组织研磨与细胞破碎专题(三)
细胞的破碎
该区域通透性增加
表面活性剂
❖ 天然的表面活性剂有胆酸盐和磷脂等 ❖ 合成的表面活性剂 离子型如十二烷基硫酸钠（SDS，阴离子型）；十六烷基三甲基溴
化铵（阳离子型） 非离子型如Triton X-100和吐温（Tween）等
表面活性剂Triton X-100－非离子型清洁剂 ❖ 其作用部位主要是内膜的双磷脂层。 ❖ 对疏水性物质有很强的亲和力，能结合并溶解磷脂， ❖ Triton X-100常与其它试剂混合使用。
目前实验室应用较多的是变性剂盐酸胍和脲处理E. coli 基因工程菌，渗透出重组蛋白质。
复合试剂
❖ 根据不同试剂的作用机理，将介质试剂合理搭配使用，能有 效的提高胞内物质的释放率。
如：单独用0.1M的胍处理E. coli，可释放1％的胞内蛋白，用
0.5% Triton X-100可释放4％胞内蛋白，二者结合使用，在 同样时间内可使53％的胞内蛋白释放。
蜗牛酶适于酵母细胞的处理
自溶作用
❖ 通过调节温度、pH或添加有机溶剂，诱使细胞产生溶解自 身的酶的方法也是一种酶溶法，称为自溶。
❖ 自溶作用是酶解的另一种方法 ❖ 微生物代谢过程中，大多数都能产生一种能水解细胞壁上聚
合结构的酶，以便使生长过程进行下去。 ❖ 改变微生物的环境，可以诱发产生过剩的这种酶或激发产生
物理法和化学法的比较
物理破碎法缺点：
A、高能、高温、高噪音、高剪切力(四高)，易使产品变性 失活；
B、非专一性，胞内产物均释放，分离纯化困难； C、细胞碎片大小不一，难分离。
化学破碎法缺点：
A、费用高； B、引起新的污染，尤其是其他化学方法； C、一般只有有限的破碎，常需与其他物理法连用。
3.2 细胞破碎方法
2.2 细胞破碎
渗透压法（ pressure） 2. 渗透压法（Osmotic pressure） 将细胞放在高渗透压的介质中（ 将细胞放在高渗透压的介质中（如一定浓度的甘 油或蔗糖溶液），达平衡后， ），达平衡后 油或蔗糖溶液），达平衡后，转入到渗透压低的缓 冲液或纯水中，由于渗透压的突然变化， 冲液或纯水中，由于渗透压的突然变化，水迅速进 入细胞内，引起细胞溶胀，甚至破裂。 入细胞内，引起细胞溶胀，甚至破裂。 仅适用于细胞壁较脆弱的细胞或细胞壁预先用酶 处理或在培养过程中加入某些抑制剂（ 处理或在培养过程中加入某些抑制剂（如抗生素 ），使细胞壁有缺陷 强度减弱。 使细胞壁有缺陷， 等），使细胞壁有缺陷，强度减弱。
生物类型 G+细菌 主要组成 肽聚糖 （40-90%） 多糖 胞壁酸 蛋白质 脂多糖 （1-4%） G-细菌 肽聚糖 （5-10%） 脂蛋白 脂多糖 （11-22%） 磷脂 蛋白质 酵母菌 葡聚糖 （30-40%） 甘露聚糖 （30%） 蛋白质 （6-8%） 脂类 （8.513.5%） 霉菌 植物细胞
多聚糖（几 初生壁 丁质） 次生壁 （80-90%） 脂类 蛋白质
细菌
的网状结构， 破碎的主要阻力来自于肽聚糖的网状结构，网状结
构越致密，破碎的难度越大， 构越致密，破碎的难度越大，革兰氏阴性细菌网状结构不 及革兰氏阳性细菌的坚固； 及革兰氏阳性细菌的坚固； 的细纤维构成了细胞壁的刚性骨架， 酵母 葡聚糖的细纤维构成了细胞壁的刚性骨架，甘露聚 糖形成网状结构，细胞壁破碎的阻力也主要决定于壁结构 糖形成网状结构， 交联的紧密程度和它的厚度； 交联的紧密程度和它的厚度； 霉菌 的纤维状结构， 细胞壁中含有几丁质或纤维素的纤维状结构，其强
3.超声破碎法（Ultrasonication） 3.超声破碎法（Ultrasonication） 超声破碎法
第三章 细胞破碎
3.5.2 与上游相结合
（3）克隆噬菌体溶解基因 ：在细胞内引进噬菌体基 因，培养结束后，控制一定条件（如温度等）， 激活噬菌体基因，使细胞自内向外溶解，释放出 内含物。 （4）耐高温产品的基因表达 ：如果产品能表达成 耐高温型，杂蛋白仍然保持原特性，那么就可在 较高温度下将产品与杂质分开，这样既节省了冷 却费用，又简化了分离步骤。
酶溶法的特点（外加酶）：
（1）酶溶法需要特定的反应条件。 （2）酶具有高度专一性，必须根据细胞壁的结构和 化学组成选择适当的酶或溶酶系统，并确定相应 的次序。 （3）酶溶法的优点是：具有选择性释放产物，条件 温和，核酸泄出量少，细胞外形完整。 （4）酶溶法的不足：一是溶酶价格高；二是酶溶法 通用性差，且不易确定最佳的溶解条件；三是存 在产物抑制，在溶酶系统中，甘露糖对蛋白酶有 抑制作用。
3.3.1 珠磨法
细胞破碎率可用一级反应动力学表示 ： 间歇操作： ln[1/(1-R)]=Kt 连续操作： ln[1/(1-R)]=Kτ 其中 τ =V/F
式中： R—破碎率（g/g） K—反应速率常数(1/s) t—破碎时间(s) τ —平均停留时间(s) V—破碎室悬浮液体积（L） F—进料速率(L/s)
《生物分离工程》 Bioseparation Engineering 第三章 细胞破碎
生物分离过程的一般流程
原料液 原料液 细胞分离 ( 细胞分离 ( 离心，过滤 离心，过滤 )) 细胞－胞内产物 细胞－胞内产物 路线一B 包含体 溶解(加盐酸胍、脲 加盐酸胍、脲 ) 复性 细胞破碎 碎片分离 碎片分离 粗分离( 盐析、萃取、超过滤等 盐析、萃取、超过滤等 ) 纯化( 层析、电泳 层析、电泳 ) 脱盐( 凝胶过滤、超过滤 凝胶过滤、超过滤 ) 浓缩( 超过滤 超过滤) 精制( 结晶、干燥 结晶、干燥 ) 路线一 路线二 清液－胞外产物
组织捣碎及细胞破碎
组织捣碎及细胞破碎
高速珠磨机
组织捣碎及细胞破碎
工作原理：剪切，碰撞
组织捣碎及细胞破碎
•（2）珠磨法
➢ 影响因素珠磨效率的因素 ✓ 珠体的大小：实验室规模，珠径为0.2mm较好， 工业规模，不得＜0.4mm ✓ 珠体在磨室中的装量：控制在80%～90%； ✓ 搅拌速度： ✓ 操作温度：操作温度在5～40℃范围内 ✓ 被处理细胞的特性：
•外加酶法
✓ 酵母和真菌：蜗牛酶、纤维素酶、多糖酶等 ✓ 植物细胞壁：纤维素酶，果胶酶；
组织捣碎及细胞破碎
•外加酶法
注意事项 需要选择适宜的酶、酶系统和特定的反应条件；
在选择酶系统时，须根据细胞的结构和化学组成来选 择； 常结合其他方法预先处理；
组织捣碎及细胞破碎
•外加酶法
外加酶法的特点
优点：选择性释放产物；条件温和；核酸泄出量 少；细胞外形完整。
不足 溶酶价格高 通用性差 产物抑制的存在；如甘露糖对蛋白酶有抑制作用， 葡聚糖抑制葡聚糖酶。
组织捣碎及细胞破碎
•酶自溶法
（2）酶自溶法
常采用加热法或干燥法 比如谷氨酸产生菌，加入0.028mol/L Na2CO3和 0.018mol/L NaHCO3配成pH10.0的缓冲液，使成3%的悬浮 液加热至70℃，保温搅拌20min，菌体即自溶。又如： 酵母自溶需在45～50℃下保温12～24h。
组织捣碎及细胞破碎
3rew
演讲完毕，谢谢听讲!
再见，see you again
2020/11/30
组织捣碎及细胞破碎
组织捣碎及细胞破碎
•选择性地释放目标产物
➢ 仅破坏或破碎存在目标产物的位置周围 ✓ 细胞膜附近，采用温和的破碎方法如酶溶法、渗透压冲击法、 冻融法； ✓ 细胞质内，机械破碎 ➢ 选择性溶解目标产物
第三章 细胞破碎
① 酵母的细胞壁
图3.6 酵母细胞壁的结构示意图
M—甘露聚糖；P—磷酸二酯键；G—葡聚糖
◈ 最里层是由葡聚糖的细纤维组成，它构 成了细胞壁的刚性骨架，使细胞具有一定 的形状 ◈ 覆盖在细纤维上面的是一层糖蛋白 ◈ 最外层是甘露聚糖，由 1,6 一磷酸二酯 键共价连接，形成网状结构。在该层的内 部，有甘露聚糖-酶的复合物 ◈ 破碎酵母细胞壁的阻力主要决定于壁结 构交联的紧密程度和它的厚度。
表3.7 细胞破碎方法按作用力分类
分 类
珠磨法 机 高压匀浆法 械 法 超声破碎法 X-press法 酶溶法 非 化学渗透法 机 械 渗透压法 法 冻结融化法 干燥法
作 用 机 理
固体剪切作用 液体剪切作用 液体剪切作用 固体剪切作用 酶分解作用
改变细胞膜 的渗透性 渗透压剧烈改变
反复冻结-融化 改变细胞膜 渗透性
图3.10 高压均质机工作原理示意图
细胞悬浮液在高压作用下从阀座与阀之间的环隙以 450m/s高速喷出后撞击到碰撞环上，细胞在受到高速撞击作 用后，急剧释放到低压环境，在撞击力和剪切力的综合作用 下被破碎。其操作压力通常为50～70MPa。
阀座
阀杆 撞击环 阀杆 压力控制手轮
图3.11 高压匀浆器针型阀结构简图 APV Manton Gaulin 高压匀浆器针型阀结构简图
◈细胞破碎与上游和下游工艺设计的关系
上游工艺通过细胞的生理状态对细胞破 碎效果产生影响；而下游则要考虑去除细胞 碎片和细胞蛋白质的污染等对产品活性的影 响。
◈ 细胞破碎过程中必须考虑的因素
细胞壁的结构、坚韧程度 、目标产品的 性质 、破碎的规模、方法 、费用等。
◈ 细胞破碎阻力与细胞结构的关系
☆ 细胞外层为细胞壁，细胞壁里面是细胞膜， 细胞膜和它所包围的细胞浆合称原生质体。 通常细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透 压冲击而破碎，因此细胞破碎的阻力主要来 自于细胞壁。 ☆ 不同细胞壁的结构和组成不完全相同，故 细胞壁的机械强度不同，细胞破碎的难易程 度也就不同。
经典：第三章-微生物细胞破碎
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一、细菌细胞壁 肽聚糖是细菌细胞壁的主要化学成份，
它是一个大分子复合体，由多糖链借短肽 交链而成。
细菌破碎的主要阻力来自肽聚糖的网 状结构，其网状结构的致密程度和强度取 决于多糖链上存在的肽键数量和其交链程 度，交链程度越大，网状结构越致密，破 碎难度越大。
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革兰氏阴性菌细胞壁结构模式图
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微生物细胞的自溶法常采用加热法或 干燥法。
工业生产的典型例子是酵母自溶物制 备。
自溶法的缺点：对不稳定的微生物， 易引起目的蛋白质的变性，此外，自溶后 细胞悬浮液粘度增大，过滤速率下降。
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五、化学渗透法(Chemical permeation)： 利用一些化学试剂，如有机溶剂、变性
剂、表面活性剂、抗生素、金属螯合剂等， 以改变细胞壁或膜的通透性（渗透性），从 而使胞内物质有选择地渗透出来，这种处理 方式称为化学渗透法。
中试规模：胶质磨 工业规模：高速珠磨机
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破碎作用符合一级动力学； 破碎程度用细胞破碎率（%）或单位细 胞释放的内含物（mg/g）表示。
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细胞破碎动力学方程：
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延长研磨时间、增加珠体量、提高搅拌 转速和操作温度等都可有效地提高细胞破 碎率。
高破碎率将大大增加能耗；温度升高； 大分子物质损失增加；细胞碎片较小，不 易分离。
图革 兰 氏 阳 性 菌 细 胞 壁 结 构 模 式
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二、酵母菌细胞壁： 酵母菌细胞壁由特殊的酵母纤维素构成，其主
要成分是葡聚糖（30-34%）、甘露聚糖（30%）、 蛋白质（6-8%）和脂类。
酵母细胞壁结构可分成三层：最里层葡聚糖层， 构成细胞壁的刚性结构，使细胞具有一定的形状； 最外层是甘露聚糖层；葡聚糖层和甘露聚糖层依 靠处于中间层的蛋白质交链在一起，形成网状结 构。
第三章 细胞的分离与破碎
细胞破碎动力学方程：
影响反应速率常数K的因素： 珠体直径：以细胞大小、浓度为选择依据； 珠体的装量要适中； 搅拌速度应适当：速度高，破碎率提高，能耗大； 操作温度：温度高，易破碎，控制在5~40℃，使 目的产物不受破坏； 细胞浓度； 料液性质
延长研磨时间、增加珠体量、提高搅拌 转速和操作温度等都可有效地提高细胞破 碎率。 高破碎率将大大增加能耗；温度升高； 大分子物质损失增加；细胞碎片较小，不 易分离。 珠磨法的破碎率一般控制在80%以下。
二、细胞破碎的方法
细胞破碎方法按是否使用外力分为机械 法和非机械法。 机械法有：珠磨法、高压匀浆法、超声 破碎法、 X-press法等。 使用机械法时，机械能转为热量，温度 升高，多数情况下采用冷却措施。 非机械法有：酶溶法、化学法、物理法、 干燥法等。
高压匀浆器和 珠磨机在实验室 和工业上得到应 用；超声波法和 非机械法处在实 验室应用阶段。
（一）机械法 1、珠磨法（Bead mill）（固体剪切方法） 工作原理：进入珠磨机的细胞悬浮液与 极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂 一起快速搅拌或研磨，研磨剂、珠子和细胞 之间剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含 物。 珠磨机破碎是最有效的细胞物理破碎法。 细胞的破碎是由剪切力层之间的碰撞和磨料 的滚动而引起。
在工业上利用微生物生产的大多数化学 物质是胞外型的，它们是在微生物细胞内 合成，然后再分泌到周围环境中；此外还 有不少产物是胞内型的；以大肠杆菌为宿 主进行表达的蛋白质产品多为胞内产物。
第一节
细胞的分离
微生物或动植物细胞培养，产物无论 在胞外或胞内，都需进行细胞与培养液的 分离。 常用的细胞分离方法（固液分离方法） 包括过滤与离心沉降。
2、高压匀浆法 (High-pressure homogenization)（液体剪 切方法 ） 高压匀浆法是大规模细胞破碎的常用方 法，所用的设备是高压匀浆器，由高压泵和 匀浆阀组成。 其工作原理：利用高压使细胞悬浮液通 过针形阀，由于突然减压和高速冲击撞击环， 使细胞破裂。
第三章 细胞的破碎与分离
细菌细胞壁结构
几乎所有细菌的细胞壁都是 由肽聚糖组成，它是难溶性 的聚糖链； 相邻聚糖链上的短肽又交叉 相联，构成了细胞壁的三维 网状结构，包围在细胞周围； 使细胞具有一定的形状和强 度。
第三章 细胞的破碎与分离
本章的主要内容
常见的细胞壁结构
细胞破碎技术
包涵体的纯化方法
概述
• 不同类型的细胞分泌目标产物的类型：
• 动物细胞多分泌到细胞外培养液 • 植物细胞多为胞内产物 • 微生物（细菌/酵母/真菌）胞内、胞外， 对于胞内产物需要收集菌体或细胞进行破 碎。
概述 • 大多数情况下，抗生素，胞外酶，一些 多糖，及氨基酸等目标产物存在于发酵 液中。 • 有些目标产物存在于生物体中。
在微生物代谢过程中，大多数都能产生一种能水 解细胞壁上聚合物的酶，以便生长过程继续下去。 自溶作用：改变其生长环境（温度、ｐＨ、缓冲 液），可以诱发产生过剩的这种酶或激发产生其 它的自溶酶，以达到自溶目的。 缺点是：易引起所需蛋白质的变性，自溶后细胞 悬浮液粘度增大，过滤速度下降。
超声波破碎的适用范围
超声波破碎是很强烈的破碎方法，适用于多数微生物 的破碎。 一般杆菌比球菌易破碎，G-细菌比G+细菌易破碎，对 酵母菌的效果较差。 但超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物 质失活。 超声波破碎的有效能量利用率极低 由于对冷却的要求相当苛刻，所以不易放大，但在实 验室小规模细胞破碎中常用。
化学破碎
酶促破碎
一 机械法
机械破碎法又可分为： 高压匀浆破碎法（homogenization） 高速珠研磨破碎法（bead grinding）
细胞破碎的技巧
细胞破碎的技巧细胞破碎（cell lysis）是实验室中常见的操作，目的是将细胞破裂释放细胞内容物，以便进行后续实验，如蛋白质提取、DNA/RNA提取等。
细胞破碎的技巧主要有机械破碎、化学破碎和生物学破碎等多种方法。
一、机械破碎1. 高压均质法：使用高压均质机对细胞进行破碎，将细胞悬浮液通过小孔或喷嘴，使细胞迅速受到高速液流和切割作用，从而实现细胞破碎。
此法适用于较硬的细胞，如细菌等。
2. 超声波破碎法：利用超声波产生的剧烈涡流和液体物理性质变化，使细胞迅速破裂。
应注意控制超声波功率和时间，以避免样品过热和损伤。
3. 球磨破碎法：将含有细胞的样品与玻璃或金属珠放入球磨研钵中，并用球磨研钵进行高速摩擦研磨，利用机械力使细胞破碎。
此法适用于软组织以及大量样品。
二、化学破碎1. 胶酶破碎法：将含有细胞的样品用适量的含有胶原降解酶的缓冲液处理，利用胶原降解酶分解细胞间质蛋白，使细胞破裂。
此法适用于软组织和动物组织。
2. 高温破碎法：将含有细胞的样品置于高温中进行热处理，使细胞质膜破裂。
此法适用于耐高温的菌株和细胞。
3. 低温冻融破碎法：将含有细胞的样品在液氮中预冷，然后迅速置于高温水浴中进行冻融循环，使细胞破裂。
此法适用于一些敏感细胞。
三、生物学破碎1. 厌氧破碎法：由于一些细菌或真菌在缺氧条件下生长，在其细胞膜上富含氧化亚氮酸盐酶，可以将细胞膜破裂。
2. 超声波破碎法：有些细菌的外膜结构相对较弱，在超声波的作用下容易破裂。
3. 冻融破碎法：一些细菌在冻融过程中由于细胞膜的合并作用不够强，容易破裂。
4. 酶处理法：利用胶原酶、丝氨酸酶等刺激性酶类物质，可引起细胞质膜和细胞壁的变性与解聚，从而使细胞破裂。
在实际操作中，需要根据不同实验的要求选择适合的细胞破碎方法，并注意以下几点：1. 样品处理：样品中的细胞应尽可能保持完整，不受损伤或降解，避免过度搅拌或过高的温度处理，以保持样品的完整性。
2. 温度控制：在进行细胞破碎时，对于需要保持活性的细胞内容物，如酶、蛋白质等，应注意控制温度以避免失活。
细胞破碎 实验报告
实验报告：细胞破碎研究背景细胞破碎是生物学实验中常用的一种技术手段，它能够将细胞膜破坏，释放细胞内的各种生物分子，如DNA、蛋白质和细胞器等。
破碎细胞是进行细胞分析、蛋白质提取和基因研究的重要步骤。
本实验旨在探究细胞破碎的原理和方法，并通过一系列实验验证其效果。
实验步骤步骤一：制备细胞悬液1.选择目标细胞，如细菌、酵母或动物细胞等。
2.从培养物中收集细胞，使用无菌工具将其转移到离心管中。
3.使用离心机将细胞以合适的速度离心，去除培养基并获得细胞沉淀。
4.用无菌缓冲液（如PBS）洗涤细胞沉淀，去除残余培养基和细胞代谢产物。
5.经过洗涤后，加入适量的缓冲液，利用悬浮液作为细胞的储存液。
步骤二：选择合适的细胞破碎方法1.根据细胞类型和研究目的，选择合适的细胞破碎方法。
常见的方法有机械破碎、化学破碎和超声破碎等。
2.对于细菌和酵母等单细胞生物，机械破碎是常用的方法。
可以使用超高速离心机、高压均质机或超声波细胞破碎仪等设备进行破碎。
3.对于动物细胞和组织，化学破碎是常用的方法。
可以使用洗涤剂、酶或有机溶剂等进行细胞破碎。
4.在选择破碎方法时，需要考虑细胞的脆弱性、目标生物分子的稳定性以及实验操作的方便性等因素。
步骤三：进行细胞破碎实验1.将制备好的细胞悬液转移至破碎试剂中，按照要求的工作浓度进行操作。
2.根据破碎方法的要求，进行细胞破碎。
如使用机械破碎方法，将细胞悬液置于高速离心机中，设定合适的离心时间和转速。
3.完成破碎后，收集破碎液，并立即进行下一步实验或储存。
步骤四：实验验证和数据分析1.从破碎液中提取目标生物分子，如DNA、蛋白质等。
2.使用适当的分析方法，如凝胶电泳、免疫印迹等，对提取的生物分子进行分析和检测。
3.比较不同破碎方法的效果和提取产量，评估细胞破碎的效果和可行性。
结果和讨论根据不同细胞类型和破碎方法的选择，我们成功地破碎了目标细胞，并获得了目标生物分子。
通过实验验证和数据分析，我们发现不同的破碎方法对于不同的细胞类型和生物分子具有不同的破碎效果和产量。
组织捣碎及细胞破碎
五、选择破碎方法的依据
• 1．处理量的大小； • 2．细胞壁的强度和结构； • 3．目标产物对破碎条件的敏感性； • 4．破碎后固液分离的难易程度； • 5.选择性地释放目标产物。
选择性地释放目标产物
➢ 仅破坏或破碎存在目标产物的位置周围 ✓ 细胞膜附近，采用温和的破碎方法如酶溶法、渗透压冲击法、 冻融法； ✓ 细胞质内，机械破碎 ➢ 选择性溶解目标产物
高压匀浆器原理利用高压迫使细胞悬浮液通过针形阀，由 于突然减压和高速冲击撞击环造成细胞破裂,从低压环境 释放出来。
（1）高压匀浆法
➢ 注意： ✓ 易造成堵塞的团状或丝状真菌； ✓ 较小的革兰氏阳性菌； ✓ 含有包含体的基因工程菌 。
（2）珠磨法 珠磨机
工作筒
搅拌器
• 原理：在膜腔中装入小玻璃球或小钢球，在搅 拌浆的作用下，它将使细胞悬浮液与细胞悬浮 液，细胞悬浮液与玻璃小珠、石英砂或氧化铝 一起发生碰撞、剪切，使细胞在某种程度上破 碎，再由液珠分离器分开、排出。（这些装置 的主要缺点是在破碎期间样品温度迅速升高， 通过用二氧化碳来冷却容器可得到部分解决。）
当目标产物与膜或壁结合时，调整溶液pH值、离子强度、添 加与目标产物具有亲和性的试剂如螯合剂、表面活性剂等，使目 标产物容易释放出来
六、细胞破碎效果的检查
1.直接测定法 检测破碎前后的完整细胞数量 2.目的产物测定法 细胞破碎后，通过测定破碎液中目的产物的 释放量来估算破碎率。 3.测定导电率
（一）细胞壁的结构和特点
1.植物细胞 2.微生物细胞
G+细菌和G－ 酵母细胞 真菌菌丝细胞壁
教育技术中心
革兰氏阳性细菌与阴性细菌的细胞壁成分(占细胞壁干重的%)
成分
G+
细胞破碎的方法(标准版)
细胞破碎的方法一、机械破碎法：是指利用捣碎机、研磨器或匀浆器等将细胞破碎开来。
1. 高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。
此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。
2. 玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研磨杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。
二、物理破碎法：指利用温度差、压力差或超声波等将细胞破碎开来。
1．用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂(借助超声的震动力破碎细胞壁和细胞器）。
机制：可能与强声波作用溶液时，气泡产生、长大和破碎的空化现象有关，空化现象引起的冲击波和剪刀力使细胞裂解。
超声波破碎的效率取决于声频、声能、处理时间、细胞浓度和细胞类型等。
（使用时注意降温，防止过热）。
2. 高压破碎：细胞悬浮液从高压室的环状隙喷射到静止的撞击环上，被迫改变方向经出口管流出。
此过程中细胞经历了高速造成的剪切的碰撞及高压到常压的变化，从而破碎释放内含物。
这是一种温和的、彻底破碎细胞的较理想的方法。
3. 反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。
三、化学破碎法：指利用甲醛、丙酮等有机溶剂或表面活性剂作用于细胞膜，使细胞膜的结构遭到破坏或透性发生改变。
有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏。
四、酶学破碎法：选用合适的酶，使细胞壁遭到破坏，进而在低渗溶液中将原生质体破碎开来。
细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好。
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破碎细胞的方法
破碎细胞是获得细胞各个组分的第一步，也是很关键步骤：破碎不充分，会影响细胞器产量；破碎过度，有时会破坏细胞器。
破碎细胞一般是在低温条件下，将细胞在等渗液中制备成细胞悬液，进行破碎细胞使之成为各种细胞器及其包含物的匀浆。
(一)匀浆法匀浆(homogenization)是最常用的破碎细胞的方法，一般都要在冰上操作。
较为经济的方法是使用玻璃匀浆器。
手动玻璃匀浆器由一根端部表面磨砂的玻璃杆和一个内壁磨砂的玻璃套管组成。
使用时，先用锋利的刀片把组织块切碎，然后把碎块加入套管中，用力移动玻璃杆使组织细胞破碎。
因为在研磨的过程中会摩擦产热，引起蛋白变性，所以一般都在冰上操作，冰上操作还可以抑制细胞酶活性，防止降解。
电动玻璃匀浆器和手动玻璃匀浆器原理和使用方法相似。
(二)高速组织捣碎机法高速组织匀浆机有高速转动的电机，可以带动钢制转头高速旋转，从而剪切样品、达到破碎细胞的目的，可以用于微量样品的制备。
使用时将待处理细胞悬于细胞裂解液中．加入到塑料离心管(因为刀头速度过快，为防止碎裂，尽量避免使用玻璃试管)中，并放置于冰上，将组织匀浆机的探头浸入离心管中，然后打开电源，缓慢调整旋转速度，一般开机数十秒后．组织细胞即可被高速旋转的探头破碎。
但不宜时间过长，以防高速旋转产生热而导致分离物中的活性物降解。
(三)超声波处理法超声波发生器能产生高强度的超声信号，经换能器传送至与之接触的溶液中，由声波形成冲击和振动而产生剪力，致使细胞破碎，一般体外培养的动物细胞均可在短时间内破碎，因超声时可产热，应注意冰浴冷却，生物大分子如核酸和酶对超声敏感，一般不宜采用。
如果提取蛋白、多糖等，可采用超声法降解核酸。
超声法可以和匀浆法相结合，即先通过匀浆的方法破碎细胞，再通过适当的超声进一步裂解。
(四)化学裂解法在细胞悬液中加入Titon X-100、NP-40、SDS、去氧胆酸钠均可使细胞裂解，往往仍需机械法进行辅助，方可在短时间内使细胞完全裂解，裂解后应清除化学裂解剂，以防止干扰分析。
转载组织破碎的方法
转载组织破碎的方法[转载]组织破碎的方法00细胞破碎简介分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。
所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。
不同的生物体或同一生物体的不同部位的组织，其细胞破碎的难易不一，使用的方法也不相同，如动物脏器的细胞膜较脆弱，容易破碎，植物和微生物由于具有较坚固的纤维素、半纤维素组成的细胞壁，要采取专门的细胞破碎方法。
细胞破碎方法机械法主要通过机械切力的作用使组织细胞破碎的方法，常用的器械有组织捣碎机、匀浆器、研钵和研磨、压榨器等。
1. 组织捣碎将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。
一般用于动物组织、植物肉质种子、柔嫩的叶芽等，转速可高达10000rpm/M以上。
由于旋转刀片的机械切力很大,制备一些较大分子如核酸则很少使用。
2. 匀浆器先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎。
匀浆器的研钵磨球和玻璃管内壁之间间隙保持在十分之几毫米距离。
制作匀浆器的材料，除玻璃外，还可以用硬质塑料、不锈钢、人造荧光树脂等。
此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。
存在的问题；较易造成堵塞的团状或丝状真菌，较小的革兰氏阳性首以及有些亚细胞器，质地坚硬，易损伤匀浆阀，也不适合用该法处理。
3. 研钵多用于细菌或其他坚硬植物材料，研磨时常加入少量石英砂，玻璃粉或其他研磨剂，以提高研磨效果。
4. 细菌磨是一种改良了的研磨器，比研钵具有更大的研磨面积，而且低部有出口。
操作时先把细菌和研磨粉调成糊状，每次加入一小勺，研磨20-30秒即可将细菌细胞完全磨碎。
物理法主要通过各种物理因素使组织细胞破碎的方法。
在生化制备中常用的方法有：1. 反复冻溶法原理：因突然冷冻，细胞内冰晶的形成及胞内外溶剂浓度的突然改变而破坏细胞。
方法：将待破碎的细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。
最新1细胞破碎解析课件ppt
【诊断与鉴别诊断】
(一)诊断 1．癫病是以精神抑郁，表情淡漠，沉默痴呆，语无伦次，
静而少动为特征；狂病是以精神亢奋，狂躁刚暴，喧扰不宁 ，毁物打骂，动而多怒为特征。 2．有癫狂的家族史。多发于青壮年女性，平紊陛格内向 ，近期情志不遂，或突遭变故，惊恐而心绪不宁。 3．排除药物、中毒、热病原因所致。 癫狂目前尚无确切的实验室诊断方法。头颅CT、MRl、脑电 图等检查可排除其他相关疾病。
区别言之，癫与狂的病机各有不同。癫为痰气郁结，蒙蔽神机；狂为 痰火上扰，神明失主。但癫病痰气郁而化火，可转化为狂病；狂病日久 ，郁火宣泄而痰气留结，又可转化癫病。癫病日久则心脾耗伤，气血不 足；狂病日久则火盛伤阴，心肾失调。故本病病理性质初起属实，日久 可转为虚证或虚实夹杂。
本病的转归预后关键在于早期诊断，及时治疗，重视精神调护，避免 精神刺激。若失治、误治，或多次复发，则病情往往加重，形神俱坏， 难以逆转。
金元时期对癫狂病因病机的认识有较大发展。《河问六书·狂越》认为：“心火旺 ，肾水衰，乃失志而狂越。”《丹溪心法·癫狂》日：“癫属阴，狂属阳……大率 多因痰结于心胸问。”指出癫狂与“痰”的密切关系，并首先提出“痰迷心窍” 之说，对于指导临床实践有重要意义，也为后世用吐法治疗本病建立了理论基础 。
明代王肯堂在《证治准绳·癫狂痫总论》提出癫与狂之不同：“癫者或狂或愚，或 歌或笑，或悲或泣，如醉如痴，言语有头无尾，秽洁不知，积年累月不愈”，“ 狂者病之发时猖狂刚暴，如伤寒阳明大实发狂，骂詈不避亲疏，甚则登高而歌， 弃衣而走，逾垣上屋，非力所能，或与人语所未尝见之事”。
例如：溶菌酶（lysozyme），它能专一地分解细胞壁上 糖蛋白分子的β－1,4糖苷键。
（2）自溶法：特殊的酶溶方式 ，所需的溶胞酶由生物细胞 自身产生 。 当细胞在一定的 pH 和适宜的温度条件下保温一 段时间后 ， 即可通过细胞自身存在的酶系将细胞破坏 ，使细 胞内物质释出 ，其效果取决于自溶条件 。
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组织研磨与细胞破碎专题（三）——生物样品前
处理发展s史
对于绝大实验猿来说，许多实验材料比如动物身上的肌肉组织、结缔组织、骨组织、毛发组织等,植物的根、茎、叶、种子等均需磨碎，随后才能对其成分、基因与蛋白质及结构和功能进行研究。
从此，实验猿就走上了与生物组织研磨共(yù)同(bà)成(bù)长(néng)的道路。
第一代：液氮研磨——一把辛酸泪
“师兄，我被液氮冻伤了”
“苍天啊，好不容易获得的样品在研磨的时候都
飞溅出去了”此处伤害达100点。
“师兄，我被液氮冻伤了”
“苍天啊，好不容易获得的样品在研磨的时候都
飞溅出去了”此处伤害达100点。
第二代：组织匀浆仪——二度崩溃
“╮(╯▽╰)╭，又没破碎完全”
“神马！刀片又卡住了，电机又不转
了．．．．．．”
“一次一个样，每次都要清洗，这种日子什么时
候才是个头啊 ”
“╮(╯▽╰)╭，又没破碎完全”
“神马！刀片又卡住了，电机又不转了．．．．．．”
“一次一个样，每次都要清洗，这种日子什么时候才是个头啊 ”
第三代：生物样品研磨仪——三重惊喜！
高通量——24个样品前处理一次搞定！
高效率——1-3分钟，你要的，即刻就有！
高安全——自动制冷无需液氮，一台机器，破碎离心
全搞定！
高通量——24个样品前处理一次搞定！
高效率——1-3分钟，你要的，即刻就有！
高安全——自动制冷无需液氮，一台机器，破碎离心
全搞定！。