酶联免疫吸附试验(ELISA)注意事项
酶联免疫吸附试验ELISA手工操作注意事项
05
ELISA手工操作注意事项总结
加强实验室内质量控制
制定并执行严格的质控标准，确保实验结果的可 靠性。
对实验室内温度、湿度、光照等环境因素进行有 效控制，以保障实验结果的稳定性。
对实验室内设备、仪器进行定期维护和校准，确 保其在最佳状态下运行。
保持实验试剂的稳定
01
对实验试剂进行定期检查，确保其质量和浓度符合实验要求。
总结词
洗板过程出现错误是ELISA手工操作中常见 的问题之一，包括洗板不彻底、洗液溅洒 、吸液量不足或过多等。
解决办法
在洗板前要将板孔清洗干净，保证没有残 留物。洗液要按照说明书要求的比例配制 ，避免浓度过高或过低。洗板时要保证每 个孔的洗涤次数和洗涤液用量都相同，避 免出现偏差。洗板后要将多余的洗涤液甩 掉，并用干净的滤纸吸干残留的洗涤液。
显色反应异常
总结词
显色反应异常是ELISA手工操作中常见的问题之一，包 括显色过浅或无显色、显色不均匀等。
解决办法
在加入显色剂前要确保所有孔加入底物溶液时操作相 同，保证显色剂加入的量和时间都相同。同时要避免 阳光直接照射到反应孔中，以免影响显色效果。如显 色过浅或无显色，可能是显色剂加入量不足或底物溶 液加入量不足；如显色不均匀可能是反应条件不一致 或操作不当等原因造成。应根据具体情况采取相应的 措施进行处理。
酶联免疫吸附试验(ELISA)
是一种免疫分析技术，基于抗原-抗体反应和酶的催化作用，用于检测和定量 分析生物分子。
原理简述
将抗原或抗体结合到固相载体表面，加入酶标记的第二抗体，再加入底物显 色，根据颜色深浅判断抗原或抗体的量。
ELISA试验的分类
根据检测目的
可分为间接ELISA、夹心ELISA、竞争ELISA等。
酶联免疫吸附试验
实验三酶联免疫吸附试验（ELISA）一、实验目的了解ELISA的基本原理，掌握间接ELISA方法的原理与操作步骤。
二、实验原理将抗原或抗体固化于某种载体的表面，并保持其免疫活性，加入待检血清（抗体），然后加入与其相对应的既有酶活性又有免疫活性的酶标抗体或抗原，它们之间反应后，通过洗涤去掉未结合的标记物。
加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，酶的降解底物和呈现的色泽在一定条件下是呈正比的，故可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析，因此可用分光光度计进行测定，计算出参加反应的抗原或抗体的含量，从而达到测定抗原或抗体的目的。
常用酶及底物常用酶底物加终止液前颜色加终止液后颜色辣根过氧化物酶（HRP）RZ>3.1碱性磷酸酶（AP）邻苯二胺（OPD）四甲基联苯胺（TMB）对硝基苯磷酸酯（p-NPP）橙黄色蓝色黄色棕黄色黄色黄色根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。
常用的三种类型：1、间接法测抗体（间接ELISA）间接法用于测定抗体。
它的原理是将已知抗原连接在固相载体上，待测抗体与抗原结合后再与酶标二抗结合，形成抗原-待测抗体-酶标二抗的复合物，复合物的形成量与待测抗体量成正比，属非竞争性反应类型。
2、双抗体夹心法（双抗夹心ELISA）双抗体夹心法用于检测抗原。
它是利用待测抗原上的两个抗原决定簇A和B分别与固相载体上的抗体A和酶标记抗体B结合，形成抗体A-待测抗原-酶标抗体B复合物，复合物的形成量与待测抗原含量成正比，属非竞争性反应类型。
操作：将抗体吸附于固相表面；加抗原，形成抗原-抗体复合物；加酶标抗体；加底物。
底物的降解量＝抗原量。
3、竞争ELISA竞争法既可用于检测抗原又可用于检测抗体。
它是用酶标抗原（抗体）与待测的非标记抗原（抗体）竞争性的与固相载体上的限量抗体（抗原）结合，待测抗原（抗体）多，则形成非标记复合物多，酶标抗原与抗体结合就少，也就是酶标记复合物少，因此，显色程度与待测物含量成反比。
酶联免疫吸附试验(ELISA)操作注意事项
（2）温育温度的选择。 在有的ELISA试剂盒的说明书中，指出温育温 度可有两种，例如，一种是37℃下1小时，另一 种则为43℃下45分钟。从免疫测定抗原抗体反 应的本质来看，在较低的温度下反应较长的时 间最为完全，产物最稳定。如2－8℃下反应24 小时。较高的反应温度，由于分子运动的加快， 反应时间缩短，这一点对分子含量较多的强阳 性样本测定没有问题，但对分子含量少的弱阳 性样本则有漏检的可能。因此，如须选择反应 条件，建议在临床ELISA测定中尽量使用较低 温度较长反应时间的条件。
而将ELISA板置于水浴箱中，ELISA板底应贴着 水面，可使温度迅速平衡。让反应板飘浮在水面 上。就可以很容易地排除“边缘效应”，并且可 提高测定的重复性。
洗涤在ELISA虽不是一个反应步骤，但也决定着实 验的成败。ELISA就是靠洗涤清除残留在板孔中没 能与固相抗体（抗原）结合的物质，以及在反应过 程中非特异性的吸附于固相载体的干扰物质，以保 证ELISA测定的特异性。 洗涤液为非离子型洗涤剂的中性缓冲液。聚苯乙烯 载体与蛋白质的结合是疏水性的，非离子型洗涤剂 既含疏水基团，也含亲水基团，使蛋白质回复到水 溶液状态，从而脱离固相载体。 在实验室中，ELISA测定的洗板一般有两种方式， 即手工和洗板机洗板。为保证微孔板的均一性使结 果准确可靠，最好选用洗板机洗板。若手工洗板， 要注意浸泡时间和孔间洗液最好不要互相流动。流 水冲洗法让水流冲击板孔表面，简便、快速，洗涤 效果较好。
3 加样本及反应试剂
4 温育
温育是ELISA测定中影响测定成败最为关键的一个 因素。 ELISA属于固相免疫测定，要使液相中的抗原或抗 体与固相上的特异性抗体或抗原完全结合，必须在 一定温度条件下反应一定的时间。一般温育所需时 间与温度成反比，即温度越高，所需时间相对较短。 最为常用的温度有37℃和室温(20－25℃)，其次是 43℃和2－8℃，目前国内ELISA商品试剂盒的反应 温育时间通常为37℃30－60分钟。 关于温育，在实际测定操作中一定要注意以下几点：
酶联免疫吸附(ELISA)试验的标准操作规程
酶联免疫吸附（ELISA）试验的标准操作规程（编号：002）1.目的该SOP是利用抗原抗体特异性结合的原理，将待检抗体/抗原和酶标抗原/抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原/抗体起反应。
加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，利用颜色反应放大反应效果从而定性或定量分析，从而使测定方法达到很高的敏感度。
2.适用范围该SOP适用于测定抗原抗体的匹配程度，血清中的抗体滴度，利用已知抗体判定未知蛋白的生物学特性等。
3.主要仪器酶标仪、洗板机、酶联条、微量移液器4.试剂0.05 M pH 9.6碳酸盐缓冲液、0.15 M pH 7.4 PBST、稀释液、封闭液、0.2M Na2HPO4、0.1 M 柠檬酸、0.1 M EDTA、底物反应液A、底物反应液B、终止液（2 M H2SO4）具体的制备步骤见附件。
5.操作步骤5.1 酶联免疫吸附试验（ELISA）常规操作5.1.1将重组蛋白用包被缓冲液按1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600稀释后，每孔加100μL，设两排平行孔和阴性对照孔，4℃过夜包被（12-18h）或37℃包被5h。
5.1.2 次日用封闭液 37℃封闭1h，PBST洗涤3次，每次2min。
5.1.3 加入100μL用稀释液1:1000稀释的一抗，37℃温育30min，再用PBST洗涤后，每次2min。
5.1.4 加入100μL 1:1000稀释的HRP标记的二抗兔抗马IgG，37℃温育15min，洗涤后分别加入ELISA显色A液和B液，各50μL，5min后再加入50μL终止液，最后测定其A450nm，以测定孔与阴性对照孔A450nm＞2.1判为阳性。
5.2 其他模式酶联免疫吸附试验（ELISA）步骤5。
酶联免疫吸附试验ELISA手工操作注意事项
xx年xx月xx日
目 录
• ELISA手工操作基础知识 • ELISA手工操作前的准备 • ELISA手工操作过程中的注意事项 • ELISA手工操作后的注意事项 • ELISA手工操作问题与对策 • ELISA手工操作与其他技术结合应用
01
ELISA手工操作基础知识
ELISA手工操作注意事项概述
• 注意保持操作环境的清洁和整洁，避免试剂污染和交叉污染。 • 加样时要准确、稳定，避免加样误差。 • 温育时要注意温度和时间的控制，确保抗原-抗体充分结合。 • 洗涤时要保证所有未结合物质被彻底去除，减少非特异性干扰。 • 加酶标抗体时要保证与已结合的抗原-抗体复合物充分结合。 • 底物反应时要注意观察颜色的变化，避免底物过度氧化产生非特异性颜色变化。 • 终止反应时要准确判断终止时机，避免过早或过晚终止导致结果不准确。
重复进行实验，比较实验结果的 一致性和稳定性。
可视化展示
将实验结果以图表或图像的形式展 示，更直观地反映实验结果。
实验废弃物处理注意事项
废弃物分类
将实验废弃物分类，如废液、 废渣、废气等，以便正确处理
。
化学物品处理
对含有有害化学物质的废弃物 进行专门处理，避免对环境和
人体造成危害。
生物废弃物处理
对含有微生物或细胞的废弃物 进行灭活或消毒处理，以防止
酶标板、移液管、滴管、离心 管等实验器材需清洗干净并高
温灭菌。
实验中所使用的缓冲液、洗涤器准备
实验前需准备好酶标仪、洗板机、移液器等必要的实验仪器，并确保其正常运行 。 实验前还需对仪器的各项参数进行调整，确保实验结果的准确性。
实验结束后需对实验仪器进行清洗和保养，确保实验仪器的使用寿命。
ELISA酶联免疫吸附试验报告
大学实验报告酶联免疫吸附试验学院：专业：姓名：学号：一．实验原理酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种用酶标记抗原或抗体的方法，此法是将抗原、抗体免疫反应的特异性和酶的高效催化作用原理有机地结合起来的技术，可敏感地检测体液中微量的特异性抗原或抗体。
基本原理如下：①先使用抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性；②使抗原或抗体与某种酶联结成酶标抗原或酶标抗体，这种酶标抗原或酶标抗体即保留了其免疫活性，又保留了酶活性；③试验时，把受检标本（抗体或抗原）和酶标抗原或酶标抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应，用洗涤法去除固相载体上的游离物质，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的多少有关。
当加入酶反应的底物后，底物被酶催化而产生有色物质。
颜色反应深浅与受检抗原或抗体的量成正比。
因此，可借助颜色反应的深浅来定性、定量抗体或抗原。
本技术的特点是敏感性高，特异性强，操作简易，结果容易观察。
图1 ELISA实验原理示意图二．实验材料BSA抗原、兔抗BSA抗体（一抗，分别用PBS稀释成1:2, 1:4, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128, 1:256七个浓度）、酶标羊抗兔IgG（二抗）、0.05M PH9.6碳酸盐包被缓冲液、洗涤液（PBS）、底物溶液、2mol/L H2SO4。
三．实验方法1.包被板的处理：加BSA（包被缓冲液稀释为10μg/ml）至酶标板中，每孔100μl，置湿盒中4℃过夜。
第二天取出，用PBS洗涤3-4次。
2.取包被好的酶标板，在第一孔中加入100μl PBS作阴性对照，在第2-8孔加入上述稀释的一抗各100μl，置37℃保温1h。
3.倾去液体，用PBS洗涤3-4次后加入二抗各100μl，置37℃保温30min。
4.倾去液体，用PBS洗涤3-4次后加入底物溶液各100μl，在暗处37℃避光显色20min，最后加入50μl、2M H2SO4终止反应。
5.在波长490nm处，测定各孔的光密度吸收值。
ELISA测定操作中的注意事项
ELISA测定操作中的注意事项ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种常用的工具，用于测定病毒、细菌、蛋白质和其他生物分子在生物样本中的存在量。
ELISA检测方法操作相对简单，但仍然需要遵循一定的操作步骤和注意事项。
以下是ELISA测定操作中需要注意的几个关键点：1.准备工作：在进行ELISA测定之前，必须仔细准备实验室，并确保所有需要的试剂和仪器设备都得到妥善处理。
所有试剂应按照说明书储存和使用，并检查试剂有效期。
2.样品处理：样品的处理方法会因样品类型的不同而异。
无论是血清、尿液、细胞上清液还是其他类型的样品，都需要进行预处理以提取目标分析物。
必须注意避免样品污染和误导，以避免结果扭曲。
3.标准曲线制备：标准品的浓度应按照所需浓度系列依次配制。
标准曲线对于测量未知样品中目标物质的浓度至关重要。
应准确测量并稀释标准品，以保证标准品在适宜阶段内。
4.试板板块的涂覆：试板板块在试验中起到一个基础角色，对于测定结果至关重要。
在涂布之前，应完全清洗和干燥，以确保涂覆的均匀。
涂覆的目标抗体或抗原浓度也应该掌握好，以便获得准确的结果。
5.反应时间和温度：在试验进行过程中，应遵循说明书上的指导，严格控制每个反应的时间和温度。
反应时间和温度的变化可能会导致结果不准确或可读性差。
6.洗涤的重要性：洗涤步骤是ELISA测定中用来去除未结合的试剂或物质的重要步骤。
洗涤过程必须彻底，在每次洗涤中使用足够的洗涤缓冲液来确保彻底去除未结合物质。
7.底物的选择和反应停止：底物的选择对于结果的解读和显示至关重要。
不同的底物可能在不同的波长下显示颜色。
在选择底物时应确认设计好测定的波长。
同时，在底物反应后需要及时停止反应，使反应停止时间相对一致。
8.数据分析：9.消毒与废液处理：10.质量控制：为了确保ELISA测定的结果准确可靠，应进行质量控制。
包括使用质控样品、校准标准品和内部参比物来保证所得结果的精确性和可重复性。
总结起来，ELISA测定是一种有效的生化实验方法，但在操作过程中需要注意细节和实验操作的准确性。
酶联免疫吸附试验注意事项
酶联免疫吸附试验注意事项一、前言酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种常见的生物学实验技术，用于检测抗体或抗原的存在。
在进行ELISA实验时，需要注意许多细节，以确保实验结果准确可靠。
本文将详细介绍ELISA实验中需要注意的事项。
二、试剂准备1. 标准品的制备：标准品是ELISA实验中非常重要的一个组成部分，它通常用于建立标准曲线，从而确定未知样本中抗体或抗原的浓度。
在制备标准品时，应该按照厂家提供的说明书严格操作，并注意其保存方式和有效期。
2. 酶标板的处理：在使用酶标板之前，应该先进行预处理。
通常情况下，酶标板需要用PBS（磷酸盐缓冲液）或其他缓冲液洗涤数次才能去除表面上可能存在的污染物。
此外，在使用酶标板之前还应该对其进行预热处理。
3. 酶联试剂盒中其他试剂的制备：除了标准品和酶标板之外，ELISA试剂盒中还包括其他试剂如探针、底物、停止液、缓冲液等。
在制备这些试剂时，应该按照说明书中的要求进行操作，并注意其保存方式和有效期。
三、样本处理1. 样本的收集和保存：在进行ELISA实验之前，需要先收集样本并储存起来。
对于血清或血浆样本，应该使用无菌的容器进行收集，并在室温下离心去除细胞残留物。
此外，在储存样本时应该避免反复冻融，以免影响实验结果。
2. 样本的稀释：在ELISA实验中，通常需要将样本稀释到一定浓度才能进行检测。
稀释倍数应该根据实验需要和样品浓度确定，并严格按照说明书中的要求进行操作。
四、实验操作1. 洗板步骤：洗板是ELISA实验中非常重要的一个步骤，它用于去除不特异性结合物质以及未结合试剂等。
在洗板时应该注意以下几点：（1）洗涤次数：通常情况下，每个孔洗涤3-5次即可。
（2）洗涤缓冲液：不同的试剂盒可能需要使用不同的洗涤缓冲液，应该按照说明书中的要求进行操作。
（3）洗涤时间：洗板时间应该控制在适当的范围内，过长或过短都可能影响实验结果。
2. 加样步骤：在加样时应该注意以下几点：（1）加样量：加样量应该根据实验需要和样品浓度确定，并严格按照说明书中的要求进行操作。
培训课件：酶联免疫吸附试验(ELISA)操作注意事项
2 核对仪器
确保酶标仪正常运行， 并进行校准和调试。
3 设定样品量
根据实验要求和预期结 果，设定合适的样品量。
ELISA操作流程
取样品
使用移液管准确地取出待测样品，并转移至反 应孔板中。
混合试剂
根据实验要求，将不同试剂混合，并加入反应 孔板中。
洗涤反应孔板
使用洗涤缓冲液彻底洗涤反应孔板，去除非特 异性结合物。
3
反应孔板处理
处理反应孔板，包括洗涤、封闭非特异性结合位点等步骤。
4
标准曲线绘制
通过稀释标准品制备标准曲线，用于分析待测样品的浓度。
材料清单
反应孔板
96孔黑胶板
用于测定光学密度
洗涤缓冲液
用于洗涤反应孔板
实验前准备工作
1 检查试剂
确认试剂溶液的保存状 态和有效期限，避免使 用过期或变质的试剂。
添加底物溶液
加入致色底物溶液，观察反应孔板颜色的变化。
实验注意事项
避光操作
在取样、反应和测量过程中， 避免试剂暴露在强光下，以 保证测量结果的准确性。
注意交叉污染
使用专用移液管和洗涤缓冲 液，避免不同试剂之间的交 叉污染。
标准曲线绘制
密切按照标准曲线绘制的要 求进行操作，以获得准确的 样品浓度。
结果分析
如何避免交叉污染？
使用专用移液管和洗涤缓冲 液，并避免将试剂污染到外 部容器或工作台。
应该如何解读ELISA 实验结果？
根据标准曲线将光学密度值 转化为样品浓度，并根据浓 度结果判断样品中目标物质 的含量。
1 测量光学密度
使用酶标仪测量各反应孔板的光学密度，并记录数据。
2 标准品对照
根据标准曲线将测得的光学密度值转化为待测样品的浓度。
酶联免疫吸附试验ELISA手工操作注意事项
02
ELISA手工操作前的准备工作
实验环境与器材准备
确保实验室环境整洁、安全，配备紫外灯、酒精灯等消毒 设备。
准备好ELISA板、移液器、酶标仪、洗板机等实验器材， 确保其性能良好。
样本的处理与保存
1
仔细查阅实验方案，了解样本的来源、种类及 检测项目。
2
对样本进行收集、离心、分离等处理，以备后 续实验使用。
• 包被：将抗原或抗体包被在固相载体表面，以便进行后续的免疫反应。 • 加样：将待测样本、标准品和阴性对照等加入到已包被的微孔板中。 • 孵育：使抗原和抗体在微孔板中充分反应，以形成抗原-抗体复合物。 • 洗涤：去除未结合的物质，分离抗原-抗体复合物和游离抗体。 • 显色：加入酶标抗体和底物，使抗原-抗体-酶标抗体复合物与底物发生反应，产生有色产物。 • 终止：加入终止液，停止显色反应。 • 测定：用酶标仪测定吸光度值，并计算待测样本的浓度或滴度。
还可以提高实验的效率和应用范围。 • 应用领域拓展：ELISA技术未来将不断拓展其应用领域，比如应用于基因检测、细胞功能学检测、药物筛选
等领域。
THANKS
感谢观看
全自动化，减少手工操作的误差和时间。 • 智能化：通过引入人工智能等技术，未来的ELISA技术可以实现智能化分析和管理，提高实验的准确性和效
率。 • 便携化：便携式ELISA检测设备可以方便快捷地对多种疾病进行现场检测，为临床诊断和治疗提供及时有效
的依据。 • 微量化和高效化：通过减少样本和试剂的使用量，实现微量化和高效化的ELISA实验，不仅可以减少浪费，
确保准确记录每个样本的原始数据，包括吸光度 和样本编号等信息。
对数据进行及时整理和筛选，排除异常值和缺失 值。
elisa操作步骤及注意事项
elisa操作步骤及注意事项以elisa操作步骤及注意事项为题，本文将为大家介绍elisa（酶联免疫吸附测定法）的操作步骤和注意事项。
一、操作步骤1. 准备工作在进行elisa实验前，需要准备好实验所需的试剂和仪器设备，包括酶标板、试剂盒、洗涤缓冲液、底物溶液、阻断缓冲液等。
同时，需要对实验室台面和仪器进行消毒，并佩戴好实验手套和口罩，以确保实验的准确性和安全性。
2. 样品处理将待测样品（如血清、尿液、细胞培养上清液等）和对照样品放置在室温下静置，使其达到室温后，进行稀释处理。
通常情况下，待测样品需要按照一定比例进行稀释，以确保其浓度处于检测范围之内。
3. 酶标板涂覆将酶标板中的亲和素或抗体溶液加入到孔板中，然后将其在4℃下静置过夜，使亲和素或抗体能够均匀地吸附在酶标板上。
4. 标准曲线制备将标准品按照一定比例稀释，以制备出一系列浓度递增的标准品溶液。
然后将这些标准品溶液依次加入已涂覆的酶标板孔中，孔位之间要保持一定的距离。
5. 样品孔加样将样品溶液加入到酶标板的样品孔中，注意每个孔的加样量要保持一致。
为了保证实验的准确性，通常会设置阳性对照孔和阴性对照孔，以验证实验的可靠性。
6. 孔板洗涤使用洗涤缓冲液对酶标板进行洗涤，去除未结合的物质和杂质。
洗涤时要注意洗涤液的温度和洗涤次数，以确保洗涤的充分彻底。
7. 酶标记物加入将酶标记的二抗或酶标记的亲和素加入到酶标板的孔中，使其与靶分子结合。
然后，将酶标板置于恒温摇床上，进行孵育反应，使酶标记物与靶分子发生特异性结合。
8. 反应终止通过加入反应终止溶液，使酶标记物的酶活性停止，并终止酶标记物与靶分子的结合。
终止溶液的选择要根据实验所使用的底物和酶标记物来确定。
9. 读板测定使用酶标仪或多功能酶标仪对酶标板进行测量，测定底物的反应产物的吸光度。
根据吸光度值，可以计算出样品中靶分子的浓度。
二、注意事项1. 严格控制实验条件在进行elisa实验时，需要严格控制实验条件，包括温度、湿度、时间等。
酶联免疫吸附实验(ELISA)的操作要点
酶联免疫吸附试验（ELISA）操作要点优质的试剂，良好的仪器和正确的操作是保证ELISA检测结果准确可靠的必要条件。
1 标本的采取和保存可用作ELISA测定的标本十分广泛，体液、分泌物和排泄物）等均可作标本以测定其中某种抗体或抗原成份。
有些标本可直接进行测定（如血清、尿液），有些则需经预处理（如粪便和某些分泌物）。
大部分ELISA检测均以血清为标本。
血浆中除尚含有纤维蛋白原和抗凝剂外，其他成份均同等于血清。
制备血浆标本需借助于抗凝剂，而血清标本只要待血清自然凝固、血块收缩后即可取得。
除特殊情况外，在医学检验中均以血清作为检测标本。
在ELISA中血浆和血清可同等应用。
血清标本可按常规方法采集，应注意避免溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以HRP为标记的ELISA测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色。
血清标本宜在新鲜时检测。
如有细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应。
如在冰箱中保存过久，其中的可发生聚合，在间接法ELISA中可使本底加深。
一般说来，在5天内测定的血清标本可放置于4℃，超过一周测定的需低温冰存。
冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀宜轻缓，避免气泡，可上下颠倒混和，不要在混匀器上强烈振荡。
混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。
反复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冰存。
保存血清自采集时就应注意无菌操作，也可加入适当防腐剂。
2 试剂的准备按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。
ELISA中用的蒸馏水或去离子水，包括用于洗涤的，应为新鲜的和高质量的。
自配的缓冲液应用pH计测量较正。
从冰箱中取出的试验用试剂应待温度与室温平衡后使用。
试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保存。
3 加样在ELISA中一般有3次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。
加样时应将所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。
ELISA检测注意事项
ELISA实验的影响因素
• 标本在冰箱中保存时间过长易导致血清 IgG聚合，使间接法的试剂本底加深，一 般血清置4℃冰箱5天内完成测试。如需 保存一周以上则要-20℃冰冻保存 • 融解时应上下颠倒充分混匀，同时避免 气泡 • 尽量避免反复冻融，反复冻融过程中产 生的机械剪切力将对样本中的蛋白等分 子产生破坏作用
（1）加样本及试剂量不准；孔间不一致； （2）加样过快，孔间发生污染； （3）加错样本； （4）加样本及试剂时，加在孔壁上部非包被区； （5）不同批号试剂盒中组分混用； （6）温育时间、洗板、显色时间不一致； （7）孔内污染杂物； （8）酶标仪滤光片不正确； （9）血清标本未完全凝固即加入，反应孔内出现纤维蛋白凝 固或残留血细胞，易出现假阳性反应等。
洗 涤
• ELISA是靠洗涤来达到分离结合与未结合 抗原抗体复合物及酶标记物的目的，同 时洗涤也可将非特异吸附的蛋白质的干 扰以及血球、细菌中的酶干扰清除掉。 • 最好要求使用洗板机：减少操作者人为 误差、保护操作者、降低板孔残液量。
洗 涤
• 以HRP作为标记酶的ELISA试剂盒中使用 的洗板液一般为含0.05%Tween20的中性 PBS，Tween20为一种非离子去垢剂，既 含亲水基团，也含疏水基团，其作用机理 是，借助其疏水基团与经疏水性相互作用 被动吸附于聚苯乙烯固相上蛋白的疏水基 团形成疏水键，从而削弱蛋白与固相的吸 附，促使蛋白质脱离固相而进入液相，这 样就可达到去掉非特异吸附物的目的。
ELISA试验中可能出现的问题 及原因分析
问题 可能的原因（非试剂盒本身的原因）
白板（阳性对照不显色） （1）漏加酶结合物； （2）洗板液配制中出现问题，如量筒； （4）终止剂当显色剂使用。 全部板孔均有显色 （1）洗板不干净； （2）显色液变质； （3）加底物的吸尖受酶或金属离子污染； （4）洗板液受酶等污染。 （5）由于仪器或加样头造成的交叉污染。
ELISA检测的注意事项
温浴影响，在建立 ELISA 方法作反应动力学研究时，实验表明，两次抗原 抗体 反应一般 在 37℃经 1-2 小时，产物的生成可达顶峰。为避免蒸发，板上应加盖，也可用塑料贴封纸 或保鲜膜覆盖板孔，反应板不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡。应注意温育的温度 和时间应按规定力求准确。由于公司的 试剂 盒温育是在空气浴中完成，采用水浴会造成值 偏高或花板。另外温育中还有边缘效应，边上的值会偏高，建议为了客观的判断结果，将质 控放在非边缘位置。96 孔酶标板结构特别;易产生边缘效应，抗原抗体结合及酶促反应对温 度有严格要求，酶标板周围与内部孔升降温速率不同，造成周边与内部孔结果差异;干浴与 水浴存在明显的差异，尽可能使用水浴，并要求固相板放入水中，减少受热不均，贴密封膜， 防止污物浸入。
基因工程抗原是抗原基因在质粒载体中原核或真核表达的蛋白质抗原，多以大肠杆菌或 酵 母 菌为表达系统。该类抗原与合成肽相比具有以下特点：
a.分子量大。合成肽采用化学方法制备，由于工艺的局限，合成数量有限，只能达到数百个 氨基酸;而利用基因工程制备的抗原，分子量更大。
b.稳定性好。包被的抗原的稳定性可使 试剂 盒的效期得到保证，早期以合成肽为包被抗原 的 试剂 盒效期只有 3-4 个月，采用基因工程抗原后效期大大延长了。
国内乙肝两对半试剂厂家较多;不同厂家出产的试剂灵敏度与特异性存在一定的差别，资料 显示，不同厂家试剂的特异性和敏感性分别为 89.4%—99.3%,78%—89%存在较大差异。有的 厂家酶标板孔间 A 值差大于 15%;标记酶的活性及显色液的稳定比较差。使用质劣的试剂必 然导致结果的假阳性或假阴性。因此。选择高质量的试剂是保证结果准确的关键之一。
ELISA酶联免疫吸附试验报告
大学实验报告酶联免疫吸附试验学院：专业：姓名：学号：一．实验原理酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种用酶标记抗原或抗体的方法，此法是将抗原、抗体免疫反应的特异性和酶的高效催化作用原理有机地结合起来的技术，可敏感地检测体液中微量的特异性抗原或抗体。
基本原理如下：①先使用抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性；②使抗原或抗体与某种酶联结成酶标抗原或酶标抗体，这种酶标抗原或酶标抗体即保留了其免疫活性，又保留了酶活性；③试验时，把受检标本（抗体或抗原）和酶标抗原或酶标抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应，用洗涤法去除固相载体上的游离物质，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的多少有关。
当加入酶反应的底物后，底物被酶催化而产生有色物质。
颜色反应深浅与受检抗原或抗体的量成正比。
因此，可借助颜色反应的深浅来定性、定量抗体或抗原。
本技术的特点是敏感性高，特异性强，操作简易，结果容易观察。
图1 ELISA实验原理示意图二．实验材料BSA抗原、兔抗BSA抗体（一抗，分别用PBS稀释成1:2, 1:4, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128, 1:256七个浓度）、酶标羊抗兔IgG（二抗）、0.05M PH9.6碳酸盐包被缓冲液、洗涤液（PBS）、底物溶液、2mol/L H2SO4。
三．实验方法1.包被板的处理：加BSA（包被缓冲液稀释为10μg/ml）至酶标板中，每孔100μl，置湿盒中4℃过夜。
第二天取出，用PBS洗涤3-4次。
2.取包被好的酶标板，在第一孔中加入100μl PBS作阴性对照，在第2-8孔加入上述稀释的一抗各100μl，置37℃保温1h。
3.倾去液体，用PBS洗涤3-4次后加入二抗各100μl，置37℃保温30min。
4.倾去液体，用PBS洗涤3-4次后加入底物溶液各100μl，在暗处37℃避光显色20min，最后加入50μl、2M H2SO4终止反应。
5.在波长490nm处，测定各孔的光密度吸收值。
酶联免疫吸附试验的注意事项
酶联免疫吸附试验的注意事项
酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是一种常用的实验方法，用于检测特定抗原或抗体的
存在。
在进行酶联免疫吸附试验时，需要注意以下事项：
1. 严格遵守实验室安全规范：实验室应具备适当的生物安全措施，如佩戴防护手套、实验室外套和眼镜等。
遵循正确的废弃物处置程序，以防止交叉感染。
2. 严格控制实验条件：在进行试验之前，要确保实验室温度、湿度和洁净度等条件符合要求。
避免因外界因素的干扰引起结果误差。
3. 选择合适的试剂和材料：尽可能选择高纯度的试剂和材料，以确保实验的准确性和可重复性。
4. 严格按照实验步骤操作：按照试剂和材料的添加顺序和比例，按照实验步骤进行操作。
在各个步骤中严格控制反应时间和温度。
5. 注意交叉污染的可能性：使用洁净台和洁净仪器，避免试剂和样品之间的交叉污染，尽量避免试剂间的接触。
6. 保证质量控制的合理性：在每次实验中设置适当的对照组，如阴性对照和阳性对照。
这有助于确保实验结果的准确性，并
监控试剂和仪器的性能。
7. 仔细读取和解读结果：根据试验结果进行正确的结果解读，应注意避免主观判断和误解。
8. 记录实验过程和结果：记录试验过程中的操作细节和实验结果，包括试剂名称、批号、使用日期等信息，以备将来进行结果分析和复查。
总之，要严格遵守实验操作规范和安全措施，保证实验条件的稳定和准确性，同时注意样品和试剂的交叉污染情况，并进行质量控制，严谨地进行实验操作和结果解读，以获得可靠的酶联免疫吸附试验结果。
酶联免疫吸附测定的操作要点
酶联免疫吸附测定试验（ELISA）的操作要点1标本的收集和保存（1）要注意避免出现严重溶血。
血红蛋白中含有血红素基团，其有类似过氧化物的活性，因此，在以辣根过氧化物酶（HRP）为标记酶的ELISA测定中，如血清标本中血红蛋白浓度较高，则其就很容易在温育过程中吸附于固相，从而与后面加入的HRP底物反应显色，从而产生非特异性发应。
（2）样本的采集及血清分离中要注意尽是避免细菌污染，一则细菌的生长，其所分泌的一些酶可能会对抗原抗体等蛋白产生分解作用；二则对用相应酶作标记的测定方法产生非特异性干扰。
（3）血清标本宜在新鲜时检测，放置时间过长均可产生假阳性反应，如在冰箱中保存过久，可发生聚合，在间接法中可使本底加深。
血清标本如是以无菌操作分离，则可以在2-8℃下保存一周，如为有菌操作，则建议冰冻保存。
样本的长时间保存，应在-70℃以下。
（4）冰冻保存的标本须注意避免因停电等造成的反复冻融。
标本的反复冻融所产生的机械剪切力将对标本中的蛋白等分子产生破坏作用，从而引起假阴性结果。
此外，冻结样本溶解后，蛋白质局部浓缩、分布不均，应充分混匀、轻缓、避免气泡，可上下颠倒混合，不要在混匀器上强烈振荡。
（5）标本在保存中如出现细菌污染所致的混浊或絮状物时，应离心沉淀后取上清检测。
反复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冰存。
保存血清自采集时就应注意无菌操作，也可以加入适当防腐剂。
2试剂的准备（1）在实验开始前，将试剂盒先从冰箱中取出，在室温下放置30分钟以上后，再进行测定，以使试剂盒在使用前与室温平衡。
这样做的目的，主要是为了缩短升温时间，使反应微孔内的温度能较快地达到所要求的高度，以满足测定要求。
（2）目前的ELISA试剂盒中的洗涤液均需在使用时对所提供的浓缩液稀释配制，因此稀释时所用的蒸馏水或去离子水应保证质量。
（3）当试剂盒以OPD为底物时，则底物溶液应在反应显色前临时配制。
3加样本及反应试剂在ELISA中一般有3次加样步骤，即加标本、加酶结合物、加底物。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
酶联免疫吸附试验（ELISA）注意事项
作者：任小龑
来源：《新校园·上旬刊》2015年第07期
摘要：本文主要探讨了酶联免疫吸附试验（ELISA）中常见的影响因素，对学生实验中常出现的问题进行原因分析，并总结解决办法。
ELISA试验操作中的各个环节对试验的检测效果影响较大，有可能导致显色不全、假阴性或假阳性结果。
关键词：酶联免疫;吸附试验;满版
实验室常用固相酶免疫测定方法在1971年最初建立，称为酶联免疫吸附测定（Enzyme linked immunsorbent assay），简称ELISA。
原理为抗原抗体特异性结合和抗原抗体的酶标记，以酶催化底物显色来判断结果。
影响酶联免疫测定的因素较多，如标本的采集保存、试剂的准备、加样的技术、温度的控制、洗涤反应板的方式、显色反应时间的控制等，均可能对试验结果产生很大影响。
只有避免这些因素，才能保证试验结果的准确性和可靠性。
一、移液枪的使用
我院免疫实验室常用手动单道移液器。
注意事项：（1）吸样前要保证枪头和液体处于相同温度;（2）若容量瓶中的液体太少，可倒入ep管中，方便吸取;（3）严格精确调节方法;（4）安装枪头要垂直插入，左右轻微转动上紧，上下敲击会引起内部的零部件因瞬间强烈撞击而松散;（5）垂直吸液，枪头吸嘴尖端需浸入液面2～4mm以下，一般液体，正向吸液1～2档，粘稠液可反向吸液2～1档，缓慢吸取，控制好弹簧的伸缩速度，太快会产生反冲和气泡，吸取后将移液枪提离液面，停顿1秒钟，观察是否有液滴流出，若有流出，说明有漏气现象;（6）放液时将吸嘴贴到容器内壁并保持10～400倾斜，平稳把按钮压到1档，停约一秒钟到2档，排出剩余液体。
吸取液体时一定要缓慢平稳地松开拇指，不能突然松开，以防溶液吸入过快而冲入枪体内腐蚀柱塞造成漏气。
移液枪应轻拿轻放，不能将已吸有液体的移液枪平放或倒置。
不要将按钮旋转出量程，否则会卡住内部机修装置而损坏;长时间不用时建议将刻度调至最大量程，让弹簧恢复原形，可延长使用寿命;定期对移液枪校准。
二、加样
加样不可太快，要避免加在孔壁上部。
不可溅出和产生气泡，如有气泡，抗原抗体不能有效地结合会导致弱阳性甚至假阴性。
三、温育
ELISA属于固相免疫测定，抗原和抗体必须在一定温度条件下反应一定的时间，微孔板从室温至恒温箱升至37℃，也需要一定时间。
而在临床实验中很少人注意这个问题，通常以放入温箱即开始计时，这样弱阳性样本测不出来，为避免蒸发，板上应封盖。
四、洗版
在实验室中，ELISA测定的洗版一般有两种方式，即手工和洗板机洗版，用洗板机洗版结果准确可靠。
五、显色
一般显色反应条件为37或室温反应15～30分钟。
在一定时间内，阴性孔可保持无色，而阳性孔随时间的延长而呈色加强，加TMB作用后，2小时可完全消退至无色。
六、比色
ELISA比色用酶标仪进行，应注意：
酶标仪不应放置在强光照射下，使用前先预热15～30分钟。
波长是否已调至合适或所用滤光片是否正确，通常我们在软件选项中选择双波长比色，它是在敏感波长450nm和非敏感波长630nm下两次吸光度的差值。
七、ELISA实际操作中常见问题和解决办法
1.显色淡，灵敏度低
实验前试剂盒至于室温30分钟以上，保温期内不宜多开门。
换用合格的蒸馏水，不要使用过期试剂。
2.满版白，阳性对照不显色
严格按照试剂说明书操作，加液时看准标签。
选用洁净量筒，正确稀释洗涤液，不要漏加试剂。
3.满板显色
显色时应避免保温，调准培养箱温度。
样品应新鲜，长期保存在-20℃冷冻保存。
防止污染，孵育时贴封片或加盖，洗涤要充分。
八、结论
酶联免疫吸附试验以灵敏度高、特异性好等特点，在临床上得到了广泛应用，严谨的设计、优质的试剂、良好的仪器和正确的操作是保证ELISA检测结果准确可靠的必要条件，严格遵照规定操作，必能得出准确的结果。
参考文献：
[1]宗永学，梅桂杰.酶联免疫吸附试验的影响因素分析及控制方法[J].中国疗养医学，2007（8）.
[2]李宁.影响酶联免疫吸附试验测定的关键环节[J].检验医学与临床，2006（7）.
[3]李文敏.酶联免疫吸附反应的技术进展及应用[J].湖北职业技术学院学报，2003（4）.
[4]张相国，张宏德.浅析影响酶联免疫吸附试验结果的因素及对策[J].职业与健康，2003（3）.
[5]蔡小月，张运洪.酶联免疫分析法检测献血员HBsAg假阳性1例[J].检验医学与临床，2009（11）.。