BMSCs视网膜下移植对大鼠视网膜光感受器细胞凋亡的影响及机制研究

caspase －3活性后，会影响细胞凋亡过程，使得细胞增殖与凋亡之间的平衡状态受到破坏，在此情况下有可能
导致诸多肿瘤如肝癌等发生和发展。

Survivin 与caspase －3的关系较为密切，尤其是促进细胞凋亡方面。

在肿瘤组织中，Survivin 呈现特异性表达，但低表达于正常成年人分化的成熟组织中，被认为是肿瘤基因疗法的重要靶基因。

有研究指出［16］
，Survivin 在肝癌患者中呈现高表达，并且与肝癌的病理过程和预后效果存在
显著关系。

本研究中，联用组裸鼠caspase －3阳性细胞率为（77．89ʃ7．35）%，较对照组（19．89ʃ4．14）%、顺铂组（64．86ʃ9．34）%、苦参碱组（36．97ʃ9．35）%均显著上升。

联用组裸鼠Survivin 阳性细胞率为（20．04ʃ4．37）%，较对照组（84．85ʃ14．75）%、顺铂组（39．05ʃ7．69）%、苦参碱组（64．06ʃ9．14）%均显著降低。

结果表明，苦参碱可促使caspase －3表达升高，Survivin 表达降低，并且与顺铂联用可发挥协同效应，起到显著的抗癌作用。

4结论
综上所述，单用顺铂或苦参碱对人肝癌细胞株HepG2裸鼠移植瘤均具有一定的抑瘤作用，且二者联用的抑瘤作用更为明显。

分析其作用机制，可能与苦参碱
联合顺铂处理可对caspase －3、
Survivin 表达水平造成影响，促使caspase －3表达升高，Survivin 表达降低，进而
促使肿瘤细胞凋亡存在密切关系。

从而可推测苦参碱联合顺铂即可协同抑制肝癌细胞增殖和降低不良反应或调节机体的免疫功能，进而达到改善预后、提高患者生活质量的目的。

但有关顺铂与苦参碱联合应用对肝癌抑制作用的具体影响机制仍未完全明确，今后仍需进一步探讨和总结。

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Ｒev Med Pharmacol Sci ，2018，22（2）：382－387．
（收稿日期：2018－12－20）
DOI ：10．3969/j．issn．1671－4695．2019．05．004文章编号：1671－4695（2019）05－0460－05
BMSCs 视网膜下移植对大鼠视网膜光感受器细胞凋亡的影响及机制研究
王宁1
孙海霞2
（1辽宁省铁岭市中心医院眼科辽宁
铁岭112000；
2青海省人民医院心脏超声室青海西宁810007）
基金项目：青海省自然科学基金项目（编号：132810045101230）
【摘要】目的研究骨髓间充质干细胞（BMSCs ）视网膜下移植对大鼠视网膜光感受器细胞凋亡的影响及机制。

方法取32只6周龄的SPF 级SD 雄性大鼠，随机分为A 组（未进行任何处理）、
B 组（于视网膜下注入无菌生理盐水）、
C 组（以BMSCs 为溶质，于视网膜下注入磷酸盐溶液）、
D 组（于视网膜下移植BMSCs2ˑ105/g 个），每组各8只。

其中，C 、D 组采用光照射1d ，于7d 后进行手术，术后2周摘除眼球。

大鼠BMSCs 原代和传代培养，切片并行苏木精－伊红染色，观察BMSCs 细胞形态学情况，并对视网膜外核层的层数进行计算。

根据免疫荧光法，对大鼠眼内BMSCs 中的睫状
神经营养因子（CNIF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、脑源性神经营养因子（BDNF）的表达水平进行检测，并根据Tunel细胞凋亡检测试剂盒对细胞凋亡情况进行检测。

结果BMSCs细胞刚接种时呈圆形，大小均匀，胞体透亮，胞膜清晰；混有红细胞且呈扁平状、大小不均。

BMSCs细胞接种1d后，贴壁细胞出现，且呈多角形、椭圆形或梭形，而在定期换液中未贴壁的细胞逐渐被清除。

BMSCs细胞接种1周后迅速增长，2周后80%以上的贴壁细胞融合，并呈现漩涡状。

D组视网膜外核层的层数明显少于A组，而明显多于B、C组（P＜0．01）。

D组细胞凋亡率明显高于A组，而明显低于B、C组（P＜0．01）。

DAPI阳性的BMSCs于视网膜下腔并不表达CNIF与BDNF，但其表达bFGF。

结论于视网膜下移植BMSCs具有抑制视网膜光感受器细胞凋亡的作用，作用机制可能与其于视网膜下腔分泌bFGF有关。

【关键词】大鼠骨髓间充质干细胞视网膜下移植视网膜光感受器细胞损伤细胞凋亡
Effect and mechanism of BMSCs subretinal transplantation on rat retinal photoreceptor cell apoptosis．WANG Ning1，SUN Hai－xia2．1 Department of Ophthalmology，Liaoning Tieling Central Hospital Tieling Liaoning112000，China；2Department of Cardiac UltrasoundＲoom，Qinghai People＇s Hospital，Xining Qinghai810007，China．
【Abstract】Objective To study the effect of subretinal transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells（BMSCs）on rat retinal photoreceptor cell apoptosis and its mechanism．Methods Thirty－two6－week－old SPF SD male rats were randomly divided into group A （without any treatment），group B（injecting sterile saline into the retina），group C（injecting phosphate solution into the retina with BMSCs as solute），and group D（transplanting BMSCs into the retina with2ˑ105/g），with8rats in each group．Group C and D were treated with light for 1day，followed by surgery7days later，and eyeballs were removed2weeks after operation．The layers of outer retinal nucleus were calculated by hematoxylin－eosin staining in primary and passage culture of rat BMSCs．Morphology of BMSCs cells was observed and the layers of the outer reti-nal nucleus were calculated．The expression of ciliary neurotrophic factor（CNIF），basic fibroblast growth factor（bFGF）and brain－derived neu-rotrophic factor（BDNF）in rat BMSCs was determined by immunofluorescence method．The level of apoptotic cells was detected，and the apoptotic status was detected according to the Tunel cell apoptosis detection kit．Ｒesults When BMSCs cells were inoculated，showing round，uniform in size，transparent in body and clear in membrane，and mixed with red blood cells，which were flat and uneven in size．One day after BMSCs cells were inoculated，adherent cells appeared in polygonal，elliptical or spindle shape，while the non－adherent cells were gradually removed by regu-lar fluid exchange．BMSCs cells grew rapidly after1week of inoculation，and more than80%adherent cells fused after2weeks，showing a whirl-pool shape．The number of layers of the outer retinal nucleus in group D was significantly less than that in group A，but significantly more than that in group B and C（P＜0．01）．The apoptotic rate in group D was significantly higher than that in group A，but significantly lower than that in group B and C（P＜0．01）．DAPI－positive BMSCs did not express CNIF and BDNF in the subretinal space，but expressed bFGF．Conclusion Subretinal transplantation of BMSCs can inhibit the apoptosis of photoreceptor cells，and the mechanism may be related to the secretion of bFGF in the subretinal space．
【Key words】Ｒats；Bone marrow mesenchymal stem cells；Subretinal transplantation；Ｒetina；Photoreceptor；Cell damage；Apoptosis
在眼科中，光感受器细胞损伤并不少见，其在眼外伤、视网膜色素变性、视网膜光损伤、视网膜脱离等多种疾病中均有可能发生，特别是在视网膜脱离中有可能导致视功能损伤，严重时可导致眼盲［1］，因此临床中应引起高度重视。

已有研究表明［2］，骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）不仅具有促进视网膜色素上皮细胞、光感受器细胞和神经样细胞分化的潜在功能，而且可发挥减轻局部炎症反应的作用，可通过改善视网膜结构而阻滞视网膜细胞凋亡。

本研究通过构建视网膜脱落大鼠的动物模型，于大鼠视网膜下移植已分离且经培养的BMSCs，旨在探究BMSCs 视网膜下移植对视网膜光感受器细胞凋亡的影响及其可能作用机制。

1材料与方法
1．1实验动物取32只SPF级SD雄性大鼠，6周龄，体重150 175g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。

1．2方法
1．2．1动物模型的构建及分组32只大鼠随机分为A 组（未进行任何处理）、B组（于视网膜下注入无菌生理盐水5μl）、C组（以BMSCs为溶质，于视网膜下注入磷酸盐溶液5μl）、D组（于视网膜下移植BMSCs2ˑ105/g 个），每组各8只。

除A组外，B、C、D组均经1d暗适应，在光损伤仪下经光照1d，波长480 500mm，强度900 960Ix；接着，置于黑暗中，持续72h；之后恢复正常环境。

动物模型制作成功的指征为：神经上皮层与视网膜色素上皮层分离，外核层变薄，神经上皮层向晶状体隆起，光感受器外节段排列规则不一且减少。

C、D组采用光照射1d，于7d后进行手术，术后2周摘除眼球。

1．2．2BMSCs培养在无菌条件下，将大鼠双侧股骨与胫骨取出，通过注射器吸取DMEN/F12培养基（不含血清），并加入磷酸盐缓冲液对骨髓腔进行冲洗。

收集细胞悬液，置于培养瓶中，于培养箱中进行培养，培养条件为37ħ、5%CO2。

原代细胞接种1d后换液，并用磷酸盐缓冲液冲洗3次，之后定期换液（每3天换液1次）。

于显微镜下观察细胞形态、生长状况等，在细胞贴壁融合时，加入预热的0．25%胰蛋白酶溶液1ml （含0．02%乙二胺四乙酸），消化处理3min，根据1︰3的比例进行细胞传代培养。

1．2．3BMSCs细胞的鉴定根据免疫荧光法，对大鼠BMSCs细胞表面标记物表达情况进行检测。

取P2细胞爬片，于小玻片上进行接种；在3h后将其放置在培养
基中，用4%多聚甲醛进行常规固定30min；随后用磷酸盐缓冲液冲洗3次，并将封闭液对小玻片进行完全覆盖，于37ħ环境下封闭60min；将小玻片取出后，将其水分吸除，滴加山羊多克CD166、CD44抗体和小鼠单克隆CD90、CD34抗体，于37ħ环境下孵育2h；加入山羊抗小鼠抗体（经TＲITC标记），于常温下处理15min，随后进行封片观察。

1．2．4于视网膜下移植BMSCs于大鼠腹腔注射浓度为2%的戊巴比妥（剂量60mg/kg）进行麻醉，用复方托比酰进行散瞳；于显微镜下，自右眼上方巩膜，于视网膜下注射BMSCs悬液5μl，于前房穿刺放液，使眼压下降。

1．2．5苏木精－伊红染色大鼠在麻醉处理后，用多聚甲醛与磷酸盐缓冲液各50ml进行灌注固定，将大鼠眼球摘除。

于4ħ下，用多聚甲醛固定3h，去除部分眼前段，用30%蔗糖进行脱水，聚乙烯醇与聚乙二醇的水溶性混合物进行包埋处理，之后行苏木精－伊红染色。

1．2．6眼内BMSCs分化和细胞因子表达的检测根据免疫荧光法，于常温下将制成的封闭液进行封闭60 min，取兔多克隆碱性成纤维细胞生长因子（basic fibro-blast growth factor，bFGF）抗体、脑源性神经营养因子（brain－derived neurotrophic factor，BDNF）抗体和微管相关蛋白2（microtubule－associated protein，MAP2）抗体及小鼠单克隆睫状神经营养因子（ciliary neurotrophic factor，CNIF）抗体、CDllb抗体、Calretintin抗体和Nestin 抗体，于4ħ下过夜；用山羊抗小鼠抗体（经TＲITC标记），于常温下进行孵育60min。

通过荧光分析仪（江苏天瑞仪器股份有限公司）并于显微镜绿光和紫外光下进行观察。

1．2．7细胞凋亡的检测根据Tunel细胞凋亡检测试剂盒（Sigma－Aldrich公司），用磷酸盐缓冲液冲洗3次，置于－20ħ下经甲醇进行浸泡15min；用磷酸盐缓冲液冲洗3次，用平衡盐缓冲液100l覆盖组织30min；随后用反应复合物覆盖组织，于常温下孵育60min，用磷酸盐缓冲液冲洗3次后封片处理。

通过荧光分析仪并于显微镜绿光和紫外光下观察。

1．3统计学方法将数据录入SPSS23．0版统计学软件，计量资料用均数ʃ标准差（珋xʃs）表示，多组比较采用方差分析法，两两比较采用SNK－q检验，以P＜0．05表明差异具有统计学意义。

2结果
2．1大鼠BMSCs形态学观察结果BMSCs细胞刚接种时呈圆形，大小均匀，胞体透亮，胞膜清晰；混有红细胞且呈扁平状、大小不均。

BMSCs细胞接种1d后，贴壁细胞出现，且呈多角形、椭圆形或梭形，而在定期换液中未贴壁的细胞逐渐被清除。

BMSCs细胞接种1周后迅速增长，2周后80%以上的贴壁细胞融合，并呈现漩涡状。

见图1。

图1大鼠BMSCs形态（ˑ200）
注：A：第一代BMSCs达80%以上融合呈现漩涡状；B：第三代BMSCs 呈现纤维状
2．2大鼠BMSCs鉴定结果BMSCs细胞爬片CD90、CD44及CD166均为阳性，CD34为阴性；于显微镜紫光下观察，可见DAPI标记细胞核为蓝色。

见图2。

图2BMSCs爬片（ˑ200）
注：CD44、CD166及CD90免疫荧光出现阳性
2．3视网膜形态观察结果光感受器细胞在光损伤后，其内外节缩短，逐渐消失，且视网膜外核层细胞减少。

结果显示，D组视网膜外核层的层数明显少于A组，而明显多于B、C组，差异具有统计学意义（P＜0．01）。

见表1。

表1各组大鼠视网膜外核层数比较（层，珋xʃs）
组别只数外核层数
A组812．02ʃ2．04*
B组81．02ʃ0．19*
C组84．17ʃ0．63*
D组87．96ʃ0．83
F值20．02
P值＜0．01
注：与D组比较，*P＜0．01。

2．4细胞凋亡检测结果在光损伤后，光感受器细胞凋亡主要见于视网膜外核层，其中D组细胞凋亡率明显高于A组，而明显低于B、C组，差异具有统计学意义（P＜0．01）。

见表2。

表2各组大鼠视网膜外核层细胞凋亡率比较（%，珋xʃs）
组别只数细胞凋亡率
A组80．09ʃ0．01*
B组88．96ʃ2．16*
C组82．20ʃ0．22*
D组80．22ʃ0．02
F值27．86
P值＜0．01
注：与D组比较，*P＜0．01。

2．5大鼠BMSCs细胞分化情况于视网膜移植BM-
SCs 后2周，BMSCs 细胞并未明确整合至视网膜中，主要聚集于视网膜下，部分BMSCs 细胞表达Nestin 阳性，而Calretintin 、
CDllb 及MAP2均为阴性表达。

2．6大鼠BMSCs 中各细胞因子表达情况DAPI 阳性的BMSCs 于视网膜下腔并不表达CNIF 与BDNF ，但其表达bFGF （箭头所示）。

见图3。

图3视网膜下腔DAPI 阳性的BMSCs 与bFGF 均为阳性（ˑ400）3讨论因各种信号途径在视网膜脱离过程中可相互作用，容易造成光感受器细胞死亡，且其为不可逆损伤，因此较难完全恢复视功能［3］。

视网膜移植是近年来临床研究的热点之一，国内外均有多年研究历史。

神经干细胞、胚胎干细胞及视网膜干细胞等均是目前临床用于视网膜移植治疗的主要干细胞，但因排斥反应等问题的存在，使之临床应用效果较差［4］。

所以，探索一种更为有效、安全、确切的干细胞以解决上述问题显得尤为重要。

作为来源于中胚层的成体干细胞，
BMSCs 可起到营养支持的作用，且具有多向分化的潜在功能。

近年来，有关BMSCs 在多种眼科疾病如青光眼、视神经损伤、角膜缘干细胞缺乏、视网膜色素变性等作用机制的相关研究报道［5，6］
逐渐增多。

机体损伤后，BMSCs 移植可通过增强相关细胞因子表达，诱导神经细胞再生，刺激神经细胞修复，因此具有保护机体损伤的作用［7］
；此外，BM-SCs 移植可诱导少突胶质细胞增殖，并且可促进JAK2/STAT3信号通路和MAPK 信号通道激活，因此具有神经
保护的功能［8］。

而目前有关BMSCs 向视网膜细胞分化
仍处在初步探究阶段，有关其体外诱导分化的具体条件目前尚未完全清楚
［9，10］。

研究报道［11］
，BMSCs 细胞在原代细胞接种24h 后开始贴壁，且细胞形态不一，但细
胞数较少；接种48 72h 后，
BMSCs 贴壁细胞数开始增加，周围细胞开始呈梭形；接种1周左右时，细胞快速、
大量生长，且开始融合。

本研究通过直接贴壁法对BM-SCs 进行细胞原代和传代培养，结果发现BMSCs 刚接种时呈圆形，大小均匀，胞体透亮，胞膜清晰；混有红细胞
且呈扁平状、大小不均；BMSCs 接种1d 后，贴壁细胞出
现，且呈多角形、椭圆形或梭形，而在定期换液中未贴壁的细胞逐渐被清除；BMSCs 接种1周后迅速增长，
2周后80%以上的贴壁细胞融合，并呈现漩涡状，与既往研
究报道［12］
基本相符。

本研究发现，光感受器细胞在光损伤后，其内外节缩短，
逐渐消失，且视网膜外核层细胞减少。

结果显示，D 组视网膜外核层的层数明显少于A 组，
而明显多于B 、C 组。

此外，本研究结果显示，在光损伤后，光感受器细胞凋亡主要见于视网膜外核层，
其中D 组细胞凋亡率明显高于A 组，
而明显低于B 、C 组。

上述研究结果表明，于大鼠视网膜下移植BMSCs 具有阻滞视网膜光感受器细胞凋亡的作用，可通过改善视网膜微环境而起到保护光感受器细胞损伤的一定作用，这结论与既往研究报道相符［13］。

DAPI 作为蓝色荧光染料之一，其可通过细胞摄取而结合DNA ，于荧光显微镜下可清晰观察标记
细胞。

据报道［14］
，
通过内源性或外源性提高眼内bFGF 可促使视网膜外核层细胞数量增多，
具有阻滞视网膜光感受器细胞凋亡的作用。

本实验结果发现，
DAPI 阳性的BMSCs 于视网膜下腔并不表达CNIF 与BDNF ，但其
表达bFGF 。

究其原因，可能与于视网膜下移植BMSCs 可有效阻滞视网膜光感受器细胞凋亡密切相关。

4结论综上所述，于视网膜下移植BMSCs 具有阻滞视网
膜光感受器细胞凋亡的功能，且作用机制可能与其于视网膜下腔分泌细胞因子bFGF 而起到营养支持和多向分化潜在功能有关，因此具有保护光感受器细胞损伤的一定作用。

但本实验尚存在一定不足，如观察时间较
短，有关BMSCs 在视网膜光感受器细胞凋亡中的具体
作用机制目前仍未完全明确，因此今后仍需延长时间并
通过改进实验设计以进一步深入研究。

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（收稿日期：2018－12－05）
DOI ：10．3969/j．issn．1671－4695．2019．05．005文章编号：1671－4695（2019）05－0464－04
miＲ－21对晶状体上皮细胞增殖、迁移的影响
王堃
胡玥赵梅生
*
（吉林大学第二医院眼科中心白内障科吉林长春130041）
【摘要】目的探讨miＲ－21对晶状体上皮细胞增殖、迁移的影响。

方法人晶状体上皮细胞（HLE －B3）随机分为三组，实验组转染miＲ－21模拟剂（mimic ），对照组转染miＲ－21阴性对照（NC ），空白组加入等剂量的磷酸盐缓冲液（PBS ）。

噻唑蓝（MTT ）法检测细胞增殖，双染法检测细胞凋亡，Transwell 实验检测细胞迁移，Western －blot 检测细胞Bcl －2、Akt 蛋白表达。

对三组上述各指标进行比较。

结果转染48h 后，实验组中miＲ－21相对表达水平显著上升，与空
白组、对照组比较差异均有统计学意义（P ＜0．05）。

转染24h 、48h 后，实验组的细胞增殖活性显著低于空白组与对照
组（P ＜0．05）；转染48h 后，
实验组的细胞凋亡率显著高于空白组与对照组（P ＜0．05），迁移距离与过膜细胞数都显著少于空白组与对照组（P ＜0．05）。

转染48h 后，实验组的Bcl －2、
Akt 蛋白表达水平显著低于空白组与对照组（P ＜0．05），空白组与对照组对比差异无统计学意义（P ＞0．05）。

结论miＲ－21能通过调节晶状体上皮细胞中Bcl －2、Akt 蛋白的表达，从而抑制细胞增殖与迁移，促进细胞凋亡。

【关键词】晶状体上皮细胞miＲ－21细胞增殖细胞迁移
Effects of miＲ－21on proliferation and migration of lens epithelial cells．WANG Kun ，HU Yue ，ZHAO Mei －sheng．Department of Cataract ，Ophthalmology Center of The Second Hospital of Jilin University ，Changchun Jilin 130041，China．
【Abstract 】Objective
To investigate the effects of miＲ－21on the proliferation and migration of lens epithelial cells．Methods
Human
lens epithelial cells （HLE －B3）were randomly divided into three groups and were transfected with miＲ－21mimic （experimental group ）and miＲ－21NC （control group ）．The blank group were added with equal dose of PBS．MTT assay was used to detect cells proliferation ，double staining was used to detect apoptosis ，Transwell assay was used to detect cell migration ，and Western －blot was used to detect cellular protein expression．Com-pare the three groups of the above indicators．Ｒesults
After 48hours of transfection ，the relative expression level of miＲ－21in the experimental
group increased significantly ，and the difference was statistically significant （P ＜0．05）．After 24h and 48h transfection ，the cell proliferation ac-tivity of the experimental group were significantly lower than that of the blank group and the control group （P ＜0．05）．After 48h transfection ，the apoptosis rates of the experimental group were significantly higher than that of the blank group and the control group （P ＜0．05），the migration dis-tance and the number of transmembrane cells were significantly less than the blank group and the control group （P ＜0．05）．After 48h of transfec-tion ，the expression levels of Bcl －2and Akt in the experimental group were significantly lower than those in the blank group and the control group （P ＜0．05），and there was no significant difference between the blank group and the control group （P ＞0．05）．Conclusion
miＲ－21can inhib-it cell proliferation and migration and promote cell apoptosis by regulating the expression of Bcl －2and Akt in lens epithelial cells．
【Key words 】Lens epithelial cells ；MiＲ－21；Cell proliferation ；Cell migration
基金项目：吉林省科技厅科技发展计划项目资助课题（编号：3D515P623429）
*
通讯作者：赵梅生，
E －mail ：wangkun_229@163．com 白内障是世界范围内主要的致盲性眼病，具有发病年龄早、容易成熟、晶状体混浊进展快的特点。

该病的具体发病因素还不明确，包括年龄增长、晶体蛋白氧化、脂质过氧化反应、晶状体细胞中的DNA 损伤、钙稳态失
衡等［1］。

研究显示正常人的晶状体上皮细胞凋亡率极低，而白内障患者晶状体上皮细胞凋亡率在25%左右［2］。

晶状体上皮细胞是晶状体中唯一有分裂活性的细胞，能分裂分化出晶状体纤维细胞、产生晶状体蛋白，对保持晶状体的渗透压、抵抗外来有害因子、维持晶状
体内环境的稳定方面具有重要作用［3］。

miＲNAs 是一类非编码小ＲNAs ，广泛参与细胞增殖、分化、凋亡的调控
过程，在上皮细胞分化、晶状体发育过程中发挥重要的
作用
［4，5］。

已有研究显示多种miＲNAs 在眼部疾病中发挥了重要作用，可能参与了糖尿病性白内障、后发性白
内障、老年性白内障、先天性白内障发病过程［6］。

高表达的miＲ－21可以增加紫外线诱导的细胞凋亡，进而引起白内障；同时miＲ－21可通过Bcl －2调节高糖环境下晶状体上皮细胞的凋亡［7］
，
但是对细胞增殖、迁移的影响还无相关报道。

本研究具体探讨miＲ－21对晶状体上皮细胞增殖、迁移的影响，以明确miＲ－21的作用机制。

现总结报道如下。