基本原理与结果解释
酶联免疫吸附试验基本原理与结果解释酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）是一种常用的生物化学实验技术，用于检测特定抗原或抗体的存在与含量。
ELISA的基本原理是将待测样品（包括血清、尿液、细胞上清等）中的特定抗原或抗体与固定在试验板上的相应抗体或抗原发生特异性结合，并通过对这些结合物进行酶标记和酶底物的可观察物质转换反应来检测和定量目标物质。
ELISA试验通常包括以下步骤：1. 试验板涂布（Coating）：将固定抗体或抗原溶液加入试验孔中，使其在孔底的固相材料上均匀覆盖，并通过二次交联方法固定在试验孔上。
2. 阻断（Blocking）：加入一种无特异性结合的蛋白质溶液（例如牛血清蛋白，BSA），覆盖试验孔以消除试验系统的非特异性吸附。
3. 样品加入（Sample addition）：将待测样品加入试验孔中，使其与固相抗体或抗原结合。
4. 洗涤（Washing）：通过多次洗涤，去除未结合的物质，减少非特异性背景信号。
5. 标记抗体或抗原加入（Addition of labeled antibody or antigen）：加入与待测样品中抗原（或抗体）特异性结合的酶标记（例如辣根过氧化物酶-HRP、碱性磷酸酶-AP等）的抗体（或抗原），形成“抗原-抗体-酶标记抗体（或抗原）”复合物。
6. 洗涤（Washing）：通过多次洗涤，去除未结合的酶标记抗体或抗原。
7. 酶底物加入（Addition of enzyme substrate）：加入与酶标记反应产物结合并形成可观察物质的底物。
8. 反应停止（Stop reaction）：加入酶反应停止溶液，终止底物的转化反应。
9. 读取结果（Readout）：使用吸光度检测仪器测量试验孔中产生的可观察物质，如颜色产物的吸光度，根据标准曲线计算样品中目标物质的浓度。
通过测量吸光度值的变化，可以对目标物质的含量进行定量或半定量分析。
酶联免疫吸附试验
酶联免疫吸附试验
四、全自动酶免工作站
1、加 样 模 块 2、孵 育 模 块 3、洗 板 模 块 4、读 数 模 块 5、控 制 模 块（软件）
医院 计生站 疾控中心
全自动--从加样、孵育、洗涤到数据处理打印报告都由仪器自动完成； 无污染--直接使用原样本试管和原试剂瓶，消除生物污染和试剂污染； 高效率--一次性处理样本量大；
酶联免疫吸附试验
一、酶联免疫吸附试验（ELISA）概述
▲ 基本原理： 抗原抗体的特异性结合以及抗SA）概述
酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定 是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量 成正比例的，可根据已知浓度的抗原或抗体的颜色反应的深浅绘制标准曲线并 依此计算出未知样品中抗体或抗原的浓度。
从而引起动物产生抗体或形成致敏淋巴细胞，并能和抗体或致敏淋巴细胞发生 特异性反应的物质。
抗体：是由抗原刺激动物的免疫系统后，由免疫系统产生分泌的能和相 应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。
酶结合物：酶与抗体或抗原、半抗原在交联剂作用下联结的产物,它不仅 具有抗体抗原特异的免疫反应，还能催化酶促反应，显示出生物放大作用。
（药品冷藏箱（2~8℃）） 结果分 析
吸光度 测量
孵育
加入终 止液
酶联免疫吸附试验
三、酶联免疫吸附试验（ELISA）操作流程
例：饲料中黄曲霉毒素B1的检测
天平
粉碎机
电动振荡器
移液器
酶联免疫吸附试验
离心机
三、酶联免疫吸附试验（ELISA）操作流程
酶联免疫吸附法
酶联免疫吸附试验ELISA一种酶联免疫技术。
用于检测包被于固相板孔中的待测抗原（或抗体）。
即用酶标记抗体，并将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗原抗体反应在固相载体表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除，最后通过酶作用于底物后显色来判断结果。
酶联免疫吸附试验（以下简称ELISA）:是酶免疫测定技术中应用最广的技术。
其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体（聚苯乙烯微量反应板）表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除。
常用的ELISA法有双抗体夹心法和间接法，前者用于检测大分子抗原，后者用于测定特异抗体。
ELISA方法的基本原理是酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。
此种酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。
滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，出现颜色反应。
因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。
此种显色反应可通过ELISA检测仪进行定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。
用于标记抗体或抗抗体的酶须具有下列特性：有高度的活性和敏感性；在室温下稳定；反应产物易于显现；能商品化生产。
目前应用较多的有辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等，其中以HRP应用最广。
1•辣根过氧化物酶（HRP）过氧化物酶广泛分布于植物中，辣根中含量最咼，从辣根中提取的称辣根过氧化物酶（HRP），是由无色酶蛋白和深棕色的铁卟啉构成的一种糖蛋白（含糖量18%）,分子量约40000,约由300个氨基酸组成，等电点为pH3-9，催化反应的最适pH值因供氢体不同而稍有差异，一般多在pH5左右。
此酶溶于水和50%饱和度以下的硫酸铵溶液。
酶联免疫吸附试验(双抗夹心法)原理
酶联免疫吸附试验（ELISA），又称酶联免疫吸附测定法，是目前广泛用于生物化学和免疫学领域的一种重要实验方法。
该技术结合了免疫学和生物化学的原理，能够高灵敏、高特异地检测抗原或抗体的存在，对临床诊断、生物医学研究以及生物制药等领域有着广泛的应用。
在本文中，我们将深入探讨酶联免疫吸附试验的原理、方法和应用。
一、酶联免疫吸附试验原理酶联免疫吸附试验的原理主要是利用酶标记抗体、抗原和底物的相互作用来检测特定物质的存在。
在双抗夹心法中，试验基本步骤如下：1. 用待测抗原溶液在固相酶标记抗体包被的微孔板上，充分接触和结合。
2. 经洗涤后，底物溶液被加入，并与酶标记抗体包被的复合物结合。
3. 底物受酶催化分解后，生成有色产物，通过比色法测定其光密度，间接测定抗原的含量。
在实验过程中，我们不能忽视的是标本处理、试剂选用、仪器操作等一系列实验细节，这些都对实验结果的准确性和重复性有着重要的影响。
二、酶联免疫吸附试验的方法不同类型的酶联免疫吸附试验方法包括间接法、夹心法、竞争法和直接法等。
在这次我们重点讨论的是双抗夹心法。
该方法通过将待测抗原与固相酶标记抗体和液相抗体结合，从而提高了对待测抗原的灵敏度和特异性。
这种方法在免疫学研究、传染病诊断和药物检测等方面具有重要的应用价值。
除了双抗夹心法，间接法通过检测待测抗体也是常用的酶联免疫吸附试验方法。
在实验设计中，根据不同的研究目的和样本特性，我们可以选择不同的方法来进行实验设计和操作。
三、酶联免疫吸附试验的应用酶联免疫吸附试验在临床诊断、疫苗研制、传染病监测、生物药品开发等领域有着广泛的应用。
它能够高灵敏、高特异地检测抗原或抗体的存在，为疾病诊断和药物研发提供了重要的技术支持。
在临床诊断中，酶联免疫吸附试验被广泛应用于传染病的早期诊断和鉴定。
HIV抗体检测、甲型肝炎抗原检测等都是通过酶联免疫吸附试验来完成的。
酶联免疫吸附试验还被应用于药物和疫苗的开发和监控过程中，能够全面地评价新药和疫苗的免疫原性和保护效果。
酶联免疫吸附试验名词解释
酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked Immunosorbent Assay,ELISA）简介酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种常用的实验技术，用于检测、定量和分析各种生物分子，特别是蛋白质和抗原。
这种试验利用抗原-抗体的特异性结合来实现检测和定量。
背景ELISA是20世纪70年代发展起来的一种高效、灵敏的检测方法。
它的简单性、灵敏度和特异性使其成为临床诊断、生物学研究和药物开发的重要工具。
ELISA技术已经广泛应用于病毒感染、癌症诊断、蛋白质表达和分泌等各个领域。
原理ELISA的原理基于抗原-抗体的相互作用。
试验中，由于抗原与抗体的结合是高度特异性的，所以ELISA可以用于检测和定量抗体、抗原或其他蛋白质。
一般而言，ELISA试验包括以下几个步骤：1.涂布：将待测样品中的抗原或抗体进行固定，在多孔板或其他固相载体上形成固定层。
2.孵育：加入特异性的抗体或抗原，使其与固定在载体上的分子发生特异性结合。
3.洗涤：去除未结合的抗体或抗原，从而提高特异性和灵敏度。
4.检测：加入检测抗体，使其与待测分子结合。
5.酶标记：使用酶标记的抗体或底物，使其与待测分子结合形成酶标记复合物。
6.洗涤：去除未结合的抗体和底物，减少背景信号。
7.反应：加入底物，使其与酶结合产生染色反应。
8.测量：通过光谱或其他方法测量染色产物的光强度或颜色变化。
应用ELISA技术可以用于各种不同的应用领域，包括但不限于：1. 医学诊断ELISA可以通过检测特定抗体或抗原的存在来进行疾病诊断。
例如，ELISA可以被用于检测病毒感染、抗体水平、癌症标志物等。
2. 药物研发ELISA可以用于评估药物的疗效和安全性。
通过测量药物对特定抗体或抗原的结合能力，可以评估药物的亲和力和效力。
3. 蛋白质表达和分泌ELISA可以用于检测和定量蛋白质的表达和分泌水平。
这对于研究蛋白质的功能、相互作用和调控机制非常重要。
4. 疫苗开发ELISA可以用于评估疫苗的效力和免疫反应。
酶联免疫吸附测定法
酶联免疫吸附测定法（ELISA）1.定义 (3)2.原理 (3)2.1抗原抗体反应 (3)2.2免疫测定在临床检验中的应用 (5)3.ELISA的类型 (5)3.1双抗体夹心法测抗原： (6)3.2双抗原夹心法测抗体 (6)3.3间接法测抗体 (6)3.4竞争法测抗体 (7)3.5竞争性测抗原 (7)3.6捕获包被法测抗体 (7)3.7ABS-ELISA法 (8)4.ELISA试剂的组成 (9)4.1固相载体： (9)4.2包被的方式 (9)4.3包被用抗原：天然抗原、重组抗原、合成多肽抗原。
(10)4.4包被的条件： (10)4.5洗涤液： (10)4.7酶的催化性； (11)4.8结合物的制备 (11)4.9结合物的保存 (12)4.10酶的底物 (12)4.11酶反应终止液 (12)4.12参考标准品 (13)4.13加样： (13)4.14保温 (13)4.15保温方式： (13)4.16室温温育的反应 (13)4.17洗涤 (14)4.18显色 (14)4.19比色 (14)4.20酶标比色仪 (15)4.21结果判定 (15)4.22定量测定 (16)4.23ELISA的操作要点 (16)1.定义酶联免疫吸附测定法（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay），简称ELISA，采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，对受检物质进行定性或定量分析的一种检测方法。
2.原理采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，可对受检物质的定性或定量分析。
2.1抗原抗体反应2.1.1可逆性抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡，其反应式为：Ag+Ab→Ag·Ab抗体的亲和力（affinity），可以用平衡常数K表示：K=[Ag·Ab]／[Ag][Ab]，Ag·Ab的解离程度与K值有关。
酶联免疫吸附测定法elisa
酶联免疫吸附测定法elisa酶联免疫吸附测定法（ELISA）的原理酶联免疫吸附测定法（ELISA）是一种广泛用于生物医学研究和诊断的免疫分析技术。
ELISA 的原理基于抗原抗体特异性结合的原理，通过标记酶的抗体来检测目标抗原或抗体。
ELISA 的种类根据检测方法的不同，ELISA 可分为以下几种类型：直接 ELISA：将待测样品直接加入固定在微孔板上的抗原或抗体上，然后用标记酶的抗体检测。
夹心 ELISA：微孔板固定一层捕获抗体，待测样品通过捕获抗体与检测抗体结合，然后用标记酶的抗体检测。
竞争性 ELISA：待测样品与标记抗原竞争结合固定在微孔板上的抗体，标记抗原和待测样品结合量成反比。
ELISA 的步骤ELISA 的主要步骤包括：抗原或抗体固定：将待测抗原或抗体固定在微孔板上。
样品孵育：将待测样品加入微孔板，进行孵育。
洗涤：去除未结合的样品。
添加标记抗体：加入标记酶的抗体，再次孵育。
洗涤：去除未结合的标记抗体。
底物反应：加入底物，酶促反应产生有色产物。
终止反应：加入终止液，停止酶促反应。
测量吸光度：测量有色产物的吸光度，吸光度与样品中抗原或抗体浓度成正比。
应用ELISA 具有灵敏度高、特异性强、操作简便等特点，广泛应用于以下领域：诊断：检测传染性疾病（如艾滋病毒、乙肝）、自身免疫疾病（如类风湿性关节炎）、癌症标志物等。
研究：研究抗原抗体相互作用、免疫应答、药物开发等。
食品安全：检测食品中的残留农药、抗生素等。
环境检测：检测水体或土壤中的污染物。
注意事项进行 ELISA 时需要注意以下事项：抗体的特异性和亲和力：使用的抗体必须具有高特异性和亲和力，以确保准确的检测结果。
样品准备：样品应经过适当的处理，去除干扰物质，以获得准确的结果。
优化条件：ELISA 反应条件（如孵育时间、温度）应经过优化，以获得最佳检测灵敏度和特异性。
背景信号：应使用阴性对照进行检测，以去除背景信号的影响。
质量控制：应使用已知浓度的标准品进行质量控制，以确保检测结果的准确性和可重复性。
酶联免疫吸附剂测定名词解释
酶联免疫吸附剂测定名词解释
酶联免疫吸附剂测定(酶联免疫吸附剂测定,简称酶联测定)是一种用于检测生物分子浓度和活性的实验室方法,通常用于测定蛋白质、核酸、抗体等生物分子的浓度和活性。
酶联测定中,酶和吸附剂被固定在一起,形成一个酶-吸附剂复合物。
当生物分子通过这种复合物进入检测系统时,会被吸附在复合物上,并随着复合物的移动而被检测器检测到。
这种技术可以提高检测灵敏度和特异性,同时减少非特异性反应的干扰。
酶联测定中常用的吸附剂包括葡萄糖凝胶、磷酸凝胶、凝胶电泳剂等。
葡萄糖凝胶常用于检测蛋白质浓度,因为它可以吸附蛋白质,并且可以保持蛋白质的稳定性和流动性,使得蛋白质的检测更加高效和准确。
磷酸凝胶常用于检测核酸浓度和活性,因为它可以吸附核酸,并且可以提高核酸的分辨率和检测效率。
凝胶电泳则常用于检测抗体的浓度和活性,因为它可以检测抗体的特异性和灵敏度,并且可以分离和纯化抗体。
除了吸附剂和酶的选择外,酶联测定的制备和检测过程也需要一定的技术和知识。
例如,需要对吸附剂和酶进行适当的配对和融合,以保证吸附剂和酶的稳定性和活性。
还需要对检测系统进行优化和校准,以确保其准确性和可靠性。
酶联测定是一种高效、灵敏、准确的生物分子检测方法,可以用于测定多种生物分子的浓度和活性,包括蛋白质、核酸、抗体等。
随着酶联测定技术的不断发展和完善,它将成为生物学研究和实验室分析中不可或缺的工具。
实验二_酶联免疫吸附实验(ELISA)
实验二酶联免疫吸附实验（ELISA）一、实验目的熟练掌握ELISA 技术二、实验原理酶联免疫吸附实验（ELISA）是目前应用最多的免疫酶技术, 它是使抗原或抗体吸附于固相载体, 使随后进行的抗原抗体反应均在载体表面进行, 从而简化了分离步骤, 提高了灵敏度, 即可检测抗原, 也可检测抗体。
实验方法包括间接法、夹心法及竞争法。
为了检测抗原可用夹心法。
将特异性抗体吸附在固相载体（聚苯乙烯制成的小管、小盘或小孔）上, 然后加被测溶液, 倘样品中有相应抗原, 则与抗体在载体表面形成复合物。
洗涤后加入酶标记的特异性抗体, 后者通过抗原也结合到载体的表面。
洗去过剩的标记抗体, 加入酶的底物, 在一定时间内经酶催化产生的有色产物的量与溶液中抗原含量成正比, 可用肉眼观察或分光光度计测定。
为了检测抗体可用间接法。
使抗原吸附于载体上, 然后加入被测血清, 如有抗体, 则与抗原在载体上形成复合物。
洗涤后加酶标记的抗球蛋白（抗抗体）与之反应。
洗涤后加底物显色, 有色产物的量与抗体的量成正比。
本实验使用的乙型肝炎病毒表面抗体诊断试剂盒是采用双抗原夹心法检测抗-HBs, 即采用纯化HBsAg 包被反应板, 加入待测标本, 同时加入HBsAg-HRP, 当标本中存在抗-HBs 时,该抗-HBs 与包被HBsAg 结合并与酶结合物形成HBsAg-抗-HBs-HBsAg-HRP 复合物, 加入TMB 底物产生显色反应, 反之则无显色反应。
三、实验仪器和试剂1.仪器设备: 微量移液器、恒温箱2.试剂和材料（1）蒸馏水（2）人血清样品（3）乙型肝炎病毒表面抗体检测试剂盒四、实验步骤和注意事项1.实验准备: 从冷藏环境中取出试剂盒, 在室温下平衡30 分钟, 同时将浓缩洗涤液作1: 20 稀释。
2.加待测标本: 加入待测标本每孔0.05 毫升, 并设抗-HBs 阳性对照2 孔, 抗-HBs 阴性对照2 孔, 空白对照1 孔。
（试剂使用前应摇匀, 并弃去1-2 滴后垂直滴加, 注意均匀用力）3.加酶结合物: 每孔0.05 毫升, 空白对照孔不加, 充分混匀, 置37℃孵育30 分钟。
免疫酶联吸附法
免疫酶联吸附法是一种常用的生物检测技术，它利用抗原抗体反应的特异性来检测样品中的目标物质。
该方法具有灵敏度高、特异性强、分析范围广、结果准确等优点，因此在医学、生物化学、食品安全等领域得到了广泛应用。
免疫酶联吸附法的原理基于抗原抗体反应。
首先，样品中的目标物质与特异性抗体结合，形成一个复杂的复合物。
然后，免疫复合物被转移到固相支持物（如聚苯乙烯分子）上，通过洗涤去除未结合的免疫复合物。
接下来，加入一种酶标记的抗抗体，该抗抗体能够与剩余的免疫复合物结合。
最后，通过显色反应或荧光反应等观察和分析免疫复合物的数量，从而确定样品中目标物质的存在和浓度。
免疫酶联吸附法的优点包括高灵敏度、高特异性、可重复性和易于自动化。
该方法适用于多种样品类型，如血清、血浆、组织切片等。
在食品安全领域，免疫酶联吸附法可用于检测食品中的有害物质，如农药残留、兽药残留等。
在临床诊断中，该方法可用于检测病毒、细菌、肿瘤标志物等生物标志物。
此外，免疫酶联吸附法还可以与其他技术相结合，如质谱技术、基因测序技术等，以实现更精确的生物标志物检测和疾病诊断。
免疫酶联吸附法的应用范围非常广泛，涉及到食品安全、临床诊断、生物科学研究等多个领域。
在食品安全领域，免疫酶联吸附法可用于检测农药残留和兽药残留等有害物质，保障公众健康。
在临床诊断中，该方法可用于检测各种疾病相关的生物标志物，如肿瘤标志物、病毒感染等，为医生提供更准确的诊断依据。
此外，免疫酶联吸附法还可以应用于生物科学研究，为基因表达、蛋白质相互作用等领域的研究提供有力支持。
总之，免疫酶联吸附法是一种重要的生物检测技术，具有高灵敏度、高特异性、可重复性和易于自动化等优点。
在食品安全、临床诊断、生物科学研究等领域中具有广泛的应用前景。
随着技术的不断进步，免疫酶联吸附法有望在未来的生物检测领域发挥更加重要的作用。
酶联免疫吸附实验详解
酶联免疫吸附实验详解1. ELISA的原理ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。
结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。
在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。
用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。
再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。
此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。
加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。
由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。
2. ELISA的类型ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。
在这种测定方法中有三个必要的试剂：（1）固相的抗菌素原或抗体，即"免疫吸附剂"（immunosorbent）；（2）酶标记的抗原或抗体，称为"结合物"（conjugate）；（3）酶反应的底物。
根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件，可设计出各种不同类型的检测方法。
用于临床检验的ELISA主要有以下几种类型：2.2.1 双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：1）将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。
洗涤除去未结合的抗体及杂质。
2）加受检标本，保温反应。
标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。
洗涤除去其他未结合物质。
3）加酶标抗体，保温反应。
固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。
彻底洗涤未结合的酶标抗体。
此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。
4）加底物显色。
固相上的酶催化底物成为有色产物。
通过比色，测知标本中抗原的量。
在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。
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游离的和结合的酶标记都存在于液相中，需用分离剂 分开后测结合状态的酶标记物的活性。
固相酶免疫测定
通过载体将结合状态的酶标记物吸附在固相支持物上， 只需洗涤就可将游离的酶标记物去除。以ELISA最常用。
酶联免疫吸附测定
(enzyme-linked immunosorbent assay ，ELISA)
常用的酶及显色底物
常用酶
底物
辣根过氧化物酶 （HRP）
碱性磷酸酶（AP）
邻苯二胺（OPD）
四甲基联苯胺 （TMB）
对硝基苯磷酸酯 （p-NPP）
加终止液前 颜色
橙黄色
蓝色
黄色
加终止液后 颜色
橙黄色
黄色
黄色
酶免疫技术类型（按抗原抗体系统的定位划分）
酶免疫组化
酶免疫技术
均相酶免疫测定（EMIT、CEDIA）
ELISA过程
1、包被 抗原(抗体)吸附在固相载体上称为包被。 2、复合物的形成 加待测抗体(抗原), 再加相应酶标记抗体(抗原), 生成抗原(抗体)--待测抗体(抗原)--酶标记抗体 的复合物。
3、酶与该酶底物反应 抗原(抗体)--待测抗体(抗原)--酶标记抗体复合 物与该酶的底物反应生成有色产物。 4、检测 借助分光光度计的光吸收计算抗体(抗原)的量。 待测抗体(抗原)的定量与有色产物成正比。
酶免疫增强测定技术（EMIT）
酶活性的抑制是由于标记抗原与抗体结合后空间位阻了酶 与底物结合的部位而造成的。反应模式竞争法，当未标记 抗原和标记抗原与限量的抗体竞争结合时，未标记抗原多， 竞争性的与抗体结合多，则标记抗原与抗体结合少，酶的 活性受到抑制少，酶活性高。最终测的酶活性与未标记的 抗原含量呈正相关。
ELISA的试剂
三个必要的试剂： （1）固相的抗菌素原（抗原）或抗体，即
“免疫吸附剂” （immunosorbent）； （2）酶标记的抗原或抗体，称为“结合物”
（conjugate）； （3）酶反应的底物。
完整的剂盒包含以下各组分：
（1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）； （2）酶标记的抗原或抗体（结合物）； （3）酶的底物； （4）阴性对照品和阳性对照品（定性测定中），参 考标准品和控制血清（定量测定中）； （5）结合物及标本的稀释液；
标本中抗原
+
抗体
ED
ED标记抗原
ED
+
EA
X
ED EA
活性酶
异相酶免疫测定
抗原抗体反应平衡后，体系中同时存在游离的和结合的酶 标记物，两种标记物上的酶都具活性，而只有结合的酶标 记物的形成与含量才代表待测物的存在与含量。故需将游 离的和结合的酶标记物分离，测定结合状态的酶标记物的 活性推算待测物的含量。由于分离方法不同，又分为
（6）洗涤液； （7）酶反应终止液。
1免疫吸附剂
已包被抗原或抗体的固相载体在低温（2-8℃） 干燥的条件下一般可保存6个月。 1.1 固相载体 固相载体在ELISA测定过程中作为吸附剂和容器，不 参与化学反应。 ELISA载体的形状主要有三种：微 量滴定板、小珠和小试管。国际上标准的微量滴定 板为8×12的96孔式。
1.5 包被的条件 抗体和蛋白质抗原一般采用pH9.6的碳酸盐缓冲液 作为稀释液，也有用pH7.2的磷酸盐缓冲液及pH7-8 的Tris-HCL缓冲液作为稀释液的。 通常在ELISA板孔中加入包被液后，在4-8℃冰箱中 放置过夜，37℃中保温2小时被认为具有同等的包 被效果。 一般蛋白质的包被浓度为100ng/ml-20ug/ml。 为防止包被后载体上留有未包被的空隙而导致本底 过高，常用1%--5%BSA封闭空隙。
2 结合物
酶标记的抗体（或抗原），是ELISA中最关键的试剂。 良好的结合物应具备： 既保有酶的催化活性，也保持了抗体（或抗原）的 免疫活性。 结合物中酶与抗体（或抗原）之间有恰当的分子比 例，在结合试剂中应尽量不含有或少含有未结合的 酶或抗体（或抗原）。 结合物要有良好的稳定性。
是在免疫酶技术(immunoenzymatic techniques)
的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术,
可用于测定抗原，也可用于测定抗体 。
ELISA的原理
将过量抗体（抗原）包被于载体上，通过抗原 抗体反应使酶标记抗体（抗原）也结合在载体 上，经洗涤去除游离的酶标记抗体（抗原）后 ，加入底物显色，定性或定量分析有色产物从 而确定待测物的存在与含量。
1.2 包被的方式 包被即是抗原或抗体结合到固相载体表面的过程。 IgG对聚苯乙烯等固相具有较强的吸附力，其联结 多发生在Fc段上，抗体结合点暴露于外，因此抗 体的包被一般均采用直接吸附法。 蛋白质抗原大多也可采用与抗体相似的方法包被。 可以采用间接的捕获包被法，即先将针对该抗原 的特异抗体作预包被，其后通过抗原抗体反应使 抗原固相化。
酶免疫技术 EIA
拟探讨的问题
酶免疫技术的定义 酶免疫技术的类型 ELISA的原理 ELISA的类型 ELISA的试剂（三个必要试剂） ELISA的过程
ELISA的操作要点 酶免疫技术的发展
概念
以酶标记的抗体（抗原）作为主要试剂，将抗原抗体反应 的特异性和酶催化底物反应的高效性和专一性结合起来的 一种免疫检测技术。
酶
抗体
酶
抗体
底物
酶 标记抗原
半抗原 （未标记）
克隆酶供体免疫分析（CEDIA）
酶是以供体和受体两个片段存在的，只有两个片段结 合在一起形成全酶才具有活性，当标记了供体酶的抗 原与抗体结合后就空间位阻了酶供体（ED）与酶受体 （EA）的结合，从而不能形成有活性的全酶，酶活性 受到抑制。反应模式为竞争性结合。最终测的酶活性 与未标记抗原的含量呈正相关。
DNA抗原的包被 紫外线照射（例如30W紫外灯，75cm照射12小时）
固相载体先用碱性蛋白质，如聚赖氨酸、鱼精蛋 白等作预包被，也可提高核酸的结合力。
用亲和素先包被载体，然后加入生物素化的DNA
脂类物质的包被
可将其在有机溶剂（例如乙醇）中溶解后加入 ELISA板孔中，开盖置冰箱过夜或冷风吹干，待 酒精挥发后，让脂质自然干固在固相表面。 抗心磷脂抗体的ELISA试剂一般采用这种包被方式。
酶免疫测定
液相酶免疫测定
异相酶免疫测定
固相酶免疫测定 （如ELISA）
均相酶免疫测定
利用酶标记物结合抗原抗体复合物后，标记酶的活性就 受到抑制，因而反应后不需分离结合的和游离的酶标记物， 直接测定系统中的总标记酶的活性的变化，即可确定结合 的酶标记物的数量，从而得到待测物的含量。常用于半抗 原如药物、激素、毒品、兴奋剂等的测定。