酶联免疫吸附实验ELISA操作规则(新手适用)资料

酶联免疫吸附实验ELISA －－操作规则（新手适用）

一、实验目的

酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay 简称ELISA)是在免疫酶技术(immunoenzymatic techniques)的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术，ELISA过程包括抗原(抗体)吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体(抗原)，再加相应酶标记抗体(抗原)，生成抗原(抗体)--待测抗体(抗原)--酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体(抗原)的量。待测抗体(抗原)的定量与有色产生成正比。

二、实验原理

用于免疫酶技术的酶有很多，如过氧化物酶，碱性磷酸酯酶，β－Ｄ－半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰胆碱酯酶，6－磷酸葡萄糖脱氧酶等。常用于ELISA法的酶有辣根过氧化物酶，碱性磷酸酯酶等，其中尤以辣根过氧化物酶为多。由于酶摧化的是氧化还原反应，在呈色后须立刻测定，否则空气中的氧化作用使颜色加深，无法准确地定量。

辣根过氧化物酶（HRP）是一种糖蛋白，每个分子含有一个氯化血红素(protonhemin)区作辅基。酶的浓度和纯度常以辅基的含量表示。氯化血红素辅基的最大吸收峰是403nm，HRP酶蛋白的最大吸收峰是275nm，所以酶的浓度和纯度计算式是（已知HRP的A(1cm 403nm 1%)＝25，式中1％指HRP百分浓度为100ml含酶蛋白1g，即10mg/ml，所以，酶浓度以mg/ml 计算是HRP的A(1cm 403nm mg/ml=2.5)HRP纯度(RZ)=A403nm/A275nm纯度RZ（Ｒeinheit Zahl）值越大说明酶内所含杂质越少。高纯度HRP的RZ值在3.0左右，最高可达3.4。用于ELISA检测的

HRP的RZ值要求在3.0以上。

（二）酶与底物

酶结合物是酶与抗体或抗原,半抗原在交联剂作用下联结的产物。是ELISA 成败的关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应，还具有酶促反应，显示出生物放大作用，但不同的酶选用不同的底物。

免疫技术常用的酶及其底物

酶底物显色反应测定波长

辣根过氧化物酶

邻苯二胺橘红色492* 四甲替联苯胺黄色460** 氨基水杨酸棕色449

邻联苯甲胺兰色425

2，2'-连胺基-2(3-乙基

-并噻唑啉磺酸-6)铵盐

蓝绿色642

碱性磷酸酯酶

4-硝基酚磷酸盐(PNP) 黄色400 萘酚-AS-Mx磷酸盐+

重氮盐

红色500

葡萄糖氧化酶

ABTS+HRP+葡萄糖黄色

405，420 葡萄糖+甲硫酚嗪+噻

唑兰

深蓝色

β-Ｄ－半乳糖苷酶

甲基伞酮基半乳糖苷

(4MuG)

荧光360，450 硝基酚半乳糖苷

(ONPG)

黄色420

*终止剂为2mol/L H2SO4

** 终止剂为2 mol/L柠檬酸，不同的底物有不同的终止剂。

可催化下列反应：HRP+H2O2→复合物复合物+AH2→过氧化物酶+H2O+A AH2 ——为无色底物，供氢体；A——为有色产物。

（三）ELISA常用的四种方法

1．直接法测定抗原

将抗原吸附在载体表面；

加酶标抗体，形成抗原—抗体复合物；

加底物。底物的降解量＝抗原量。

2．间接法测定抗体

将抗原吸附于固相载体表面；

加抗体，形成抗原-抗体复合物；

加酶标抗体；

加底物。测定底物的降解量＝抗体量。

3．双抗体夹心法测定抗原

将抗原免疫第一种动物获得的抗体吸附于固相表面;

加抗原，形成抗原-抗体复合物;

加抗原免疫第二种动物获得的抗体，形成抗体抗原抗体复合物;

加酶标抗抗体(第二种动物抗体的抗体);

加底物。底物的降解量＝抗原量。

4. 竞争法测定抗原

将抗体吸附在固相载体表面;

(1) 加入酶标抗原；

(2)，(3)加入酶标抗原和待测抗原；

加底物。对照孔与样品孔底物降解量的差＝未知抗原量。

三、仪器和材料

1. 聚苯乙烯微量细胞培养板(平板，40，96孔)。

2. 酶联免疫检测仪

3. 辣根过氧化物酶羊抗兔IgG，工作稀释度1:1000。

4. 包被液:：0.05mol/L pH9.6碳酸缓冲液，4℃，保存，Na2CO3 0.15克，NaHCO3 0.293克，蒸馏水稀释至100 ml。

5. 稀释液：0.01mol/LpH7.4 PBS--Tween--20，４℃，保存. NaCl 8g，KH2PO4 0.2g，Na2HPO4.12H2O 2.9g，Tween—20，0.5ml. 蒸馏水加至1000ml。

6. 洗涤液：同稀释液

7. 封闭液：0.5%鸡卵清蛋白，pH7.4 PBS。

8. 邻苯二胺溶液(底物)：临用前配制0.1M 柠檬酸(2.1g/100ml)，6.1ml 0.2M Na2HPO4.12H2O (7.163g/100ml) 6.4ml，蒸馏水12.5ml，邻苯二胺10mg，溶解后，临用前加30%H2O2 40 微升。

9. 终止液：2mol/LH2SO4。

四、操作步骤

1.包被抗原：用包被液将抗原作适当稀释，一般为1～10微克/孔，每孔加200微升，37℃温育1小时后，4℃冰箱放置16～18小时。

2.洗涤：倒尽板孔中液体，加满洗涤液，静放三分钟，反复三次，最后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽。

3.加封闭液200微升，37℃放置一小时。