酶联免疫吸附分析精品PPT课件
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微生物与免疫学 实验四 酶联免疫吸附实验 ELISA(共34张PPT)
一 、ELISA法间接法检测血清中HBsAb 1．熟悉ELISA的原理。
洗涤液(浓缩液，用前以蒸馏水稀释25倍) （2）加样过快，孔间发生污染；
（9）血清标本未完全凝固即加入，反应孔内出现纤维蛋白凝固或残留血细胞，易出现假阳性反应等。
显色剂A、B（一般为四甲基联苯胺和H O ） Ag-Ab1 + Ab2* Ag-Ab1-Ab2*
• （6）温育时间、洗板、显色时间不一致；
（7）孔内污染杂物；
（8）酶标仪滤光片不正确；
（9）血清标本未完全凝固即加入，反应孔 内出现纤维蛋白凝固或残留血细胞，易出 现假阳性反应等。
• 3．白板
（阳性对照不显色） （1）漏加酶结合物；
（2）洗板液配制中出现问题，如量筒不干 净，含酶抑制物（如叠氮钠）等。
HBs Ag（ 本实 验测
）
+
HBe Ag
-
抗HBs（ 本实验 测）
-
+
+
-
+
+
-
+
-
-
-
-
+
-
-
-
-
-
+
抗HBe
-
+
+ -
抗HBc
结果分析
- HBV感染或无症状携带者
- 急慢性乙肝或携带者
+ “大三阳”急慢性乙肝患者（传染 性强）
+ “小三阳”急慢性乙肝感染，趋向 于恢复
+ 既往感染恢复期
+ 既往感染或“窗口期”
实验步骤
• 每4人一组，每组有检测HBsAg和检测HBsAb的 反应条各一条, 每条含6个反应孔。
洗涤液(浓缩液，用前以蒸馏水稀释25倍) （2）加样过快，孔间发生污染；
（9）血清标本未完全凝固即加入，反应孔内出现纤维蛋白凝固或残留血细胞，易出现假阳性反应等。
显色剂A、B（一般为四甲基联苯胺和H O ） Ag-Ab1 + Ab2* Ag-Ab1-Ab2*
• （6）温育时间、洗板、显色时间不一致；
（7）孔内污染杂物；
（8）酶标仪滤光片不正确；
（9）血清标本未完全凝固即加入，反应孔 内出现纤维蛋白凝固或残留血细胞，易出 现假阳性反应等。
• 3．白板
（阳性对照不显色） （1）漏加酶结合物；
（2）洗板液配制中出现问题，如量筒不干 净，含酶抑制物（如叠氮钠）等。
HBs Ag（ 本实 验测
）
+
HBe Ag
-
抗HBs（ 本实验 测）
-
+
+
-
+
+
-
+
-
-
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+
-
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抗HBe
-
+
+ -
抗HBc
结果分析
- HBV感染或无症状携带者
- 急慢性乙肝或携带者
+ “大三阳”急慢性乙肝患者（传染 性强）
+ “小三阳”急慢性乙肝感染，趋向 于恢复
+ 既往感染恢复期
+ 既往感染或“窗口期”
实验步骤
• 每4人一组，每组有检测HBsAg和检测HBsAb的 反应条各一条, 每条含6个反应孔。
酶免疫技术—酶联免疫吸附试验(免疫学检验课件)
（二）最适工作浓度的选择
在ELISA测定中应对包被抗原或抗体的浓度和酶标 抗原或抗体的浓度予以选择以达到最佳的测定条件以 间接法测抗体为例
1．酶标抗抗体工作浓度的选择
（1）用100ng/ml人IgG进行包被，洗涤。 （2）将酶标抗人IgG用稀释液作一系列稀释后分别加入已 包被的孔中，温育，洗涤。 （3）加底物显色。加酸终止反应后，读取吸光度（A）值 在1.0时的酶标抗体稀释度，作为酶标抗体的工作浓度。
抗原
E
E
E 底物
捕获法
EE E
E
（+）
EE
（-）
3．注意事项
采用固相捕获法检测IgM类抗体时要注意的 是RF（IgM类）及其它非特异IgM的干扰。RF （IgM类）能与固相抗人μ链抗体结合，并可与 随后加入的酶标抗体（动物IgG）反应，从而导 致假阳性反应。
非特异IgM由于其在第一步温育中， 可与特异IgM竞争与固相抗体结合，所以 会影响测定的灵敏度。因此，使用本法测 IgM，必须对临床样本进行适当稀释。
E
2．技术要点
（1）将特异性抗体包被于固相反应板上，洗涤。 （2）加待检标本,温育，洗涤。 （3）加酶标抗体，洗涤。 （4）加底物，根据颜色反应的程度进行该抗原的
定性或定量。
双抗体夹心法测抗原
EE E EE E
（+）
EE E
（-）
3．注意事项
双抗体夹心法中，应注意类风湿因子(RF) 的干扰。如果待检标本中含有RF，可能产生假 阳性结果。使用抗体的F(ab’)2或Fab片段作为酶 标抗体可消除RF的干扰。
E E
E
（+）
E EE
E EE
（-）
（2）竞争法检测HBeAb：
实验四酶联免疫吸附试验ELISA演示精品PPT课件
2、洗板：甩掉板孔中的溶液，每孔加入稀释好的洗涤液200μl，静置3分钟倒掉，再在吸水纸上拍干，重复 3次。
3、每孔加酶标单抗100μl，置37℃温育30分钟。 4、洗板：洗涤3次（方法同步骤2）。切记每次在干吸水纸上拍干。 5、显色与终止：每孔先加底物A液、再B液各1滴(50μl)，混匀。室温（18-25 ℃）避光显色10分钟后。 6、终止：每孔加终止液1滴(50μl) （0.25% 氢氟酸），终止反应。 7、10分钟内测定结果。采用波长630nm的酶标仪测定OD值。检测样本的OD值≥0.35为阳性 8、结果判定：试验成立的条件是：阴性对照孔平均OD630值与阳性对照孔平均OD630值之差≥0.4。 S=样品孔OD630值，N=阴性对照孔OD630值 如果S/N比值≤0.6，样品判定为PRV抗体阳性。 如果S/N比值≤0.7但> 0.6，样品重测。 如果S/N比值> 0.7，样品判定为PRV抗体阴性
双抗体夹心法（Sandwich ELISA)： • 将已知抗体吸附于固相载体，酶标记一抗 • 检测液相中的可溶性抗原
竞争法（Competitive ELISA) ： • 将已知抗体或抗原吸附于固相载体，酶标记抗原或抗体 • 检测液相中的可溶性抗原或抗体
阻断法（Block ELISA) ： • 将已知抗原吸附于固相载体，酶标记单克隆抗体 • 检测液相中的可溶性抗体
✓ 酶联免疫吸附试验：可溶性抗原或抗体 ✓ 酶免疫组化法： 组织中或细胞表面的抗原。
酶联免疫吸附试验
(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, EL或抗体检测液体（血液、细胞液） 中未知抗体或抗原的方法。
2.原理
（1）利用抗原与抗体的特异反应将待测物
实验方法
1.抗原的处理： 2.包被抗原： 取酶标板，加入100μL/孔的抗原稀释液
3、每孔加酶标单抗100μl，置37℃温育30分钟。 4、洗板：洗涤3次（方法同步骤2）。切记每次在干吸水纸上拍干。 5、显色与终止：每孔先加底物A液、再B液各1滴(50μl)，混匀。室温（18-25 ℃）避光显色10分钟后。 6、终止：每孔加终止液1滴(50μl) （0.25% 氢氟酸），终止反应。 7、10分钟内测定结果。采用波长630nm的酶标仪测定OD值。检测样本的OD值≥0.35为阳性 8、结果判定：试验成立的条件是：阴性对照孔平均OD630值与阳性对照孔平均OD630值之差≥0.4。 S=样品孔OD630值，N=阴性对照孔OD630值 如果S/N比值≤0.6，样品判定为PRV抗体阳性。 如果S/N比值≤0.7但> 0.6，样品重测。 如果S/N比值> 0.7，样品判定为PRV抗体阴性
双抗体夹心法（Sandwich ELISA)： • 将已知抗体吸附于固相载体，酶标记一抗 • 检测液相中的可溶性抗原
竞争法（Competitive ELISA) ： • 将已知抗体或抗原吸附于固相载体，酶标记抗原或抗体 • 检测液相中的可溶性抗原或抗体
阻断法（Block ELISA) ： • 将已知抗原吸附于固相载体，酶标记单克隆抗体 • 检测液相中的可溶性抗体
✓ 酶联免疫吸附试验：可溶性抗原或抗体 ✓ 酶免疫组化法： 组织中或细胞表面的抗原。
酶联免疫吸附试验
(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, EL或抗体检测液体（血液、细胞液） 中未知抗体或抗原的方法。
2.原理
（1）利用抗原与抗体的特异反应将待测物
实验方法
1.抗原的处理： 2.包被抗原： 取酶标板，加入100μL/孔的抗原稀释液
酶联免疫吸附实验ppt课件
作纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点。通 过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度。 3、若标本OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后 重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。 4、试剂盒灵敏度：最小可测人TNF-a达4pg/ml。
19
20
第四.五部分: 注意事项(1)
1、手工洗板时，甩尽孔内液体，每孔加洗涤 液350μl，静止30秒后甩尽液体，在厚迭吸 水纸上拍干，洗4次。
23
工作液 100ul/孔，封住板孔， 37℃孵育60分钟。
16
第四.三部分: 实验方法和步骤
9、洗板4次。 10 、除空白孔外，加入1：100稀释的酶结合
工作液(100 ul/孔).封住板孔, 37℃孵育30分 钟. 11 、洗板4次. 12、各孔加入显色剂100 ul/孔,避光37℃孵育 10-20分钟。 13、各孔加入终止液100ul/孔,混匀后即刻测 A450值(5分钟内)。15ຫໍສະໝຸດ 第四.三部分: 实验方法和步骤
5、从密封袋中取出所需板条，其它板条密封放回 4℃
6、除空白孔外，分别将不同浓度标准品/标本100ul/ 孔加入板条的相应孔中，标准品和标本应作双复 孔或三复孔。用封板胶纸封住反应孔，37℃孵育 90分钟。
7、洗板4次。 8、除空白孔外，加入1:100稀释的生物素化抗体(2a)
• 2、将浓缩洗涤液（4）用双蒸水稀释(1:20)。未 用完的放回4℃。
• 3、标准品:以标准品/标本稀释液(1b)1.0ml复溶冻 干标准品(1a), 静置15分钟后混匀，按说明稀释至 所需浓度，再进行倍比稀释至所需浓度。未用完 的复溶标准品放入-20℃保存, 稀释的标准品不应 重复使用。
• 4、可根据实际情况，将标本做适当倍数稀释(可 做预实验，以确定稀释倍数)。
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第四.五部分: 注意事项(1)
1、手工洗板时，甩尽孔内液体，每孔加洗涤 液350μl，静止30秒后甩尽液体，在厚迭吸 水纸上拍干，洗4次。
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工作液 100ul/孔，封住板孔， 37℃孵育60分钟。
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第四.三部分: 实验方法和步骤
9、洗板4次。 10 、除空白孔外，加入1：100稀释的酶结合
工作液(100 ul/孔).封住板孔, 37℃孵育30分 钟. 11 、洗板4次. 12、各孔加入显色剂100 ul/孔,避光37℃孵育 10-20分钟。 13、各孔加入终止液100ul/孔,混匀后即刻测 A450值(5分钟内)。15ຫໍສະໝຸດ 第四.三部分: 实验方法和步骤
5、从密封袋中取出所需板条，其它板条密封放回 4℃
6、除空白孔外，分别将不同浓度标准品/标本100ul/ 孔加入板条的相应孔中，标准品和标本应作双复 孔或三复孔。用封板胶纸封住反应孔，37℃孵育 90分钟。
7、洗板4次。 8、除空白孔外，加入1:100稀释的生物素化抗体(2a)
• 2、将浓缩洗涤液（4）用双蒸水稀释(1:20)。未 用完的放回4℃。
• 3、标准品:以标准品/标本稀释液(1b)1.0ml复溶冻 干标准品(1a), 静置15分钟后混匀，按说明稀释至 所需浓度，再进行倍比稀释至所需浓度。未用完 的复溶标准品放入-20℃保存, 稀释的标准品不应 重复使用。
• 4、可根据实际情况，将标本做适当倍数稀释(可 做预实验，以确定稀释倍数)。
酶联免疫吸附试验 PPT课件
7、 酶标二抗：稀释HRP标记羊抗猪IgG，每孔100µL， 37℃作用30min； 8、洗涤； 9、显色：加新鲜配制的TMB底物液每孔100µL，室温 避光作用15min； 10、加终止液：加50µL 2mol/L硫酸； 11、读数：用酶标仪检测OD450值。
ELISA的优点：
血清学方法有很多种, 如传统的琼脂扩散( A G ID ) 、 血 凝抑制( H A / H I ) 、 乳胶凝集、 试管凝集、补体结合 等方法，但这些方法不是最合适的检测方法。EILSA技 术与其有着不同的特点： 1、灵敏度高。ELI SA是通过酶促反应放大检测信号, 从 而提高检测的灵敏度, 其检测限可达 ng 甚至pg 水平, 可 做定量测定。 2、特异性强。ELI SA的每一步体的特异性识别过程, 结 构类似物、 有色物质、 荧光物质等对检测的影响很小。 3、样品的预处理过程和 ELI SA的操作步骤简单快捷， 有的试剂盒仅需1~2个小时即可得出检测结果，并且可同 时检测数十甚至上百个样品。 4、设备简单，适用于基层。
ELISA的应用
ELISA法是免疫诊断中的一项新技术，现已成功地应用 于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病 等方面的免疫诊断。也已应用于大分子抗原和小分子抗原 的定量测定，根据已经使用的结果，认为ELISA法具有灵 敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点。 不仅适用于临床标本的检查，而且由于一天之内可以检查 几百甚至上千份标本,因此，也适合于血清流行病学调查。 本法不仅可以用来测定抗体，而且也可用于测定体液中的 循环抗原，所以也是一种早期诊断的良好方法。因此 ELISA法在生物医学各领域的应用范围日益扩大。
+ 固相抗体 标本
+ 酶标抗体
+ 底物
酶联免疫吸附试验ppt课件
二、免疫标记技术的基本原理、类型
及应用
实验目的
掌握ELISA直接法的操作过程。 掌握免疫标记技术的分类、原理及应用。
实验原理示意图
包被抗原
实验材料
试剂：
器材：
封闭液 6ml 洗液(PBS-Tween20) 1瓶 样品稀释液(PBS) 4.5ml 兔血清 (已包被) 酶标抗体(HRP-Ab) 1.5ml 底物 4.5ml 终止液(H2SO4) 2ml
OPD见光易变质，与过氧化氢混合成底物应用 液后更不稳定，须现配现用。
TMB（四甲基联苯胺）
TMB经HRP作用后其产物显蓝色，目视对比鲜明。
TMB性质稳定，可配成溶液试剂，只需与H2O2溶液混和
即成应用液，可直接作底物使用。
酶反应用HCL或H2SO4终止后，产物由蓝色变成黄色，
可在比色计中定量，最适吸收波长为405nm。
酶标板(已包被) 1块 锡 纸 1张 200l pipette 1把 Tip 若干 试管 7支 1ml吸管(配胶帽) 1支 培养箱43℃ 1台/室 吸水纸 若干 记号笔 1支
实验步骤
1.
包被：用0.05M PH9.6碳酸盐包被缓冲液将抗原(正常兔血清)稀释至蛋白质含 量为10g／ml。100 l/well加入聚苯乙烯板酶标板中，4℃ over night。次 日，弃去孔内溶液。
?10ugml封闭的作用?包被时所用的抗原或抗体浓度较低吸收后固相载体表面尚有未被占据的空隙封闭就是让包被时所用的抗原或抗体浓度较低吸收后固相载体表面尚有未被占据的空隙封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙从而防止非特异性吸附影响结果的准确性
酶联免疫吸附试验 (ELISA直接法)
酶联免疫吸附试验(ELISA)PPT课件
6. 酶反应终止液 常用的HRP反应终止液为硫酸，其浓
度按加量及比色液的最终体积而异，在板 式ELISAБайду номын сангаас一般采用2mol/L。
7.参考标准品 定量测定的ELISA试剂盒应含有制作
标准曲线用的参考标准品，应包括覆盖可 检测范围的4-5个浓度，一般均配入含蛋 白保护剂及防腐剂的缓冲液中。
ELISA测定方法
前两种方法主要用于测定抗体和大分子 抗原，适用于临床诊断上，而竞争法事测 定小分子抗原的方法，因而尤其适用于食 品分析。
ELIZA 方法图示
间接法
“Indirect” ELISA
1.The steps of "indirect" ELISA follows the mechanism below: A buffered solution of the protein antigen to be tested for is added to each well of a microtiter plate, where it is given time to
5. 洗涤液 洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性
缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是 疏水性的，非离子型洗涤剂既含疏水基团 ，也含亲水基团，其疏水基团与蛋白质的 疏水基团借疏水键结合，从而削弱蛋白质 与固相载体的结合，并借助于亲水基团和 水分子的结合作用，使蛋白质回复到水溶 液状态，从而脱离固相载体。洗涤液中的 非离子型洗涤剂一般是吐温20，其浓度可 在0.05%-0.2%之间，高于0.2%时，可使 包被在固相上的抗原或抗体解吸附而减低 试验的灵敏度。
ELISA属于标记免疫学技术的一种，1971 年由荷兰和瑞典的学者提出，由于其操作过 程简单易行并可以定量，从而使其在食品安 全和卫生检测中得到了广泛的应用。目前市 场上有多种基于ELISA方法开发的用于食品 中抗生素检测的试剂盒产品。
elisa检测技术 ppt课件
生物素是一种生长因子，广泛分布于动、植物体内，又称辅 酶R或维生素H。亲和素由四个亚单位组成，对生物素具有高度 亲和力，即一个亲和素可以结合4个生物素分子。因此，本方法 具有信号放大功能（特点）。
该方法可用于抗原、抗体以及DNA和RNA（生物素）检测。
BAS-ELISA实验原理
竞争法ELISA
竞争法ELISA的实验原理：将包被了抗体的酶标板的微孔分 为测定孔和对照孔，在对照孔中加入已知浓度的系列标准品溶液 和酶标记物（酶标抗原）；在测定孔中同时加入酶标抗原和待检 样本（抗原），酶标抗原和样品互相竞争包被抗体的结合点，形 成酶标记的抗原-抗体复合物固定在微孔内，没有吸附的酶标抗 原通过洗涤去除，加入底物后，复合物上的酶催化底物生成有色 产物。当测定孔内的样本不含抗原时，固相上的抗体将和酶标抗 原结合，加入底物后显色较深；当样本含有抗原时，样本中的抗 原和酶标抗原共同竞争抗体的结合位点。酶标抗原结合的比例越 高，说明结合在固相抗体上的待测抗原就越少，反之亦然；在一 定的条件下，复合物上酶的量和酶产物呈现的色泽成正比，用分 光光度计进行测定，从而计算出参与反应的抗原和抗体的量，从 而进一步得知样本中抗原的多少。
37℃, 30min
洗涤3次, 拍干 加底物溶液 (空孔除外) 避光 37℃, 10-30min 加终止液 (空孔除外)
上机检测、绘制标准曲线 (空孔调零)
从标准曲线上 读取样品含量
ELISA试验中的注意事项
必须设立阳性、阴性和空孔对照孔，控制试验条件并检验 试剂盒的质量； 待测样品应设立双复孔或三复孔； 酶标板洗涤时确保洗涤干净，避免假阳性过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)
DH2+ H2O2
D + H2O
该方法可用于抗原、抗体以及DNA和RNA（生物素）检测。
BAS-ELISA实验原理
竞争法ELISA
竞争法ELISA的实验原理：将包被了抗体的酶标板的微孔分 为测定孔和对照孔，在对照孔中加入已知浓度的系列标准品溶液 和酶标记物（酶标抗原）；在测定孔中同时加入酶标抗原和待检 样本（抗原），酶标抗原和样品互相竞争包被抗体的结合点，形 成酶标记的抗原-抗体复合物固定在微孔内，没有吸附的酶标抗 原通过洗涤去除，加入底物后，复合物上的酶催化底物生成有色 产物。当测定孔内的样本不含抗原时，固相上的抗体将和酶标抗 原结合，加入底物后显色较深；当样本含有抗原时，样本中的抗 原和酶标抗原共同竞争抗体的结合位点。酶标抗原结合的比例越 高，说明结合在固相抗体上的待测抗原就越少，反之亦然；在一 定的条件下，复合物上酶的量和酶产物呈现的色泽成正比，用分 光光度计进行测定，从而计算出参与反应的抗原和抗体的量，从 而进一步得知样本中抗原的多少。
37℃, 30min
洗涤3次, 拍干 加底物溶液 (空孔除外) 避光 37℃, 10-30min 加终止液 (空孔除外)
上机检测、绘制标准曲线 (空孔调零)
从标准曲线上 读取样品含量
ELISA试验中的注意事项
必须设立阳性、阴性和空孔对照孔，控制试验条件并检验 试剂盒的质量； 待测样品应设立双复孔或三复孔； 酶标板洗涤时确保洗涤干净，避免假阳性过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)
DH2+ H2O2
D + H2O
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酶
硝基酚半乳糖苷(ONPG)
显色反 测定波长 应
橘红色 492 黄色 460 棕色 449 兰色 425 蓝绿色 642
黄色 红色 黄色 深蓝色来自荧光黄色400 500 405 420 360,450
420
ELISA的种类和变化
（一）双抗体夹心法 （二）间接法 （三）竞争法 （四）双位点一步法 （五）捕获法测IgM抗体 （六）应用亲和素和生物素的ELISA
用已知特异性 抗体包被 固相载体
测定管加待测抗原和 一定量的酶标抗原使二者与
固相抗体竞争结合
对照管只加一定量酶标抗原 与固相抗体直接结合
加底物显色
分别测定两管的吸光度值， 根据对照管与测定管吸光度值之比，
计算标本中待测抗原含量
分别洗涤 除去未结合
的成分
ELISA特点一：灵敏性
该测定法的灵敏度来自作为报告基团的酶 。酶是一种有机催化剂，很少量的酶即可诱导 大量的催化反应 ，产生可供观察的显色反应现 象。因此该体系常被称为酶放大体系。ELISA实 现了在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的 所在部位，或在微克、甚至纳克水平上对其进 行定量。
加待检标本: 使相应抗体与固相抗原结合
洗涤，除去无关的物质
加底物 显色
根据颜色反应的程度进行 该抗原的定性或定量测定
加酶标抗抗体: 与固相载体上抗原抗体 复合物结合；洗涤，除去 未结合的酶标抗抗体
1.原理
ELISA法间接法测定抗体
（三）竞争法
对照管由于只加酶标抗原，与固相抗体充分结合，故分解底物 显色深；测定管的显色程度则随待测抗原和酶标抗原与固相抗体竞 争结合的结果而异。如待测抗原量多，竞争性地抑制酶标抗原与固 相抗体结合，使固相上结合的酶标抗原量减少。因此，加入底物后 显色反应较弱。
例如，在测定血清中某一物质的含量时， 化学比色法的敏感度为mg/ml水平，酶反应测定 法的敏感度约为5-10μg/ml 。
特点二：特异性
其特异性来自抗体或抗原的选择性。 抗原抗体的结合实质上只发生在抗原的 抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间。 由于两者在化学结构和空间构型上呈互 补关系，所以抗原抗体反应具有高度的 特异性。
第七章 酶联免疫吸附分析
• 抗原：抗原是指进入人或动物机体后，可刺激 机体免疫系统发生免疫应答，从而引起动物产 生抗体或形成致敏淋巴细胞，并能和抗体或致 敏淋巴细胞发生特异性反应的物质。
• 抗体：是由抗原刺激动物的免疫系统后，由免 疫系统产生分泌的能和相应抗原发生特异性结 合的免疫球蛋白。
• 抗原抗体的基本特性：a、反应的特异性；b、 反应的等比例性
这种有色产物可用肉眼、光 学显微镜、电子显微镜观察，也 可以用分光光度计（酶标仪）加 以测定。
方法简单，方便迅速，特异性 强。
ELISA原理
酶及其底物
酶结合物（过碘酸盐氧化法、戊二醛交联法）是酶与抗体 或抗原在交联剂作用下联结的产物。是ELISA成败的关键试剂， 它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应，还具有酶促反应，显示 出生物放大作用，但不同的酶选用不同的底物 ，将得到不同 的颜色反应。
良好的ELISA板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各 板之间、同一板各孔之间、同一板各孔之间性能相近。
包被
• 将抗原或抗体固定化的过程称为包被(coating)。换言之， 包被即是抗原或抗体结合到固相载体表面的过程。
• 抗体或蛋白质等抗原是通过物理吸附与聚苯乙烯等固相 载体结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固 相载体表面的疏水基团间的相互作用。这种物理吸附是 非特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影 响。
的复合物
洗涤除去其他 未结合的物质
彻底洗涤 未结合的 酶标抗体
加底物进行 酶催化反应
根据颜色反应的 程度进行该抗原 的定性或定量测定
（二）间接法
间接法是检测 抗体最常用的方法， 其原理为利用酶标 记的抗抗体以检测 已与固相抗原结合 的受检抗体，故称 为间接法。
包被固相载体: 用已知抗原包被
固相载体
酶
底物
辣根过氧化物酶
邻苯二胺 四甲替联苯胺 氨基水杨酸 邻联苯甲胺 2,2‘-连胺基-2(3-乙基-并噻
唑啉磺酸-6)铵盐
碱性磷酸酯酶
4-硝基酚磷酸盐(PNP) 萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐
葡萄糖氧化酶
ABTS+HRP+葡萄糖 葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰
β-Ｄ－半乳糖苷 甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG)
ELISA试剂盒
ELISA试剂的作用
• 2.1 免疫吸附剂：
已包被抗原或抗体的固相载体，是ELISA方法中的核心试剂。 • 固相载体：
固相载体在ELISA测定过程中作为吸附剂和容器，不参与化学反 应。可作ELISA中载体的材料很多，最常用的是聚苯乙烯。专用于 EILSA的产品称为ELISA板，国际上标准的微量滴定板为8×12的96孔 式。
（一）双抗体夹心法
此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原
获得待分析物的未标定抗体
将特异性抗体与固相 载体连接形成固相抗体
加入封闭蛋白溶液以封闭载体 表面残留的蛋白结合位点
洗涤除去未结合的 抗体及杂质
洗涤并除去未结合的封闭蛋白
加受检标本（抗原）形成 固相抗体－抗原复合物
加酶标抗体生成 抗体—待测抗原—酶标记抗体
测量时，抗原（抗体）先结合在固相载体上，但仍保 留其免疫活性，然后加一种抗体（抗原）与酶结合成的偶 联物（标记物），此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性， 当偶联物与固相载体上的抗原（抗体）反应结合后， 再加上酶的 相应底物， 即起催化水 解或氧化还 原反应而呈 颜色。
ELISA原理
其所生成的颜色深浅与欲测 的抗原（抗体）含量成正比。
二、ELISA试剂
• ELISA要有三个必要的试剂，即免疫吸附剂、结合物和酶 的底物。
• 完整的ELISA试剂盒应包含以下各组分： （1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂，俗称酶 标板）； （2）酶标记的抗原或抗体（酶标记物）； （3）酶的底物； （4）系列参考标准品（定量测定）； （5）酶标记物及样本的稀释液； （6）洗涤液； （7）反应终止液。
抗原-抗体识别反应示意图
一、ELISA原理
它采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后 通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。测定的对象可 以是抗体也可以是抗原。
在这种测定方法中有3种必要的试剂： ①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂） ②酶标记的抗原或抗体（标记物） ③酶作用的底物（显色剂）
ELISA原理