酶联免疫吸附测定 ppt课件
合集下载
ELISA检测技术ppt课件
优点: 1. 特异性高、准确性好； 2. 实验操作简便，用时短。
缺点: 1. 应用范围较小，生产难度大。
——需制备各种酶标抗原或抗体。
.
11
间接法ELISA
间接法ELISA是将酶标记在二抗上，当抗体（一抗）和包被 在酶标板的抗原结合形成抗原-抗体复合物后，再以酶标二抗和 复合物结合，通过测定酶反应产物的颜色可以（间接）反映一抗 和抗原的结合情况，进而计算出抗原或抗体的量（见后图）。
竞争法ELISA的实验原理：将包被了抗体的酶标板的微孔分
为测定孔和对照孔，在对照孔中加入已知浓度的系列标准品溶液
和酶标记物（酶标抗原）；在测定孔中同时加入酶标抗原和待检
样本（抗原），酶标抗原和样品互相竞争包被抗体的结合点，形
成酶标记的抗原-抗体复合物固定在微孔内，没有吸附的酶标抗
原通过洗涤去除，加入底物后，复合物上的酶催化底物生成有色
.
2
ELISA的发展概况
自从Engvall和Perlman（瑞典，1971）首次报道建立酶联免 疫吸附试验（ELISA）以来，由于ELISA技术具有快速、敏感、 简便、易于标准化等优点，使其得到迅速的发展和广泛应用 。
随着生物技术的快速发展，将利用基因工程技术制备的抗原 或单克隆抗体包被酶标板后，极大地提高了ELISA检测技术的 特异性，加之电脑化程度极高的ELISA检测仪的使用，使 ELISA更为简便实用和标准化，从而使其成为最广泛应用的检 测方法之一。
.
5
酶标板
.
6
ELISA常用酶类
辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)
DH2+ H2O2
D + H2O
上式中，DH2为供氢体，H2O2为受氢体。
ELISA原理与应用-很详细PPT课件
它具有高灵敏度、高特异性和可定量等优点，广泛应用于生物医学研究、临床诊 断、食品安全等领域。
ELISA的原理
酶联免疫吸附测定的基本原理是抗原 -抗体反应，即利用抗原与抗体之间 的特异性结合，实现对目标分子的检 测。
随后加入酶标记的抗体或抗原，与固 相载体上的抗原或抗体发生特异性结 合，形成酶标记的抗原-抗体复合物。
Elisa技术简介
简要介绍Elisa技术的原理、特点、 分类和应用范围，让读者对Elisa技 术有一个初步的了解。
结合图表和图片，形象生动地展示 Elisa技术的操作流程和实验设计，便 于读者理解和记忆。
02
Elisa原理
酶联免疫吸附测定（ELISA）的定义
酶联免疫吸附测定（ELISA）是一种基于抗原-抗体反应的检测技术，通过酶标记的 方法，将抗原或抗体结合到固相载体上，实现对目标分子的定量或定性检测。
标准化问题
不同实验室间Elisa检测结果 的标准化问题尚未完全解决，
导致结果可比性不高。
对操作人员要求高
虽然Elisa技术操作简便，但 对操作人员的专业知识和技能
要求较高。
06
Elisa技术的发展趋势和未来展望
技术创新和改进
自动化技术
提高检测的自动化程度，减少人 工操作，提高检测效率。
纳米技术
利用纳米材料提高检测的灵敏度 和特异性，实现更精确的检测。
食品安全检测
食品中微生物检测
检测食品中的细菌、病毒和寄生虫等微生物，确保食品的安全性。
食品中农药残留检测
检测食品中农药残留量，控制食品中的农药污染。
食品添加剂检测
检测食品中的添加剂种类和含量，保证食品的质量和安全。
环境监测
水质监测
ELISA的原理
酶联免疫吸附测定的基本原理是抗原 -抗体反应，即利用抗原与抗体之间 的特异性结合，实现对目标分子的检 测。
随后加入酶标记的抗体或抗原，与固 相载体上的抗原或抗体发生特异性结 合，形成酶标记的抗原-抗体复合物。
Elisa技术简介
简要介绍Elisa技术的原理、特点、 分类和应用范围，让读者对Elisa技 术有一个初步的了解。
结合图表和图片，形象生动地展示 Elisa技术的操作流程和实验设计，便 于读者理解和记忆。
02
Elisa原理
酶联免疫吸附测定（ELISA）的定义
酶联免疫吸附测定（ELISA）是一种基于抗原-抗体反应的检测技术，通过酶标记的 方法，将抗原或抗体结合到固相载体上，实现对目标分子的定量或定性检测。
标准化问题
不同实验室间Elisa检测结果 的标准化问题尚未完全解决，
导致结果可比性不高。
对操作人员要求高
虽然Elisa技术操作简便，但 对操作人员的专业知识和技能
要求较高。
06
Elisa技术的发展趋势和未来展望
技术创新和改进
自动化技术
提高检测的自动化程度，减少人 工操作，提高检测效率。
纳米技术
利用纳米材料提高检测的灵敏度 和特异性，实现更精确的检测。
食品安全检测
食品中微生物检测
检测食品中的细菌、病毒和寄生虫等微生物，确保食品的安全性。
食品中农药残留检测
检测食品中农药残留量，控制食品中的农药污染。
食品添加剂检测
检测食品中的添加剂种类和含量，保证食品的质量和安全。
环境监测
水质监测
微生物与免疫学 实验四 酶联免疫吸附实验 ELISA(共34张PPT)
一 、ELISA法间接法检测血清中HBsAb 1．熟悉ELISA的原理。
洗涤液(浓缩液，用前以蒸馏水稀释25倍) （2）加样过快，孔间发生污染；
（9）血清标本未完全凝固即加入，反应孔内出现纤维蛋白凝固或残留血细胞，易出现假阳性反应等。
显色剂A、B（一般为四甲基联苯胺和H O ） Ag-Ab1 + Ab2* Ag-Ab1-Ab2*
• （6）温育时间、洗板、显色时间不一致；
（7）孔内污染杂物；
（8）酶标仪滤光片不正确；
（9）血清标本未完全凝固即加入，反应孔 内出现纤维蛋白凝固或残留血细胞，易出 现假阳性反应等。
• 3．白板
（阳性对照不显色） （1）漏加酶结合物；
（2）洗板液配制中出现问题，如量筒不干 净，含酶抑制物（如叠氮钠）等。
HBs Ag（ 本实 验测
）
+
HBe Ag
-
抗HBs（ 本实验 测）
-
+
+
-
+
+
-
+
-
-
-
-
+
-
-
-
-
-
+
抗HBe
-
+
+ -
抗HBc
结果分析
- HBV感染或无症状携带者
- 急慢性乙肝或携带者
+ “大三阳”急慢性乙肝患者（传染 性强）
+ “小三阳”急慢性乙肝感染，趋向 于恢复
+ 既往感染恢复期
+ 既往感染或“窗口期”
实验步骤
• 每4人一组，每组有检测HBsAg和检测HBsAb的 反应条各一条, 每条含6个反应孔。
洗涤液(浓缩液，用前以蒸馏水稀释25倍) （2）加样过快，孔间发生污染；
（9）血清标本未完全凝固即加入，反应孔内出现纤维蛋白凝固或残留血细胞，易出现假阳性反应等。
显色剂A、B（一般为四甲基联苯胺和H O ） Ag-Ab1 + Ab2* Ag-Ab1-Ab2*
• （6）温育时间、洗板、显色时间不一致；
（7）孔内污染杂物；
（8）酶标仪滤光片不正确；
（9）血清标本未完全凝固即加入，反应孔 内出现纤维蛋白凝固或残留血细胞，易出 现假阳性反应等。
• 3．白板
（阳性对照不显色） （1）漏加酶结合物；
（2）洗板液配制中出现问题，如量筒不干 净，含酶抑制物（如叠氮钠）等。
HBs Ag（ 本实 验测
）
+
HBe Ag
-
抗HBs（ 本实验 测）
-
+
+
-
+
+
-
+
-
-
-
-
+
-
-
-
-
-
+
抗HBe
-
+
+ -
抗HBc
结果分析
- HBV感染或无症状携带者
- 急慢性乙肝或携带者
+ “大三阳”急慢性乙肝患者（传染 性强）
+ “小三阳”急慢性乙肝感染，趋向 于恢复
+ 既往感染恢复期
+ 既往感染或“窗口期”
实验步骤
• 每4人一组，每组有检测HBsAg和检测HBsAb的 反应条各一条, 每条含6个反应孔。
elisa课件
药物活性评价
通过检测药物与靶点的结合活性，ELISA可用于评价药物的生物活 性和药效。
药物代谢动力学研究
ELISA可用于检测生物样品中药物的浓度，为药物代谢动力学研究 提供数据支持。
其他生物医学领域的应用拓展
免疫学研究
ELISA可用于检测各种免疫分子 ，如细胞因子、趋化因子等，为
免疫学研究提供重要工具。
适用范围广
可用于检测各种抗原和抗体，包 括蛋白质、多肽、激素、病毒等 。
02
ELISA实验设计与操作
实验设计原则与步骤
特异性
确保抗原与抗体的特异性结合。
敏感性
选择高灵敏度的检测方法和试剂。
实验设计原则与步骤
• 重复性：确保实验条件和操作的稳定性，以获得可靠的结 果。
实验设计原则与步骤
实验设计步骤 明确实验目的和检测指标。
操作流程规范
• 样本稀释：根据实验需要，用适当的稀释液稀释 样本。
操作流程规范
加样
将处理好的样本和试剂按照实验设计 加入相应的孔中。
温育
将加样后的酶标板放入温箱中，控制 适当的温度和时间进行温育。
操作流程规范
洗涤
用洗涤液充分洗涤酶标 板，去除未结合的抗原
或抗体。
显色
加入显色剂，使结合的 酶标记物催化底物显色
准确性。
多重ELISA技术
02
实现在同一反应体系中同时检测多种目标物，提高检测效率。
自动化ELISA技术
03
通过自动化设备和机器人技术，实现ELISA检测的自动化和智能
化。
面临的挑战和机遇分析
挑战
样本复杂性和多样性、检测灵敏度和特异性、交叉反应和干 扰等问题。
机遇
新技术和新方法的不断涌现、市场需求不断增长、政策支持 不断加强等。
通过检测药物与靶点的结合活性，ELISA可用于评价药物的生物活 性和药效。
药物代谢动力学研究
ELISA可用于检测生物样品中药物的浓度，为药物代谢动力学研究 提供数据支持。
其他生物医学领域的应用拓展
免疫学研究
ELISA可用于检测各种免疫分子 ，如细胞因子、趋化因子等，为
免疫学研究提供重要工具。
适用范围广
可用于检测各种抗原和抗体，包 括蛋白质、多肽、激素、病毒等 。
02
ELISA实验设计与操作
实验设计原则与步骤
特异性
确保抗原与抗体的特异性结合。
敏感性
选择高灵敏度的检测方法和试剂。
实验设计原则与步骤
• 重复性：确保实验条件和操作的稳定性，以获得可靠的结 果。
实验设计原则与步骤
实验设计步骤 明确实验目的和检测指标。
操作流程规范
• 样本稀释：根据实验需要，用适当的稀释液稀释 样本。
操作流程规范
加样
将处理好的样本和试剂按照实验设计 加入相应的孔中。
温育
将加样后的酶标板放入温箱中，控制 适当的温度和时间进行温育。
操作流程规范
洗涤
用洗涤液充分洗涤酶标 板，去除未结合的抗原
或抗体。
显色
加入显色剂，使结合的 酶标记物催化底物显色
准确性。
多重ELISA技术
02
实现在同一反应体系中同时检测多种目标物，提高检测效率。
自动化ELISA技术
03
通过自动化设备和机器人技术，实现ELISA检测的自动化和智能
化。
面临的挑战和机遇分析
挑战
样本复杂性和多样性、检测灵敏度和特异性、交叉反应和干 扰等问题。
机遇
新技术和新方法的不断涌现、市场需求不断增长、政策支持 不断加强等。
《elisa检测技术》ppt课件(2024)
拓展ELISA检测技术在生物医学、环境监测 、食品安全等领域的应用，推动相关产业的 发展。
2024/1/28
22
06 ELISA实验操作技巧与注 意事项
2024/1/28
23
实验前准备工作建议
01
仔细阅读试剂盒说明书 ，了解实验原理、操作 步骤和注意事项。
2024/1/28
02
准备好所需的试剂、耗 材和仪器，确保它们的 质量和性能符合要求。
去除异常值、缺失值等， 保证数据质量。
2024/1/28
数据转换
对数据进行对数转换、归 一化等处理，以满足后续 分析需求。
统计分析
采用t检验、方差分析等统 计方法，对实验组和对照 组数据进行比较，评估差 异显著性。
13
结果解读与报告撰写
结果解读
根据统计分析结果，结合专业知 识对实验数据进行解读，如判断 样品中目标物质的含量是否超标
《elisa检测技术》ppt课件
2024/1/28
1
目 录
2024/1/28
• ELISA检测技术概述 • ELISA实验方法与步骤 • ELISA实验数据分析与解读 • ELISA技术在生物医学领域应用 • ELISA技术挑战与发展趋势 • ELISA实验操作技巧与注意事项
2
01 ELISA检测技术概述
发展多重ELISA检测技术，实现对多个目标物的同时检测，提高检 测效率。
20
新型ELISA技术发展趋势
数字化ELISA
利用微流控、微阵列等技术，实现ELISA检测的数字化、自 动化和智能化。
免疫荧光ELISA
结合免疫荧光技术，提高ELISA检测的灵敏度和特异性。
化学发光ELISA
酶联免疫吸附测定法ppt课件
实验器材和药品
固相载体在ELISA测定过程中作为吸附 剂和容器。 最常用的是聚苯乙烯和聚氯乙 烯 。它们有较强的吸附蛋白质的性能，抗 体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的 免疫学活性。 微量滴定板，量滴定板为8×12的96孔 式。ELISA板的特点是可以同时进行大量标 本的检测，并可在特制的比色计上迅速读 出结果。聚苯乙烯经射线照射后，其吸附 性增加。
酶联免疫吸附测 定法
免疫学实验
基本原理 它采用抗原与抗体的特异反应将待
测物与酶连接，然后通过酶与底物产生 颜色反应，用于定量测定。测定的对象 可以是抗体也可以是抗原。
在这种测定方法中有3种必要的试剂：
①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂） ②酶标记的抗原或抗体（标记物） ③酶作用的底物（显色剂）
实验原理 双抗体夹心法
酶反应终止液
HRP反应终止液为硫酸，一般采用2mol/L AP用NaOH终止
实验方法:
1. 加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于已包被之反应 孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴 性对照孔及阳性对照孔)。 2. 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗 体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。 3. 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的底物溶 液0.1ml，37℃10～30分钟。 4. 终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。 5. 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果： 反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极 浅。也可测O·D值：在ELISA检测仪上，以空白对照孔调 零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍， 即为阳性。
几种酶标分析仪
NM-9602 标配酶标分析仪
酶联免疫吸附实验ppt课件
作纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点。通 过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度。 3、若标本OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后 重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。 4、试剂盒灵敏度：最小可测人TNF-a达4pg/ml。
19
20
第四.五部分: 注意事项(1)
1、手工洗板时，甩尽孔内液体，每孔加洗涤 液350μl，静止30秒后甩尽液体，在厚迭吸 水纸上拍干，洗4次。
23
工作液 100ul/孔，封住板孔， 37℃孵育60分钟。
16
第四.三部分: 实验方法和步骤
9、洗板4次。 10 、除空白孔外，加入1：100稀释的酶结合
工作液(100 ul/孔).封住板孔, 37℃孵育30分 钟. 11 、洗板4次. 12、各孔加入显色剂100 ul/孔,避光37℃孵育 10-20分钟。 13、各孔加入终止液100ul/孔,混匀后即刻测 A450值(5分钟内)。15ຫໍສະໝຸດ 第四.三部分: 实验方法和步骤
5、从密封袋中取出所需板条，其它板条密封放回 4℃
6、除空白孔外，分别将不同浓度标准品/标本100ul/ 孔加入板条的相应孔中，标准品和标本应作双复 孔或三复孔。用封板胶纸封住反应孔，37℃孵育 90分钟。
7、洗板4次。 8、除空白孔外，加入1:100稀释的生物素化抗体(2a)
• 2、将浓缩洗涤液（4）用双蒸水稀释(1:20)。未 用完的放回4℃。
• 3、标准品:以标准品/标本稀释液(1b)1.0ml复溶冻 干标准品(1a), 静置15分钟后混匀，按说明稀释至 所需浓度，再进行倍比稀释至所需浓度。未用完 的复溶标准品放入-20℃保存, 稀释的标准品不应 重复使用。
• 4、可根据实际情况，将标本做适当倍数稀释(可 做预实验，以确定稀释倍数)。
19
20
第四.五部分: 注意事项(1)
1、手工洗板时，甩尽孔内液体，每孔加洗涤 液350μl，静止30秒后甩尽液体，在厚迭吸 水纸上拍干，洗4次。
23
工作液 100ul/孔，封住板孔， 37℃孵育60分钟。
16
第四.三部分: 实验方法和步骤
9、洗板4次。 10 、除空白孔外，加入1：100稀释的酶结合
工作液(100 ul/孔).封住板孔, 37℃孵育30分 钟. 11 、洗板4次. 12、各孔加入显色剂100 ul/孔,避光37℃孵育 10-20分钟。 13、各孔加入终止液100ul/孔,混匀后即刻测 A450值(5分钟内)。15ຫໍສະໝຸດ 第四.三部分: 实验方法和步骤
5、从密封袋中取出所需板条，其它板条密封放回 4℃
6、除空白孔外，分别将不同浓度标准品/标本100ul/ 孔加入板条的相应孔中，标准品和标本应作双复 孔或三复孔。用封板胶纸封住反应孔，37℃孵育 90分钟。
7、洗板4次。 8、除空白孔外，加入1:100稀释的生物素化抗体(2a)
• 2、将浓缩洗涤液（4）用双蒸水稀释(1:20)。未 用完的放回4℃。
• 3、标准品:以标准品/标本稀释液(1b)1.0ml复溶冻 干标准品(1a), 静置15分钟后混匀，按说明稀释至 所需浓度，再进行倍比稀释至所需浓度。未用完 的复溶标准品放入-20℃保存, 稀释的标准品不应 重复使用。
• 4、可根据实际情况，将标本做适当倍数稀释(可 做预实验，以确定稀释倍数)。
酶联免疫吸附试验 PPT课件
7、 酶标二抗：稀释HRP标记羊抗猪IgG，每孔100µL， 37℃作用30min； 8、洗涤； 9、显色：加新鲜配制的TMB底物液每孔100µL，室温 避光作用15min； 10、加终止液：加50µL 2mol/L硫酸； 11、读数：用酶标仪检测OD450值。
ELISA的优点：
血清学方法有很多种, 如传统的琼脂扩散( A G ID ) 、 血 凝抑制( H A / H I ) 、 乳胶凝集、 试管凝集、补体结合 等方法，但这些方法不是最合适的检测方法。EILSA技 术与其有着不同的特点： 1、灵敏度高。ELI SA是通过酶促反应放大检测信号, 从 而提高检测的灵敏度, 其检测限可达 ng 甚至pg 水平, 可 做定量测定。 2、特异性强。ELI SA的每一步体的特异性识别过程, 结 构类似物、 有色物质、 荧光物质等对检测的影响很小。 3、样品的预处理过程和 ELI SA的操作步骤简单快捷， 有的试剂盒仅需1~2个小时即可得出检测结果，并且可同 时检测数十甚至上百个样品。 4、设备简单，适用于基层。
ELISA的应用
ELISA法是免疫诊断中的一项新技术，现已成功地应用 于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病 等方面的免疫诊断。也已应用于大分子抗原和小分子抗原 的定量测定，根据已经使用的结果，认为ELISA法具有灵 敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点。 不仅适用于临床标本的检查，而且由于一天之内可以检查 几百甚至上千份标本,因此，也适合于血清流行病学调查。 本法不仅可以用来测定抗体，而且也可用于测定体液中的 循环抗原，所以也是一种早期诊断的良好方法。因此 ELISA法在生物医学各领域的应用范围日益扩大。
+ 固相抗体 标本
+ 酶标抗体
+ 底物
酶联免疫吸附试验ppt课件
二、免疫标记技术的基本原理、类型
及应用
实验目的
掌握ELISA直接法的操作过程。 掌握免疫标记技术的分类、原理及应用。
实验原理示意图
包被抗原
实验材料
试剂：
器材：
封闭液 6ml 洗液(PBS-Tween20) 1瓶 样品稀释液(PBS) 4.5ml 兔血清 (已包被) 酶标抗体(HRP-Ab) 1.5ml 底物 4.5ml 终止液(H2SO4) 2ml
OPD见光易变质，与过氧化氢混合成底物应用 液后更不稳定，须现配现用。
TMB（四甲基联苯胺）
TMB经HRP作用后其产物显蓝色，目视对比鲜明。
TMB性质稳定，可配成溶液试剂，只需与H2O2溶液混和
即成应用液，可直接作底物使用。
酶反应用HCL或H2SO4终止后，产物由蓝色变成黄色，
可在比色计中定量，最适吸收波长为405nm。
酶标板(已包被) 1块 锡 纸 1张 200l pipette 1把 Tip 若干 试管 7支 1ml吸管(配胶帽) 1支 培养箱43℃ 1台/室 吸水纸 若干 记号笔 1支
实验步骤
1.
包被：用0.05M PH9.6碳酸盐包被缓冲液将抗原(正常兔血清)稀释至蛋白质含 量为10g／ml。100 l/well加入聚苯乙烯板酶标板中，4℃ over night。次 日，弃去孔内溶液。
?10ugml封闭的作用?包被时所用的抗原或抗体浓度较低吸收后固相载体表面尚有未被占据的空隙封闭就是让包被时所用的抗原或抗体浓度较低吸收后固相载体表面尚有未被占据的空隙封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙从而防止非特异性吸附影响结果的准确性
酶联免疫吸附试验 (ELISA直接法)
酶联免疫吸附试验(ELISA)PPT课件
6. 酶反应终止液 常用的HRP反应终止液为硫酸，其浓
度按加量及比色液的最终体积而异，在板 式ELISAБайду номын сангаас一般采用2mol/L。
7.参考标准品 定量测定的ELISA试剂盒应含有制作
标准曲线用的参考标准品，应包括覆盖可 检测范围的4-5个浓度，一般均配入含蛋 白保护剂及防腐剂的缓冲液中。
ELISA测定方法
前两种方法主要用于测定抗体和大分子 抗原，适用于临床诊断上，而竞争法事测 定小分子抗原的方法，因而尤其适用于食 品分析。
ELIZA 方法图示
间接法
“Indirect” ELISA
1.The steps of "indirect" ELISA follows the mechanism below: A buffered solution of the protein antigen to be tested for is added to each well of a microtiter plate, where it is given time to
5. 洗涤液 洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性
缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是 疏水性的，非离子型洗涤剂既含疏水基团 ，也含亲水基团，其疏水基团与蛋白质的 疏水基团借疏水键结合，从而削弱蛋白质 与固相载体的结合，并借助于亲水基团和 水分子的结合作用，使蛋白质回复到水溶 液状态，从而脱离固相载体。洗涤液中的 非离子型洗涤剂一般是吐温20，其浓度可 在0.05%-0.2%之间，高于0.2%时，可使 包被在固相上的抗原或抗体解吸附而减低 试验的灵敏度。
ELISA属于标记免疫学技术的一种，1971 年由荷兰和瑞典的学者提出，由于其操作过 程简单易行并可以定量，从而使其在食品安 全和卫生检测中得到了广泛的应用。目前市 场上有多种基于ELISA方法开发的用于食品 中抗生素检测的试剂盒产品。
elisa检测技术 ppt课件
生物素是一种生长因子，广泛分布于动、植物体内，又称辅 酶R或维生素H。亲和素由四个亚单位组成，对生物素具有高度 亲和力，即一个亲和素可以结合4个生物素分子。因此，本方法 具有信号放大功能（特点）。
该方法可用于抗原、抗体以及DNA和RNA（生物素）检测。
BAS-ELISA实验原理
竞争法ELISA
竞争法ELISA的实验原理：将包被了抗体的酶标板的微孔分 为测定孔和对照孔，在对照孔中加入已知浓度的系列标准品溶液 和酶标记物（酶标抗原）；在测定孔中同时加入酶标抗原和待检 样本（抗原），酶标抗原和样品互相竞争包被抗体的结合点，形 成酶标记的抗原-抗体复合物固定在微孔内，没有吸附的酶标抗 原通过洗涤去除，加入底物后，复合物上的酶催化底物生成有色 产物。当测定孔内的样本不含抗原时，固相上的抗体将和酶标抗 原结合，加入底物后显色较深；当样本含有抗原时，样本中的抗 原和酶标抗原共同竞争抗体的结合位点。酶标抗原结合的比例越 高，说明结合在固相抗体上的待测抗原就越少，反之亦然；在一 定的条件下，复合物上酶的量和酶产物呈现的色泽成正比，用分 光光度计进行测定，从而计算出参与反应的抗原和抗体的量，从 而进一步得知样本中抗原的多少。
37℃, 30min
洗涤3次, 拍干 加底物溶液 (空孔除外) 避光 37℃, 10-30min 加终止液 (空孔除外)
上机检测、绘制标准曲线 (空孔调零)
从标准曲线上 读取样品含量
ELISA试验中的注意事项
必须设立阳性、阴性和空孔对照孔，控制试验条件并检验 试剂盒的质量； 待测样品应设立双复孔或三复孔； 酶标板洗涤时确保洗涤干净，避免假阳性过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)
DH2+ H2O2
D + H2O
该方法可用于抗原、抗体以及DNA和RNA（生物素）检测。
BAS-ELISA实验原理
竞争法ELISA
竞争法ELISA的实验原理：将包被了抗体的酶标板的微孔分 为测定孔和对照孔，在对照孔中加入已知浓度的系列标准品溶液 和酶标记物（酶标抗原）；在测定孔中同时加入酶标抗原和待检 样本（抗原），酶标抗原和样品互相竞争包被抗体的结合点，形 成酶标记的抗原-抗体复合物固定在微孔内，没有吸附的酶标抗 原通过洗涤去除，加入底物后，复合物上的酶催化底物生成有色 产物。当测定孔内的样本不含抗原时，固相上的抗体将和酶标抗 原结合，加入底物后显色较深；当样本含有抗原时，样本中的抗 原和酶标抗原共同竞争抗体的结合位点。酶标抗原结合的比例越 高，说明结合在固相抗体上的待测抗原就越少，反之亦然；在一 定的条件下，复合物上酶的量和酶产物呈现的色泽成正比，用分 光光度计进行测定，从而计算出参与反应的抗原和抗体的量，从 而进一步得知样本中抗原的多少。
37℃, 30min
洗涤3次, 拍干 加底物溶液 (空孔除外) 避光 37℃, 10-30min 加终止液 (空孔除外)
上机检测、绘制标准曲线 (空孔调零)
从标准曲线上 读取样品含量
ELISA试验中的注意事项
必须设立阳性、阴性和空孔对照孔，控制试验条件并检验 试剂盒的质量； 待测样品应设立双复孔或三复孔； 酶标板洗涤时确保洗涤干净，避免假阳性过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)
DH2+ H2O2
D + H2O
1酶联免疫吸附试验ELISA课件
0.2mL
0.2mL
0.2mL
0.2mL
0.2mL
… …
… …
… …
… …
… …
… …
… …
… …
… …
摇匀，37℃，水浴15min
（1份/2人）
预期果：
1．管内液体混浊呈浅红色为不溶血，管内液体透明呈红色为溶血。
溶血
不溶血
2.
试验管
血清对照管
抗原对照管
补体对照管
SRBC对照管
？
溶血
溶血
溶血
不溶血
1.酶联免疫吸附试验（ELISA)
免疫标记技术
定义： 将抗原-抗体反应与标记技术相结合，用放射性同位素、酶或荧光素标记的已知抗体或抗原，通过检测标记物，间接测定未知的抗原或抗体。 分类： 放射免疫测定法：131I，32P 免疫荧光技术：FITC，PE 免疫酶测定法：HRP，AP
免疫酶测定法 (Enzyme ImmunoAssay,EIA)
材料：
方法：
1
2
3
4
5
试验管
血清 对照管
抗原 对照管
补体 对照管
SRBC 对照管
待测血清
0.2mL
0.2mL
0.2mL
0.2mL
0.2mL
0.2mL
0.2mL
0.2mL
0.2mL
0.2mL
0.4mL
0.8mL
抗原
补体
N.S
摇匀，37℃，水浴15min
溶血素
SRBC
0.2mL
0.2mL
0.2mL
0.2mL
酶联免疫吸附试验 (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)
0.2mL
0.2mL
0.2mL
0.2mL
… …
… …
… …
… …
… …
… …
… …
… …
… …
摇匀，37℃，水浴15min
（1份/2人）
预期果：
1．管内液体混浊呈浅红色为不溶血，管内液体透明呈红色为溶血。
溶血
不溶血
2.
试验管
血清对照管
抗原对照管
补体对照管
SRBC对照管
？
溶血
溶血
溶血
不溶血
1.酶联免疫吸附试验（ELISA)
免疫标记技术
定义： 将抗原-抗体反应与标记技术相结合，用放射性同位素、酶或荧光素标记的已知抗体或抗原，通过检测标记物，间接测定未知的抗原或抗体。 分类： 放射免疫测定法：131I，32P 免疫荧光技术：FITC，PE 免疫酶测定法：HRP，AP
免疫酶测定法 (Enzyme ImmunoAssay,EIA)
材料：
方法：
1
2
3
4
5
试验管
血清 对照管
抗原 对照管
补体 对照管
SRBC 对照管
待测血清
0.2mL
0.2mL
0.2mL
0.2mL
0.2mL
0.2mL
0.2mL
0.2mL
0.2mL
0.2mL
0.4mL
0.8mL
抗原
补体
N.S
摇匀，37℃，水浴15min
溶血素
SRBC
0.2mL
0.2mL
0.2mL
0.2mL
酶联免疫吸附试验 (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
ELISA检测“非典型肺炎”冠状病毒
ELISA法筛查α-地中海贫血 ELISA法定量检测乙肝抗原两对半
……
ppt课件
20
基础医学领域的应用 ----ELISA试剂盒商业资讯
ppt课件
21
ELISA在其他相关领域中的应用
食品安全
法医物证
环境卫生
ppt课件
……
22
酶催化底物液显色
DH2+ H2O2 D+ 2H2O
第 一
管
管
100µL
第 二
管
S
100µL
第 十
管
600µL
300µL
300µL
300µL
1:400 A
1:1600
1:6400
B
123 4
5
6
78
每孔100ul,上下两排一致
ppt课件
…….
9 10 11
从低浓度往 高浓度加,
12 blank
13
ELISA的分类
（一）直接法 （二）间接法 （三）双抗体夹心法 （四）竞争法
ppt课件
25
结果的判定
空白对照无显色，而样品显色明显且逐渐变 浅
待检样品孔显色明显
ppt课件
空白对照
26
ELISA标准曲线
Ab浓度（ng/ml）
ppt课件
27
注意事项
对照的设定（阳性对照，阴性对照，空白对照） 倍比稀释时，要正确操作；加样时从低浓度向高
浓度方向进行 终止反应的时间：以空白对照孔未显色为准 2M H2SO4具有腐蚀性，操作过程中应避免外溢 将加样枪调到最大量程（见加样枪顶部数字） 将所有剩余液体倒入水池，所有塑料制品开盖回
鼠IgG抗血清，37 ℃ 30min
洗涤：3次，
→1min/次
EE 洗涤：3次， →1min/次
EE
→ 底物液 终止液终止显色 空白对照无显色
待测样品显色明显
加酶标抗体：1:5000稀释的 HRP标记的驴抗兔IgG抗血 清， 37 ℃ 30min
加底物液显色
ppt课件
11
倍比稀释法与加样
样 品
100µL
ppt课件
15
（一）直接法
ppt课件
16
（二）间接法
间接法的原理为 利用酶标记的抗抗体 以检测已与固相结合 的受检抗体，故称为 间接法。
其优点在于只要 变换包被抗原就可利 用同一酶标抗抗体建 立检测相应抗体的方 法。可用于传染病的 诊断。
ppt课件
17
（三）双抗体夹心法
只要获得针对受检抗原的特异性抗体，就可用于包被固相载体和制 备酶结合物而建立此法。此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原， 例如HBsAg、HBeAg、AFP等。
是否会认为老师的教学方法需要改进？
• 你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？ • 教师的教鞭 • “不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我
笨，没有学问无颜见爹娘 ……”
• “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”
用示踪物质标记抗体或抗原，使其与相应的抗原或抗体 反应，使微量的、不可见的反应成为可见的或可测定的。
ppt课件
18
（四）竞争法
当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原 时，可用此法检测特异性抗体。
小分子抗原或半抗原缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不
能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。小分子激素、药
物等ELISA测定多用此法。
ppt课件
19
ELISA在医学中的应用
临床疾病诊断中的应用
收到讲台
ppt课件
28
需要搞清楚的问题
1. 什么是免疫标记技术？为什么要进行标记?
三大免疫标记技术：放射免疫技术、荧光免疫技术、酶免 疫技术。
2. ELISA的原理、定义及基本分类 3. 实验对照的设立及其意义 4. 了解ELISA在临床中的广泛应用
ppt课件
29
酶联免疫吸附测定
（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA ）
ppt课件
1
操作步骤 每种液体均加100ul／孔
→
洗涤：3次，
→1min/次
包被：1：5000稀释的正 常小鼠血清，4℃过夜
封闭：5%脱脂奶粉， 加待检抗体：倍比稀释的兔抗
37 ℃ ，20min
鼠IgG抗血清，37 ℃ 30min
洗涤：3次，
→1min/次
EE 洗涤：3次， →1min/次
EE
→ 底物液 终止液终止显色 空白对照无显色
待测样品显色明显
加酶标抗体：1:5000稀释的 HRP标记的驴抗兔IgG抗血 清， 37 ℃ 30min
加底物液显色
ppt课件
2
精品资料
• 你怎么称呼老师？ • 如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你
ppt课件
5
同位素131I标记抗体指示小鼠肿瘤
ppt课件
6
免
疫
荧
光
技
术
用FITC-抗IgM单抗计数B细胞
用FITC-抗IgM单抗计数B细胞
ppt课件
7
课程内容
ELISA的原理 ELISA的分类 间接ELISA的具体操作 ELISA在医学中的应用实例
ppt课件
8
ELISA的原理
1.抗原抗体反应的特异性
稀释液/稀： pH7.4 0.05M的PBS（磷酸盐缓冲液）
洗液：PBST（PBS+0.1%吐温20）
ppt课件
10
显色液：OPD（邻苯二胺）
操作步骤
每种液体均加100ul
→
洗涤：3次，
→1min/次
包被：1：5000稀释的正 常小鼠血清，4℃过夜
封闭：5%脱脂奶粉， 加待检抗体：倍比稀释的兔抗
37 ℃ 30min
E
DH2为供氢体， H2O2为受氢体。
DH2一般为无色化合物，经酶作用后氧化成为有色
的产物。
ppt课件
23
ppt课件
24
结果的判定
肉眼判定结果：于白色背景上直接肉眼观察。颜色越 深，反应越强；阴性反应为无色或极浅。根据 颜色的深浅，以“＋”、“－”表示。
测定A值：在酶标仪上，根据不同底物设定波长 （OPD底物为490nm，TMB底物为450nm），以 空白孔调零后测各孔OD值。以高于阴性对照孔 OD值2倍为阳性。
2.抗原或抗体的固相化
3.抗原或抗体的酶标记
ppt课件
E
9
间接ELISA
实验目的：测小鼠IgG免疫兔血清中抗小鼠IgG抗体的效价 实验材料：包被抗原：小鼠血清
待检抗体/一抗：兔抗小鼠IgG
酶标抗体/二抗：HRP-驴抗兔IgG
聚苯乙烯酶标板 水浴箱
移液器
枪头
包被液：pH9.6的碳酸盐缓冲液
封闭液/ 封：5%脱脂奶粉