酶联免疫吸附分析实验
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酶联免疫吸附试验测定方法
enzyme-linked immunosorbent assay , ELISA
主要内容
• • • • 什么是酶联免疫吸附分析法 ELISA的原理 ELISA的类型和方法 ELISA的应用实例
酶免疫组化 酶免疫技术 酶免疫测定 非均相酶免疫测定 液相酶免疫测定 均相酶免疫测定 固相酶免疫测定
（二）ELISA间接法测定抗体
包被固相载体: 用已知抗原包被 固相载体 加待检标本: 使相应抗体与固相抗原结合 洗涤，除去无关的物质 加酶标抗抗体: 与固相载体上抗原抗体 复合物结合；洗涤，除去 未结合的酶标抗抗体
加底物 显色 根据颜色反应的程度进行 该抗原的定性或定量测定
该法的优点是只要变换包被抗原就可 以利用同一酶标记抗体。成功的关键 在于高纯度的抗原。 在病源抗体的检测中有很好的应用
• （六）应用亲和素和生物素的ELISA
（一）双抗体夹心法（double antibody sandwich method ）
• 1、实验步骤
（1）将特异性抗体与固相载体连
接，形成固相抗体
•
形成固相抗体后洗涤除去未结合的抗体 及杂质。
（2）加受检标本
• 使之与固相抗体接触反应一段时间，让 标本中的抗原与固相载体上的抗体结合， 形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未 结合的物质。
（五）捕获法测IgM抗体
• 血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异 性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测 定。因此测定IgM抗本多用捕获法，先将所 有血清IgM（包括异性IgM和非特异性IgM） 固定在固相上，在去除IgG后再测定特异性 IgM。操作步骤如下：
1）将IgM抗体连接在固相载体上，形成固相抗体IgM。洗涤。 2）加入稀释血清标本：保温反应后血清中的IgM抗体被固相抗 体捕获，洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分。 3）加特异性抗原试剂：它只与固相上的特异性IgM结合。洗涤。 4）加入针对特异性的酶标抗体：使之与结合在固相上的抗原反 应结合。洗涤。 5）加底物显色：如有颜色显示，则表示血清标本中的特异性 IgM抗体存在，是为阳性反应。
（六）应用亲和素和生物素的ELISA
亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD， 每个分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子亲密结合。 现在使用更多的是从链霉菌中提取的链霉和素 （strepavidin）。生物素（biotin）又称维生素H，分子量 244.31，存在于蛋黄中。 用化学方法制成的衍生物，生物素－羟基琥珀亚胺酯 （biotin-hydroxysuccinimide，BNHS）可与蛋白质、糖类 和酶等多种类型的大小分子形成生物素化的产物。亲和素 与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力 大，两者一经结合就极为稳定。由于1个亲和素分子有4个 生物素分子的结合位置，可以连接更多的生物素化的分子， 形成一种类似晶格的复合体。因此把亲和素和生物素与 ELIS偶联起来，就可大提高ELISA的敏感度。
显色 反应
橘红色 黄色 棕色 兰色 蓝绿色
测定波长
492 460 449 425 642 400 500 405 420 360,450 420
碱性磷酸酯酶 葡萄糖氧化酶
黄色 红色 黄色 深蓝色 荧光 黄色
β-Ｄ－半乳糖 苷酶
ELISA的类型和方法
• • • • • （一）双抗体夹心法 （二）间接法 （三）竞争法 （四）双位点一步法 （五）捕获法测IgM抗体
黄曲霉毒素B1(AFB1)酶联免疫定 量检测方法
• 实验所需提供的耗材物品：微孔板包被有AFB1BSA5个浓度的AFB1标准溶液(各0.5mL)。标准1： 0ng/mL可直接使用；标准2：0.1ng/m可直接使用； 标准3：0.2ng/mL可直接使用；标准4：0.5ng/m 可直接使用；标准5：1.0ng/m可直接使用；抗AF B1单克隆抗体溶液(6mL)可直接使用；酶标物 (12mL)可直接使用；显色液(12mL)可直接使用； 终止液(6mL)可直接使用；浓缩洗液(30mL) 稀释 使用；微孔板酶标仪(可于450nm处测定)、振荡 器、粉碎机、微量移液器；量筒、漏斗、容量瓶、 快速定性滤纸；氯化钠(分析纯)、甲醇(分析纯)、 去离子水或蒸馏水。
• ELISA 普遍用作非放射性同位素的成键化 验. 在这种方法中, 通常标准配体是固定的, 通过加入溶液相受体或蛋白质来使之成键. 通过加入与受体特异性反应的抗体来定量 成键的受体, 而且最初抗体的量以加入第二 种能显色的抗体测量. 第二种抗体能识别抗 体的末端, 在其末端的碱性磷酸酯或过氧化 物酶等与酶发生反应, 从而使溶液显色.
检测实验中酶免疫分析程序
1、浓缩洗液为10倍浓缩液，使用时与去离子水或蒸馏水按体 积比1:9稀释后使用。 2、取所需数量的板条插入微孔架，用洗液洗涤微孔板3min×2 次。 3、加入50mL标准品或处理好的样品到微孔，记录样品及标准 的位置，每个标准和样品必须使用新的吸头。 4、加入50mL抗体溶液到每个微孔(注意移液器管尖不要接触到 孔中的液体，避免交叉污染)中，37℃孵育90min。甩掉孔中 液体，用洗液洗涤微孔板3min×3次，最后一次应在吸水纸 上拍打以完全除去孔中液体。每孔加入酶标物100mL，37℃ 孵育60min。用洗液洗涤微孔板3min×5次，最后一次应在 吸水纸上拍打以完全除去孔中液体。 5、每孔加入显色液100mL(2滴)，37℃孵育10~12min。 6、每孔加入终止液50mL(1滴)，立即用酶标仪在波长450nm处 测定吸光度值(OD值)。在定量分析中，显色液和终止液需要 用移液器准确量取。
ELISA应用实例
ELISA在饲料安全检测中的 应用
饲料中盐酸克伦特罗的测定 饲料中毒素的测定（主要包括黄曲霉毒素， 简曲霉毒素 ） 饲料中有害微生物的快速筛检 （如沙门氏菌 ） ELISA用于农药残留 的检测
甲胺磷残留分析 甲基对硫磷残留分析 呋喃丹残留分析
农药的检测
主要有除草剂与杀虫剂两大类 例如 杀暝松（ FN ）、 甲氟磷酸异已酶（ SOMAN ）、 草不绿（ Alachor ）、 西维因（ Carbaryl ）、 多菌灵及克菌丹（ Captan ）等
植物毒素如罌粟硷、吗啡、藻类毒素
苯并芘
河豚毒素
LISA在疾病诊断中 的作用
ELISA检测 “非典型肺炎”冠状病毒 ELISA在结缔组织病早期诊断中的 应 用检测抗异质性胞核核糖蛋白A2 （hnRNPA2）/类风湿性关节炎（PtA） 33抗体 ELISA法检测幽门螺杆菌抗体
ELISA在饲料安全检测中的应用（盐酸克伦特罗）
一、ELISA的原理
它采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接， 然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。 测定的对象可以是抗体也可以是抗原。
在这种测定方法中有3种必要的试剂： ①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂） ②酶标记的抗原或抗体（标记物） ③酶作用的底物（显色剂）
测量时，抗原（抗体）先结合在固相载体上，但仍保留其 免疫活性，然后加一种抗体（抗原）与酶结合成的偶联物 （标记物），此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性，当 偶联物与固相载体上的抗原（抗体）反应结合后，再加上 酶的相应底物，即起催化水解或氧化还原反应而呈颜色。 其所生成的颜色深浅与欲测的抗原（抗体）含量成正比。
1.将抗体包被在固相载体上。 2.如样品中含有抗原，则优先 竞争结合抗体，结合 为抗原抗体复合物。 酶 3.同时加入酶标记抗原，抗原 酶标记抗原 没有结合的位点酶标记抗原 抗原 去占据，则结合为酶标记抗 原-抗体复合物。 抗原 4.酶催化底物并显色。 抗体
固相载体
酶标抗原竞争法示意图
（四）双位点一步法
为了克服本法的缺陷，充分利用其优点，可采用以 下对策： 1.增加固相抗体和酶标抗体的浓度，以适应抗原 浓度更高的样本。 2.将待测样本稀释一定的比例，以与固相抗体和 酶标抗体的浓度比例相适应。此法在临床实验室最 简便实用 此方法无毒无污染、高度敏感、特异，消除钩状效 应的方法简便易行，其仍不失为临床实验室的首选 方法。 此法主要用于检测血清甲胎蛋白（AEP），该测定 临床上主要应用于肝癌的早期诊断。
使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体 结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此 时固相载体上带有的酶量与标本中受检 物质的量正相关。 夹心式复合物中的酶催化底物成为有色 产物。根据颜色反应的程度进行该抗原 的定性或定量。
（3）加酶标抗体
•
（4）加底物显色
•
注意事项
• 现多采用针对单一抗原决定簇特异性的单克隆抗 体做固相化和酶标抗体，则受检样品和酶标抗体 可一次性加入，简化流程，缩短反应时间。 • 若标本中待测抗原浓度过高，抗原可分别与酶标 抗体和固相抗体结合而不形成抗体—待测抗原— 酶标记抗体复合物(类似于免疫沉淀反应中抗原过 剩时的后带现象)，使最终结果低于实际含量(钩 状效应)，甚至出现假阴性现象。因此对此类标本 应适当稀释后再测定。 • 当血清中存在类风湿因子（RF）时，类风湿因子 （RF）可充当抗原，而形成固相抗体-类风湿因 子-酶标抗体夹心复合物，从而出现假阳性结果。
这种固相酶免疫测定方法在1971年由瑞典学者Engvail 和Perlmann,荷兰学者Van Weerman和Schuurs分别报道 将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测 定方法，即酶联免疫吸附测定法 (enzyme-linked immunosorbent assay , ELISA) 。ELISA现在已成为 目前分析化学领域中的前沿课题 ，它是一种特殊的试 剂分析方法，是在免疫酶技术( immunoenzymatic techniques ) 的基础上发展起来的一种新型的免疫测 定技术 。
（三）竞争法
• ELISA 竞争法原理
• 竞争法ELISA可以检测抗原或小分子半抗原、抗体。以测 抗体为例，使待测抗体和酶标抗体竞争与固相抗原结合， 结果如待测抗体含量越多，与固相抗原结合的酶标抗体就 越少，显色越浅，二者呈负相关。
待测抗体 酶标抗体
竞争法测抗原 原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原 竞争和固相抗体结合，标本中的抗原含量 越多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最 后的显色也越浅。小分子激素、药物等多 采用此法。 也可以测定抗体，以测定抗原为例
酶及其底物
酶结合物是酶与抗体或抗原, 半抗原在 交联剂作用下联结的产物。是ELISA成败的 关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的免 疫反应，还具有酶促反应，显示出生物放 大作用，但不同的酶选用不同的底物 ，将 得到不同的颜色反应.
酶
辣根过氧化物酶
底 物
邻苯二胺 四甲替联苯胺 氨基水杨酸 邻联苯甲胺 2,2‘-连胺基-2(3-乙基-并噻 唑啉磺酸-6)铵盐 4-硝基酚磷酸盐(PNP) 萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐 ABTS+HRP+葡萄糖 葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰 甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG) 硝基酚半乳糖苷(ONPG)
• 利用样品中的盐酸克伦特罗能与酶偶联克 伦特罗竞争性的与固相载体上已被包被的 克伦特罗结合，具体步骤：
克伦特罗抗体加入 到已被包被克伦特 孵育、洗涤 罗抗体的微孔板内 加入克伦特罗酶 标记物和待测样 品 酶基质和发 色剂加入到 孔中并孵育
洗涤
450nm处侧 吸光度
加入反应停 止液
• 吸光度与样品中盐酸克伦特罗的浓度成反 比，即样品中盐酸克伦特罗多，则被抗体 结合酶标克伦特罗抗原少，颜色浅，反之 则深，用目测法或者仪器法与盐酸克伦特 罗标样比较来判断样品中盐酸克伦特罗的 含量。
• 在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对ห้องสมุดไป่ตู้原分 子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为 固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加 入和酶标抗体的加入两步并作一步。
这种双位点一步不但简化了操作，缩短了反应时 间，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感 性和特异性也显著提高。单克隆抗体的应用使测 定抗原的ELISA提高到新水平。 在一步法测定中，应注意钩状效应（hookeffect）， 类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。当标本 中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相 抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物， 所得结果将低于实际含量。钩状效应严重时甚至 可出现假阴性结果。
enzyme-linked immunosorbent assay , ELISA
主要内容
• • • • 什么是酶联免疫吸附分析法 ELISA的原理 ELISA的类型和方法 ELISA的应用实例
酶免疫组化 酶免疫技术 酶免疫测定 非均相酶免疫测定 液相酶免疫测定 均相酶免疫测定 固相酶免疫测定
（二）ELISA间接法测定抗体
包被固相载体: 用已知抗原包被 固相载体 加待检标本: 使相应抗体与固相抗原结合 洗涤，除去无关的物质 加酶标抗抗体: 与固相载体上抗原抗体 复合物结合；洗涤，除去 未结合的酶标抗抗体
加底物 显色 根据颜色反应的程度进行 该抗原的定性或定量测定
该法的优点是只要变换包被抗原就可 以利用同一酶标记抗体。成功的关键 在于高纯度的抗原。 在病源抗体的检测中有很好的应用
• （六）应用亲和素和生物素的ELISA
（一）双抗体夹心法（double antibody sandwich method ）
• 1、实验步骤
（1）将特异性抗体与固相载体连
接，形成固相抗体
•
形成固相抗体后洗涤除去未结合的抗体 及杂质。
（2）加受检标本
• 使之与固相抗体接触反应一段时间，让 标本中的抗原与固相载体上的抗体结合， 形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未 结合的物质。
（五）捕获法测IgM抗体
• 血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异 性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测 定。因此测定IgM抗本多用捕获法，先将所 有血清IgM（包括异性IgM和非特异性IgM） 固定在固相上，在去除IgG后再测定特异性 IgM。操作步骤如下：
1）将IgM抗体连接在固相载体上，形成固相抗体IgM。洗涤。 2）加入稀释血清标本：保温反应后血清中的IgM抗体被固相抗 体捕获，洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分。 3）加特异性抗原试剂：它只与固相上的特异性IgM结合。洗涤。 4）加入针对特异性的酶标抗体：使之与结合在固相上的抗原反 应结合。洗涤。 5）加底物显色：如有颜色显示，则表示血清标本中的特异性 IgM抗体存在，是为阳性反应。
（六）应用亲和素和生物素的ELISA
亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD， 每个分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子亲密结合。 现在使用更多的是从链霉菌中提取的链霉和素 （strepavidin）。生物素（biotin）又称维生素H，分子量 244.31，存在于蛋黄中。 用化学方法制成的衍生物，生物素－羟基琥珀亚胺酯 （biotin-hydroxysuccinimide，BNHS）可与蛋白质、糖类 和酶等多种类型的大小分子形成生物素化的产物。亲和素 与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力 大，两者一经结合就极为稳定。由于1个亲和素分子有4个 生物素分子的结合位置，可以连接更多的生物素化的分子， 形成一种类似晶格的复合体。因此把亲和素和生物素与 ELIS偶联起来，就可大提高ELISA的敏感度。
显色 反应
橘红色 黄色 棕色 兰色 蓝绿色
测定波长
492 460 449 425 642 400 500 405 420 360,450 420
碱性磷酸酯酶 葡萄糖氧化酶
黄色 红色 黄色 深蓝色 荧光 黄色
β-Ｄ－半乳糖 苷酶
ELISA的类型和方法
• • • • • （一）双抗体夹心法 （二）间接法 （三）竞争法 （四）双位点一步法 （五）捕获法测IgM抗体
黄曲霉毒素B1(AFB1)酶联免疫定 量检测方法
• 实验所需提供的耗材物品：微孔板包被有AFB1BSA5个浓度的AFB1标准溶液(各0.5mL)。标准1： 0ng/mL可直接使用；标准2：0.1ng/m可直接使用； 标准3：0.2ng/mL可直接使用；标准4：0.5ng/m 可直接使用；标准5：1.0ng/m可直接使用；抗AF B1单克隆抗体溶液(6mL)可直接使用；酶标物 (12mL)可直接使用；显色液(12mL)可直接使用； 终止液(6mL)可直接使用；浓缩洗液(30mL) 稀释 使用；微孔板酶标仪(可于450nm处测定)、振荡 器、粉碎机、微量移液器；量筒、漏斗、容量瓶、 快速定性滤纸；氯化钠(分析纯)、甲醇(分析纯)、 去离子水或蒸馏水。
• ELISA 普遍用作非放射性同位素的成键化 验. 在这种方法中, 通常标准配体是固定的, 通过加入溶液相受体或蛋白质来使之成键. 通过加入与受体特异性反应的抗体来定量 成键的受体, 而且最初抗体的量以加入第二 种能显色的抗体测量. 第二种抗体能识别抗 体的末端, 在其末端的碱性磷酸酯或过氧化 物酶等与酶发生反应, 从而使溶液显色.
检测实验中酶免疫分析程序
1、浓缩洗液为10倍浓缩液，使用时与去离子水或蒸馏水按体 积比1:9稀释后使用。 2、取所需数量的板条插入微孔架，用洗液洗涤微孔板3min×2 次。 3、加入50mL标准品或处理好的样品到微孔，记录样品及标准 的位置，每个标准和样品必须使用新的吸头。 4、加入50mL抗体溶液到每个微孔(注意移液器管尖不要接触到 孔中的液体，避免交叉污染)中，37℃孵育90min。甩掉孔中 液体，用洗液洗涤微孔板3min×3次，最后一次应在吸水纸 上拍打以完全除去孔中液体。每孔加入酶标物100mL，37℃ 孵育60min。用洗液洗涤微孔板3min×5次，最后一次应在 吸水纸上拍打以完全除去孔中液体。 5、每孔加入显色液100mL(2滴)，37℃孵育10~12min。 6、每孔加入终止液50mL(1滴)，立即用酶标仪在波长450nm处 测定吸光度值(OD值)。在定量分析中，显色液和终止液需要 用移液器准确量取。
ELISA应用实例
ELISA在饲料安全检测中的 应用
饲料中盐酸克伦特罗的测定 饲料中毒素的测定（主要包括黄曲霉毒素， 简曲霉毒素 ） 饲料中有害微生物的快速筛检 （如沙门氏菌 ） ELISA用于农药残留 的检测
甲胺磷残留分析 甲基对硫磷残留分析 呋喃丹残留分析
农药的检测
主要有除草剂与杀虫剂两大类 例如 杀暝松（ FN ）、 甲氟磷酸异已酶（ SOMAN ）、 草不绿（ Alachor ）、 西维因（ Carbaryl ）、 多菌灵及克菌丹（ Captan ）等
植物毒素如罌粟硷、吗啡、藻类毒素
苯并芘
河豚毒素
LISA在疾病诊断中 的作用
ELISA检测 “非典型肺炎”冠状病毒 ELISA在结缔组织病早期诊断中的 应 用检测抗异质性胞核核糖蛋白A2 （hnRNPA2）/类风湿性关节炎（PtA） 33抗体 ELISA法检测幽门螺杆菌抗体
ELISA在饲料安全检测中的应用（盐酸克伦特罗）
一、ELISA的原理
它采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接， 然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。 测定的对象可以是抗体也可以是抗原。
在这种测定方法中有3种必要的试剂： ①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂） ②酶标记的抗原或抗体（标记物） ③酶作用的底物（显色剂）
测量时，抗原（抗体）先结合在固相载体上，但仍保留其 免疫活性，然后加一种抗体（抗原）与酶结合成的偶联物 （标记物），此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性，当 偶联物与固相载体上的抗原（抗体）反应结合后，再加上 酶的相应底物，即起催化水解或氧化还原反应而呈颜色。 其所生成的颜色深浅与欲测的抗原（抗体）含量成正比。
1.将抗体包被在固相载体上。 2.如样品中含有抗原，则优先 竞争结合抗体，结合 为抗原抗体复合物。 酶 3.同时加入酶标记抗原，抗原 酶标记抗原 没有结合的位点酶标记抗原 抗原 去占据，则结合为酶标记抗 原-抗体复合物。 抗原 4.酶催化底物并显色。 抗体
固相载体
酶标抗原竞争法示意图
（四）双位点一步法
为了克服本法的缺陷，充分利用其优点，可采用以 下对策： 1.增加固相抗体和酶标抗体的浓度，以适应抗原 浓度更高的样本。 2.将待测样本稀释一定的比例，以与固相抗体和 酶标抗体的浓度比例相适应。此法在临床实验室最 简便实用 此方法无毒无污染、高度敏感、特异，消除钩状效 应的方法简便易行，其仍不失为临床实验室的首选 方法。 此法主要用于检测血清甲胎蛋白（AEP），该测定 临床上主要应用于肝癌的早期诊断。
使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体 结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此 时固相载体上带有的酶量与标本中受检 物质的量正相关。 夹心式复合物中的酶催化底物成为有色 产物。根据颜色反应的程度进行该抗原 的定性或定量。
（3）加酶标抗体
•
（4）加底物显色
•
注意事项
• 现多采用针对单一抗原决定簇特异性的单克隆抗 体做固相化和酶标抗体，则受检样品和酶标抗体 可一次性加入，简化流程，缩短反应时间。 • 若标本中待测抗原浓度过高，抗原可分别与酶标 抗体和固相抗体结合而不形成抗体—待测抗原— 酶标记抗体复合物(类似于免疫沉淀反应中抗原过 剩时的后带现象)，使最终结果低于实际含量(钩 状效应)，甚至出现假阴性现象。因此对此类标本 应适当稀释后再测定。 • 当血清中存在类风湿因子（RF）时，类风湿因子 （RF）可充当抗原，而形成固相抗体-类风湿因 子-酶标抗体夹心复合物，从而出现假阳性结果。
这种固相酶免疫测定方法在1971年由瑞典学者Engvail 和Perlmann,荷兰学者Van Weerman和Schuurs分别报道 将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测 定方法，即酶联免疫吸附测定法 (enzyme-linked immunosorbent assay , ELISA) 。ELISA现在已成为 目前分析化学领域中的前沿课题 ，它是一种特殊的试 剂分析方法，是在免疫酶技术( immunoenzymatic techniques ) 的基础上发展起来的一种新型的免疫测 定技术 。
（三）竞争法
• ELISA 竞争法原理
• 竞争法ELISA可以检测抗原或小分子半抗原、抗体。以测 抗体为例，使待测抗体和酶标抗体竞争与固相抗原结合， 结果如待测抗体含量越多，与固相抗原结合的酶标抗体就 越少，显色越浅，二者呈负相关。
待测抗体 酶标抗体
竞争法测抗原 原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原 竞争和固相抗体结合，标本中的抗原含量 越多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最 后的显色也越浅。小分子激素、药物等多 采用此法。 也可以测定抗体，以测定抗原为例
酶及其底物
酶结合物是酶与抗体或抗原, 半抗原在 交联剂作用下联结的产物。是ELISA成败的 关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的免 疫反应，还具有酶促反应，显示出生物放 大作用，但不同的酶选用不同的底物 ，将 得到不同的颜色反应.
酶
辣根过氧化物酶
底 物
邻苯二胺 四甲替联苯胺 氨基水杨酸 邻联苯甲胺 2,2‘-连胺基-2(3-乙基-并噻 唑啉磺酸-6)铵盐 4-硝基酚磷酸盐(PNP) 萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐 ABTS+HRP+葡萄糖 葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰 甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG) 硝基酚半乳糖苷(ONPG)
• 利用样品中的盐酸克伦特罗能与酶偶联克 伦特罗竞争性的与固相载体上已被包被的 克伦特罗结合，具体步骤：
克伦特罗抗体加入 到已被包被克伦特 孵育、洗涤 罗抗体的微孔板内 加入克伦特罗酶 标记物和待测样 品 酶基质和发 色剂加入到 孔中并孵育
洗涤
450nm处侧 吸光度
加入反应停 止液
• 吸光度与样品中盐酸克伦特罗的浓度成反 比，即样品中盐酸克伦特罗多，则被抗体 结合酶标克伦特罗抗原少，颜色浅，反之 则深，用目测法或者仪器法与盐酸克伦特 罗标样比较来判断样品中盐酸克伦特罗的 含量。
• 在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对ห้องสมุดไป่ตู้原分 子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为 固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加 入和酶标抗体的加入两步并作一步。
这种双位点一步不但简化了操作，缩短了反应时 间，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感 性和特异性也显著提高。单克隆抗体的应用使测 定抗原的ELISA提高到新水平。 在一步法测定中，应注意钩状效应（hookeffect）， 类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。当标本 中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相 抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物， 所得结果将低于实际含量。钩状效应严重时甚至 可出现假阴性结果。