完整版防腐挑战实验

第一部分防腐挑战实验调研结果1实验样品

样本要求新鲜，没有被微生物污染，一般每个样本为300go

2微生物挑战性实验

2.1实验菌株

不同国家、组织、企业对挑战实验选择的测试菌种有一定差异（如表

国化妆品、香精和洗涤剂协会（CTFA）推荐的菌种（因其较具代表性，如表更为恰当。（注意菌株来源问题：同属一个种的细菌来源不同，菌株不同，表1 某些国家、组织、企业用于化妆品微生物挑战试验的测试菌株

美国美国英国德国菌株

（药典）（ISP公司）（药典）（Henkel公司）白假丝酵母V V V V 黑曲霉V V V V 红色青霉V 绿色木霉V 绳状青霉

大肠埃希氏菌V V V 镉绿假单胞菌V V V

金黄色葡萄球菌V V V V 粪肠球菌V 产气肠杆菌V 表皮葡萄球菌1）,国内参照美2所示），所以MIC值不同）

德国

（S&M公

日勾维肠杆菌洋葱假单胞菌

肺炎克雷伯氏菌

恶臭假单胞菌

荧光假单胞菌

表2 CTFA化妆品微生物挑战试验的菌株选择

种类菌株数量

革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌

至少选一种

发酵革兰氏阴性杆菌表皮葡萄球菌肺炎克雷伯氏菌

阴沟肠杆菌

大肠埃希氏菌

至少选两种

非发酵革兰氏阴性杆菌

变形菌属

日勾维肠杆菌铜绿假单胞菌洋

葱假单胞菌荧光假单胞菌

至少选一种

酵母

恶臭假单胞菌

黄杆菌属不动杆菌属白假丝酵母

至少选一种

霉菌近平滑假丝酵母

黑曲霉

至少选一种

产芽砲菌

黄绿青霉

枯草芽砲杆菌

供选用

生产现场分离菌适当菌株—*种以上2.2培养基

牛肉膏蛋白月东培养基、琼脂培养基

2.3试验用菌液的配置

（1）标准悬液的配制

1%硫酸9.9ml与1%氯化锁0.1ml,混合后配制成的悬液浓度为3X108clu/ml , 此悬液再做3倍稀释。

（2）细菌菌悬液的配制

实验前将菌株接种到各个培养基斜面上，36摄氏度恒温培养48小时。将己培养好的活性菌种，用灭菌生理盐水清洗到灭菌锥形瓶中，充分振荡摇匀。用移液枪从锥形瓶中吸取菌液作稀释，浊度和标准悬液的浊度（ 3X 108cfu/ml）相同为止；

此时的稀释菌液再做3倍稀释，即为所需的1 X108cfu/ml的菌悬液，做细菌总数确定细菌数。

（3）霉菌菌悬液的配制

将已培养好的活性菌种，用灭菌的生理盐水清洗到灭菌锥形瓶中，充分振荡

摇匀；用移液枪从锥形瓶中吸取菌液作依次的10倍稀释，每次的稀释用血球计

数板计数，必须5个中格的霉菌总数在190〜210,落在此范围内的菌悬液为我们所需的1 X 108cfo/ml的霉菌菌悬液，做霉菌总数确定霉菌数。

2.4接种

2.4.1接种方式

（1）单菌接种：每种测试菌株单独做一个挑战试验。这种方法的优点是容易了解每种微生物对防腐体系的敏感性，在筛选产品的防腐体系时有较好的参考价值，但工作量大、费时、费工，和产品的实际污染菌情况也有差距（因来自自然界的微生物常常不是单一的种类）。

（2）混合菌接种：西欧、德国等的许多国家和企业多采用这种方式，除了

因工作量相对较小外，这种接种方法更能代表污染的状况。

2.4.2接种次数和时间

28天。（一次加菌

（1）一次接种：只是在试验开始时接种一次，整个试验周期的28天微

生物挑战实验）

（2）多次接种：在试验开始接种一次后（重复加菌的微生物挑战实验）

a法：第21天再接种一次，试验周期为28天。（有实验表明，第21天接菌

和不接菌时，第28天时的微生物含量并无显著的差别，评定结果也相同）

b法：每隔两周接种一下，连续三次（即第1、3、5周接菌，每两周接菌前分离一次），试验周期为49天；

c法：每周接种一次，连续5次，试验周期为35天。（S&M公司的资料介绍，采用此种方法评价认可的防腐体系，可保证产品30个月内的防腐安全）2.4.3操作方法

称取待测样品30g,对应加入0.3ml浓度为1 X107〜lXlO^cfti/m 1的细菌悬液及霉菌悬液，用干净的无菌勺子搅拌均匀后盖上保鲜膜，细菌在32.5± 2.5°C

的培养箱中培养，霉菌在22.5± 2.5°C的培养箱中培养。

a •水溶性样品

10g加入90ml无菌生理盐水，稀释后取lnil样品液，加入9ml灭菌生理盐水中，做依次稀释，分别为10"、10・2、10与、10-\ 10'\ 10-\ 10・7等稀释度；取三个合适稀释度的样液，分别吸取1ml样液加入已灭菌的平皿中，做菌落计数，并做两个平行。

b.油溶性样品

取10g样品，加入10ml无菌吐温・80和10ml无菌白矿油，再加70ml无菌生理盐水，用无菌玻棒充分混匀；

吸取1ml己稀释的样品液，加入9ml灭菌生理盐水中，做依次稀释，分别为IO" 1、KT?、10』、10山、10_\ 10_6> 10-7等稀释度；取三个合适稀释度的样液，分

别吸取lml加入已灭菌的平皿中，做菌落计数，并做两个平行。

2.5培养

细菌放在32.5±2.5°C的培养箱中培养；

霉菌在22.5± 2.5°C的培养箱中培养；

混合菌在28°C的培养箱中培养。

2.6菌落计数

分别在0、7、14、21、28天分离计算样品中活的细菌、霉菌；每次计算完细菌总数、霉菌总数后将平皿放回培养箱，以待下次观察用，观察中切勿打开平皿，以免燃菌而使下次无法观察。

菌落计数的标准方法：

①先选取平均菌落数在30〜300之间的平皿作为细菌菌落总数测定范围，选

取平均菌落数在5〜50之间的平皿作为霉菌菌落总数测定范围；

②有两个稀释度在30〜300之间，求比值。若比值W 2,报告平均数；若比值＞2,以其中较小的稀释度计算细菌总数；

③所有稀释度都大于300,以稀释度最高的平均菌落数计算；

④所有稀释度都小于30,以稀释度最低的平均菌落数计算；

⑤所有稀释度均在30-300之外，其中一个大于300,而相邻的加一稀释度小于30,则以最接近30或300的平均菌落数计算；

⑥若平皿中有连成片状或花点样菌落蔓延生长时，不宜计算；

⑦若片状菌落不到平皿中的一半，而另一半中菌落均匀，则叮将此平皿菌落计数后X2,以报告全皿菌落数。

2.7评价标准

2.7.1 CTFA推荐的一次加菌防腐挑战性试验及评价标准

CTFA的方法初始的霉菌和细菌的接种量分别为10000cfti/g ( ml )和

1000000cfti/g ( ml) (CFU为菌落单位),要求在第7天时霉菌降低90%,细菌降低99.9%,并且在28天内菌