化妆品微生物挑战试验
(完整word版)微生物挑战性实验方法
微生物挑战性实验方法1.0目的新产品防腐效果的测试2.0 范围公司新产品3.0参考：4 材料与方法4. 1化妆品中常用的防腐体系[ 6]营养琼脂培养基、改良马丁琼脂培养基、营养肉汤培养基、0.9%氯化钠溶液、平皿、接种环、培养箱等4. 2微生物挑战性实验4. 2. 1受试用微生物测试用细菌和霉菌均由浙江省食品和药品检验所提供。
细菌包括: 大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、巨大芽胞杆菌、绿脓杆菌。
霉菌包括: 黑曲霉、黄曲霉、变色曲霉、桔青霉、拟青霉、腊叶芽枝霉、球毛壳霉、绿色木霉。
实验前，将各菌种接种于合适的培养基中, 于37℃( 细菌) 或28℃( 霉菌) 下培养。
细菌培养在2天后, 霉菌培养在3-5 天后，挑选适量菌落于灭菌的生理盐水中，制成一定浓度的混合细菌( 1×108个/ ml) 或混合霉菌悬液( 1×107个/ ml) , 置于4℃贮放备用。
4. 2. 2一次加菌的28 天微生物挑战试验此方法参照美国药典( 第2 1 版) 上微生物挑战性试验检测防腐剂效果的方法。
称取各受试样品30g, 加入混合细菌或混合霉菌悬液, 每克受检膏霜最终含菌量分别为5×106个细菌和3 ×105个霉菌。
然后充分混匀, 置于28℃下。
在接菌的0、7、14、2 1 和28天取样分析: 准确称取3g样品, 加到含有玻璃小珠的灭菌锥形瓶内, 加入27ml灭菌生理盐水, 充分震荡混匀, 此悬液为1∶10稀释液；然后再用灭菌生理盐水按10倍依次稀释。
按平板倾注法计数受试品中含菌量, 细菌培养是37 ℃下24h～48h，霉菌培养为28℃下3～5 天。
此实验用以评判防腐剂的有效与否。
评判标准为: 当每克样品中一次接菌( 1×106细菌和1×105霉菌) 后, 在第14天存活菌量减少至不高于起始浓度的0. 1%, 以后逐渐减少, 在28 天为0 。
符合标准为防腐剂有效( 通过测试) , 不符合为防腐剂无效(不通过测试)。
用微生物挑战性试验考察化妆品防腐剂效果
摘要：为了考察 2010 年化妆品风险监测抽验样品的防腐效果，参考 《中国药典》（2010 年版附录） 对 3 种
化妆品进行菌落计数方法学验证，选取回收率达到 70%以上的 3 种化妆品进行微生物挑战性试验。通过对 3
类化妆品进行挑战性试验研究，结果表明，选择的 3 种化妆品均能通过挑战性试验。通过此次考察，可以
祛斑类 金黄色葡萄球菌 1.5×106
lg6.18 1.4×105 lg5.15
＜10 ＜lg1
＜10 ＜lg1 ＜10 ＜lg1
铜绿假单胞菌 1.6×106
lg6.20 1.4×102 lg2.15
10
lg1
＜10 ＜lg1 ＜10 ＜lg1
大肠埃希菌
2.3×106
lg6.36 1.6×106 lg6.20
2 结果与讨论
2.1 结果 受试的 3 种类型的化妆品在检测时间内细菌和真
菌的防腐能力见表 1。从表 1 结果看，选取的 3 种类 型的化妆品，14 天细菌菌数下降不少于 2.0 lg，14 天～ 28 天细菌菌数未增加；与初始值比，14 天和 28 天真 菌数均未增加，受试的 3 种类型的化妆品均能够通过 挑战性试验。为了考察化妆品的防腐效力，本次试验 所选取的 3 种类型的产品都是经过微生物验证过的， 将 3 种类型的产品按照 《中国药典》 微生物限度检查 方法 （常规法） 进行验证，结果 3 种产品经过验证 后，各验证菌的回收率均能达到 70%，且该 3 种样 品按照化妆品卫生规范 （2007 年版） 方法进行检验 为无菌产品。因此，选择这 3 种样品作为供试品代表 进行研究，通过本次试验初步对 2010 年化妆品风险 监测抽验样品的防腐效果进行了考察，为消费者选择 健康的化妆品提供可靠依据。 2.2 讨论
微生物挑战性实验方法
微生物挑战性实验方法1.0目的新产品防腐效果的测试2.0 范围公司新产品3.0参考：4 材料与方法4. 1化妆品中常用的防腐体系[ 6]营养琼脂培养基、改良马丁琼脂培养基、营养肉汤培养基、0.9%氯化钠溶液、平皿、接种环、培养箱等4. 2微生物挑战性实验4. 2. 1受试用微生物测试用细菌和霉菌均由浙江省食品和药品检验所提供。
细菌包括: 大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、巨大芽胞杆菌、绿脓杆菌。
霉菌包括: 黑曲霉、黄曲霉、变色曲霉、桔青霉、拟青霉、腊叶芽枝霉、球毛壳霉、绿色木霉。
实验前，将各菌种接种于合适的培养基中, 于37℃( 细菌) 或28℃( 霉菌) 下培养。
细菌培养在2天后, 霉菌培养在3-5 天后，挑选适量菌落于灭菌的生理盐水中，制成一定浓度的混合细菌( 1×108个/ ml) 或混合霉菌悬液( 1×107个/ ml) , 置于4℃贮放备用。
4. 2. 2一次加菌的28 天微生物挑战试验此方法参照美国药典( 第2 1 版) 上微生物挑战性试验检测防腐剂效果的方法。
称取各受试样品30g, 加入混合细菌或混合霉菌悬液, 每克受检膏霜最终含菌量分别为5×106个细菌和3 ×105个霉菌。
然后充分混匀, 置于28℃下。
在接菌的0、7、14、2 1 和28天取样分析: 准确称取3g样品, 加到含有玻璃小珠的灭菌锥形瓶内, 加入27ml灭菌生理盐水, 充分震荡混匀, 此悬液为1∶10稀释液；然后再用灭菌生理盐水按10倍依次稀释。
按平板倾注法计数受试品中含菌量, 细菌培养是37 ℃下24h～48h，霉菌培养为28℃下3～5 天。
此实验用以评判防腐剂的有效与否。
评判标准为: 当每克样品中一次接菌( 1×106细菌和1×105霉菌) 后, 在第14天存活菌量减少至不高于起始浓度的0. 1%, 以后逐渐减少, 在28 天为0 。
符合标准为防腐剂有效( 通过测试) , 不符合为防腐剂无效(不通过测试)。
化妆品原料微生物检验标准
化妆品原料微生物检验标准一、细菌总数1.目的：评估化妆品原料的细菌污染程度，反映化妆品生产过程中的卫生状况。
2.采样方法：随机取样，按照标准程序进行细菌总数的测定。
3.判定标准：细菌总数小于或等于1000 CFU/g（CFU/ml）为合格，超过此标准为不合格。
二、霉菌和酵母菌总数1.目的：评估化妆品原料的霉菌和酵母菌污染程度，反映原料的卫生状况。
2.采样方法：随机取样，按照标准程序进行霉菌和酵母菌总数的测定。
3.判定标准：霉菌和酵母菌总数小于或等于100 CFU/g（CFU/ml）为合格，超过此标准为不合格。
三、耐热大肠菌群1.目的：检测化妆品原料中是否存在耐热大肠菌群，反映原料的卫生状况。
2.采样方法：随机取样，按照标准程序进行耐热大肠菌群的测定。
3.判定标准：未检出耐热大肠菌群为合格，检出耐热大肠菌群为不合格。
四、金黄色葡萄球菌1.目的：检测化妆品原料中是否存在金黄色葡萄球菌，预防感染性疾病的发生。
2.采样方法：随机取样，按照标准程序进行金黄色葡萄球菌的测定。
3.判定标准：未检出金黄色葡萄球菌为合格，检出金黄色葡萄球菌为不合格。
五、铜绿假单胞菌1.目的：检测化妆品原料中是否存在铜绿假单胞菌，预防感染性疾病的发生。
2.采样方法：随机取样，按照标准程序进行铜绿假单胞菌的测定。
3.判定标准：未检出铜绿假单胞菌为合格，检出铜绿假单胞菌为不合格。
六、沙门氏菌1.目的：检测化妆品原料中是否存在沙门氏菌，预防感染性疾病的发生。
2.采样方法：随机取样，按照标准程序进行沙门氏菌的测定。
3.判定标准：未检出沙门氏菌为合格，检出沙门氏菌为不合格。
七、志贺氏菌1.目的：检测化妆品原料中是否存在志贺氏菌，预防感染性疾病的发生。
2.采样方法：随机取样，按照标准程序进行志贺氏菌的测定。
3.判定标准：未检出志贺氏菌为合格，检出志贺氏菌为不合格。
八、大肠埃希氏菌O157:H71.目的：检测化妆品原料中是否存在大肠埃希氏菌O157:H7，预防感染性疾病的发生。
防腐挑战性实验方法
防腐挑战性实验规程一、目的本方法及标准摘自欧盟标准BP2002 XVIC EFFICAIY OF ANTIMICROBIAL PRESERVATION,测定化妆品抵抗微生物的能力。
二、材料及工具1.待检样品600g（实际操作中常用300g以节约样品）；2.电子秤1台、不锈钢勺子、200ml烧杯、10ml试管、150ml三角烧瓶、酒精灯1盏、1ml移液枪（100～1000μL）、1ml移液枪枪尖、灭菌培养皿、0.85%灭菌生理盐水；3.适量普通营养琼脂培养基、虎红培养基；4.金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠艾希氏菌、黑曲霉、白色念珠霉菌的菌种各1支，其菌种传代次数<5代。
三、步骤1.标准悬液的配制1%硫酸9.9ml与1%氯化钡0.1ml，混合后配制成的悬液浓度为3×108cfu/ml，此悬液再做3倍稀释。
2.细菌菌悬液的配制将已培养好的活性菌种，用灭菌生理盐水清洗到灭菌锥形瓶中，充分振荡摇匀。
用移液枪从锥形瓶中吸取菌液作稀释，浊度和标准悬液的浊度（3×108cfu/ml）相同为止；此时的稀释菌液再做3倍稀释，即为所需的1×108cfu/ml的菌悬液，做细菌总数确定细菌数。
3.霉菌菌悬液的配制将已培养好的活性菌种，用灭菌的生理盐水清洗到灭菌锥形瓶中，充分振荡摇匀；用移液枪从锥形瓶中吸取菌液作依次的10倍稀释，每次的稀释用血球计数板计数，必须5个中格的霉菌总数在190～210，落在此范围内的菌悬液为我们所需的1×108cfu/ml的霉菌菌悬液，做霉菌总数确定霉菌数。
4.分别称取待测样品100g，倒入5个烧杯中，分别标记大、金、绿、黑、白及日期。
5.分别在5个烧杯中，对应加入1ml浓度为1×107～1×108cfu/ml的细菌菌悬液及霉菌菌悬液，用干净的无菌勺子搅拌均匀后盖上保鲜膜，细菌在32.5±2.5℃的培养箱中培养，霉菌在22.5±2.5℃的培养箱中培养。
一种用于快速评价防腐体系效果的半定量挑战性试验方法及试验结果分析
司提供。甲醇，色谱纯，德国Ｍｅｒｃｋ公司。岛津快
速液相色谱ＵＦＬＣ系统，Ｐｒｏｍｉｎｅｎｅｅｅ ＵＦＬＣ。
１．６．２色谱条件
色谱柱：Ｓｈｉｍ—Ｐａｃｋ ＶＰ一０ＤＳ（２５０×４．６ ｍｍ，
ＷＷＷ．ｆｆｃ—ｊｏｕｒｎａｌ．ｃｏｒｎ
一２５—
５ ｐｍ），柱温：３０℃，流动相：Ｖ（甲醇）：Ｖ（水）＝５５ ＯＤ６。，同菌落数的线性关系，见表３；在挑战性试验
本文介缨一种半定爨檄生物挑战健试验方法 （ｋｏｋｏ ｔｅｓｔ），该方法源予德国舒美公司。该方法在送 行产品防腐体系筛选及评判时具有较高的应用价 值，本文就该方法的实施及合理性进行了阐述。 ｌ材料奄方法 １．１试验莹株
测试用细菌和霉菌均购自广东省微生物菌种
保藏中心。 细菌包括：大肠杆菌、克雷伯氏肺炎杆菌、绿
为：当每克样品一次加菌后，在１４ ｄ存活菌量减少
至不高于起始浓度的０．１％，以后逐步减少，在２８ ｄ
为０。符合此标准为防腐剂有效，不符合为防腐剂 无效。
１．５ 重复加菌的微生物挑战性试验方法（ＣＴＦＡ
方法）［１］
称取受试样品３０ ｇ，每隔７ ｄ加菌一次（即试验
的第０ ｄ、７ ｄ、１４ ｄ、２１ ｄ），细菌加菌量为１０６ ｃｆｕ／ｇ样
联系电话：（０５２１）６７４２６５５９。
《
∞
产一ｍａｉｌ：ｈａ。ｍａ２０９＠１２６瑚ｍ一。。童
介绍了一种半定最微生物挑战性试验９唯（ｋｏｋｏ ｔｅｓｔ），该方法选取了７株细菌，１株酵姆翁，２株霉菌作为试验菌株，对防
腐荆组成为：０．００９５％甲基异噻唑啉酮（ＭＩＴ）、０．２％对羟基苯甲酸甲酯（ＭＰ）、０．１％对羟纂苯甲酸丙酯（ＰＰ）的３款产品进
一２６～
ＷＷＷ．ｆｆｃ．ｊｏｕ ｒｎａｌ．ｃｏｍ
化妆品防腐挑战评价标准
化妆品防腐挑战评价标准
化妆品防腐挑战评价标准主要涉及以下几个方面：
1. 防腐效能试验：这是评价化妆品防腐性能的关键环节。
通过在化妆品样品中加入微生物（如细菌、酵母和霉菌等），观察防腐剂对微生物的生长和繁殖的抑制效果。
常用的方法有一次加菌法和多次加菌法等。
2. 挑战性试验：这是模拟化妆品在生产、储存和使用过程中可能遇到的微生物污染情况。
通过在样品中加入定量已知菌种，定期检测微生物的数量变化，以评估防腐剂的防腐效果。
3. 评价标准：化妆品防腐挑战评价标准通常包括微生物数量、防腐剂浓度、试验周期等指标。
例如，在挑战性试验中，如果样品在特定时间内（如第7天、第14天和第28天）的微生物数量均控制在一定范围内，说明防腐剂的防腐效果较好。
4. 参考国际标准：在评价化妆品防腐挑战时，可以参考国际通用的标准和方法，如欧盟和美国的相关法规和指南。
同时，对于防腐体系相同且配方近似的产品，可以参考已有的实验数据和资料进行评价。
5. 实验周期：化妆品防腐挑战试验的周期通常至少为33天，以确保在试验过程中充分评估防腐剂的性能。
化妆品防腐挑战评价标准主要关注防腐效能试验、挑战性试验、评价指标、国际标准和实验周期等方面，以确保化妆品在生产、储存和使用过程中具备可靠的防腐性能。
化妆品中的微生物检测技术的研究
化妆品中的微生物检测技术的研究现代社会，化妆品成为女性生活中必不可少的一部分。
然而，随着化妆品使用者不断增加，对化妆品质量和安全性的需求也越来越高。
其中，微生物检测技术在化妆品质量控制中起着重要的作用。
本文将探讨化妆品中的微生物检测技术的研究进展，并展望其在未来的应用前景。
一、化妆品中微生物检测技术的重要性化妆品作为直接接触皮肤的产品，其安全性和卫生品质至关重要。
因此，对化妆品中微生物的检测是不可或缺的。
微生物可引起多种问题，如过敏反应、感染和其他皮肤疾病。
通过微生物检测，可以及时发现和消灭潜在的污染源，确保用户安全使用化妆品。
二、化妆品中微生物检测技术的研究现状当前，化妆品中微生物检测技术已有多种方法。
常用的方法包括传统培养方法、分子生物学方法和基于纳米技术的检测方法。
1. 传统培养方法传统培养方法是最早应用于微生物检测的技术之一。
通过将化妆品样品分别接种于不同培养基上，培养一段时间后观察菌落的形成情况，并进一步鉴定细菌和真菌的种类。
该方法简单易行，但需要较长时间，且无法检测不易培养的微生物。
2. 分子生物学方法分子生物学方法通过检测微生物的DNA或RNA，能够快速准确地进行微生物鉴定。
其中，聚合酶链反应（PCR）和荧光原位杂交（FISH）是常见的分子生物学方法。
这些方法操作简便，灵敏度和特异性高，但需要一定的实验设备和技术。
3. 基于纳米技术的检测方法基于纳米技术的检测方法可以实现对微生物的实时检测。
纳米传感器可以通过检测微生物释放的挥发性有机物或特定分子来识别微生物的存在。
这种方法具有高效、高灵敏度的优势，但目前仍处于研究阶段。
三、化妆品中微生物检测技术的未来展望随着科学技术的不断发展，化妆品中微生物检测技术也在不断更新和完善。
未来，该领域可能出现以下趋势和应用：1. 提高检测速度和精确度目前微生物检测技术中的一大挑战是提高检测速度和精确度。
随着新技术的应用，如基于纳米技术的检测方法，预计未来的技术将更加高效和准确。
化妆品防腐效能评价方法操作指南-中国食品药品检定研究院
化妆品防腐效能评价方法操作指南化妆品防腐效能评价比较常用的方法是微生物挑战性实验。
其基本原理是：将一定量的微生物加入到化妆品中，每隔一定时间检测微生物增减的数量，以此来判断防腐剂的防腐效能。
通过该方法既可以评价防腐剂的效能，又能在安全剂量内确定化妆品使用的防腐剂的最低浓度。
微生物挑战性实验可采用单一培养或混合培养方式。
单一培养即分别接种每种实验菌株的菌悬液于测试化妆品中，在接种后的一定时间内对化妆品进行平板计数（APC），以此判断防腐剂的防腐效能。
混合培养为将几种细菌或真菌的混合液接种于化妆品中，在接种后一定时间内，测定化妆品的APC，以此判断防腐效能。
可根据实际情况选择培养方式挑战性实验测试菌株的选用原则为：尽量覆盖革兰氏阳性、阴性细菌，酵母菌和霉菌至少各一种，并且对各防腐剂抵抗性较高，能代表化妆品中可能污染的微生物对防腐剂的抵抗性的菌株。
可根据化妆品的性质，生产、使用环境等增加菌株。
一般较常用的菌株为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌和黑曲霉等。
检测时间：一般为在样品中加入微生物时，以及第1、7、14、21、28天检测化妆品中的菌落数。
判定标准：推荐采用《欧洲药典》的结果评定标准，即细菌于第7天时菌落总数下降99.9%，至第28天时无增长；真菌于第14天下降99.0%，至28天时无增长，判断为防腐效果良好。
对于能够保证化妆品产品微生物质量合格，且在使用过程中不存在二次污染的化妆品可以不进行微生物挑战性实验。
化妆品防腐效能评价方法1.定义微生物挑战性实验：将一定量的微生物加入到化妆品中，每隔一定时间检测微生物增减的数量，以此来判断防腐剂的防腐效能的实验方法。
2仪器设备2.1 生物安全柜2.2 高压蒸汽灭菌器2.3 冰箱2.4 恒温培养箱2.5 均质器2.6 旋涡振荡器2.7天平2.8 灭菌培养皿2.9 灭菌试管2.10灭菌刻度吸管2.11 灭菌试剂瓶2.12 玻璃珠3.试剂和培养基3.1 生理盐水3.2 含0.05%吐温80的生理盐水3.3 改良的LETHEEN 肉汤3.4水解大豆琼脂培养基（TSA培养基）3.5马铃薯葡萄糖培养基（PDA）3.6萨布罗右旋糖琼脂培养基(SDA)4.实验菌株4.1细菌：金黄色葡萄球菌A TCC6538，大肠杆菌A TCC8739，铜绿色假单胞菌ATCC9027。
微生物挑战性试验
1.0目的新产品防腐效果的测试2.0 范围公司新产品3.0参考：4 材料与方法4. 1 化妆品中常用的防腐体系[ 6]营养琼脂培养基、改良马丁琼脂培养基、营养肉汤培养基、0.9%氯化钠溶液、平皿、接种环、培养箱等4. 2 微生物挑战性实验4. 2. 1 受试用微生物测试用细菌和霉菌均由浙江省食品和药品检验所提供。
细菌包括: 大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、巨大芽胞杆菌、绿脓杆菌。
霉菌包括: 黑曲霉、黄曲霉、变色曲霉、桔青霉、拟青霉、腊叶芽枝霉、球毛壳霉、绿色木霉。
实验前，将各菌种接种于合适的培养基中, 于 37℃( 细菌) 或28℃( 霉菌) 下培养。
细菌培养在2天后, 霉菌培养在3-5 天后，挑选适量菌落于灭菌的生理盐水中，制成一定浓度的混合细菌( 1×108 个/ ml) 或混合霉菌悬液( 1×107个/ ml) , 置于4℃贮放备用。
4. 2. 2 一次加菌的28 天微生物挑战试验此方法参照美国药典( 第2 1 版) 上微生物挑战性试验检测防腐剂效果的方法。
称取各受试样品30g, 加入混合细菌或混合霉菌悬液, 每克受检膏霜最终含菌量分别为5×106个细菌和3 ×105个霉菌。
然后充分混匀, 置于28℃下。
在接菌的0、7、14、2 1 和28天取样分析: 准确称取3g 企业名称杭州国光旅游用品有限公司 Hangzhou Guoguang Touring Commodity Co.,Ltd. 文件编号 SSOP-04 版本/修改号 1.0 文件名称微生物挑战性试验操作规范 Standard Operation Procedure for Hygiene Standard 生效日期 2010/7/1 页 次 第1页 共6页 编写 审核 批 准样品, 加到含有玻璃小珠的灭菌锥形瓶内, 加入27ml灭菌生理盐水, 充分震荡混匀, 此悬液为1∶10稀释液；然后再用灭菌生理盐水按10倍依次稀释。
微生物挑战性实验方法
1.0目的新产品防腐效果的测试2.0 范围公司新产品3.0参考：4 材料与方法4. 1化妆品中常用的防腐体系[ 6]营养琼脂培养基、改良马丁琼脂培养基、营养肉汤培养基、0.9%氯化钠溶液、平皿、接种环、培养箱等4. 2微生物挑战性实验4. 2. 1受试用微生物测试用细菌和霉菌均由浙江省食品和药品检验所提供。
细菌包括: 大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、巨大芽胞杆菌、绿脓杆菌。
霉菌包括: 黑曲霉、黄曲霉、变色曲霉、桔青霉、拟青霉、腊叶芽枝霉、球毛壳霉、绿色木霉。
实验前，将各菌种接种于合适的培养基中, 于37℃( 细菌) 或28℃( 霉菌) 下培养。
细菌培养在2天后, 霉菌培养在3-5 天后，挑选适量菌落于灭菌的生理盐水中，制成一定浓度的混合细菌( 1×108 个/ ml) 或混合霉菌悬液( 1×107个/ ml) , 置于4℃贮放备用。
4. 2. 2一次加菌的28 天微生物挑战试验此方法参照美国药典( 第2 1 版) 上微生物挑战性试验检测防腐剂效果的方法。
称取各受试样品30g, 加入混合细菌或混合霉菌悬液, 每克受检膏霜最终含菌量分别为5×106个细菌和3 ×105个霉菌。
然后充分混匀, 置于28℃下。
在接菌的0、7、14、2 1 和28天取样分析: 准确称取3g样品, 加到含有玻璃小珠的灭菌锥形瓶内, 加入27ml灭菌生理盐水, 充分震荡混匀, 此悬液为1∶10稀释液；然后再用灭菌生理盐水按10倍依次稀释。
按平板倾注法计数受试品中含菌量, 细菌培养是37 ℃下24h～48h，霉菌培养为28℃下3～5 天。
此实验用以评判防腐剂的有效与否。
评判标准为: 当每克样品中一次接菌( 1×106细菌和1×105霉菌) 后, 在第14天存活菌量减少至不高于起始浓度的0. 1%, 以后逐渐减少, 在28 天为0 。
符合标准为防腐剂有效( 通过测试) , 不符合为防腐剂无效(不通过测试)。
微生物挑战性试验
1.0目的新产品防腐效果的测试2.0 范围公司新产品3.0参考：4 材料与方法4. 1 化妆品中常用的防腐体系[ 6]营养琼脂培养基、改良马丁琼脂培养基、营养肉汤培养基、0.9%氯化钠溶液、平皿、接种环、培养箱等4. 2 微生物挑战性实验4. 2. 1 受试用微生物测试用细菌和霉菌均由浙江省食品和药品检验所提供。
细菌包括: 大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、巨大芽胞杆菌、绿脓杆菌。
霉菌包括: 黑曲霉、黄曲霉、变色曲霉、桔青霉、拟青霉、腊叶芽枝霉、球毛壳霉、绿色木霉。
实验前，将各菌种接种于合适的培养基中, 于 37℃( 细菌) 或28℃( 霉菌) 下培养。
细菌培养在2天后, 霉菌培养在3-5 天后，挑选适量菌落于灭菌的生理盐水中，制成一定浓度的混合细菌( 1×108 个/ ml) 或混合霉菌悬液( 1×107个/ ml) , 置于4℃贮放备用。
4. 2. 2 一次加菌的28 天微生物挑战试验此方法参照美国药典( 第2 1 版) 上微生物挑战性试验检测防腐剂效果的方法。
称取各受试样品30g, 加入混合细菌或混合霉菌悬液, 每克受检膏霜最终含菌量分别为5×106个细菌和3 ×105个霉菌。
然后充分混匀, 置于28℃下。
在接菌的0、7、14、2 1 和28天取样分析: 准确称取3g 企业名称杭州国光旅游用品有限公司 Hangzhou Guoguang Touring Commodity Co.,Ltd. 文件编号 SSOP-04 版本/修改号 1.0 文件名称微生物挑战性试验操作规范 Standard Operation Procedure for Hygiene Standard 生效日期 2010/7/1 页 次 第1页 共6页 编写 审核 批 准样品, 加到含有玻璃小珠的灭菌锥形瓶内, 加入27ml灭菌生理盐水, 充分震荡混匀, 此悬液为1∶10稀释液；然后再用灭菌生理盐水按10倍依次稀释。
微生物挑战性试验
目地新产品防腐效果地测试范围公司新产品参考：材料与方法. 化妆品中常用地防腐体系[ ]营养琼脂培养基、改良马丁琼脂培养基、营养肉汤培养基、氯化钠溶液、平皿、接种环、培养箱等. 微生物挑战性实验. . 受试用微生物测试用细菌和霉菌均由浙江省食品和药品检验所提供.细菌包括: 大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、巨大芽胞杆菌、绿脓杆菌.霉菌包括: 黑曲霉、黄曲霉、变色曲霉、桔青霉、拟青霉、腊叶芽枝霉、球毛壳霉、绿色木霉. b5E2R 。
实验前，将各菌种接种于合适地培养基中, 于 ℃( 细菌) 或℃( 霉菌) 下培养.细菌培养在天后, 霉菌培养在 天后，挑选适量菌落于灭菌地生理盐水中，制成一定浓度地混合细菌( × 个) 或混合霉菌悬液( ×个 ) , 置于℃贮放备用.p1Ean 。
. . 一次加菌地 天微生物挑战试验此方法参照美国药典( 第 版) 上微生物挑战性试验检测防腐剂效果地方法.称取各受试样品, 加入混合细菌或混合霉菌悬液, 每克受检膏霜最终含菌量分别为×个细菌和 ×个霉菌.然后充分混匀, 置于℃下.在接菌地、、、 和天取样分析: 准确称取样品, 加到含有玻璃小珠地灭菌锥形瓶内, 加入灭菌生理盐水, 充分震荡混匀, 此悬液为∶稀释液；然后再用灭菌企业名称杭州国光旅游用品有限公司 . 文件编号 版本修改号 文件名称微生物挑战性试验操作规范 生效日期 页 次 第1页 共页 编写 审核 批 准生理盐水按倍依次稀释.按平板倾注法计数受试品中含菌量, 细菌培养是℃下～，霉菌培养为℃下～天.此实验用以评判防腐剂地有效与否.评判标准为: 当每克样品中一次接菌( ×细菌和×霉菌) 后, 在第天存活菌量减少至不高于起始浓度地. , 以后逐渐减少, 在天为 .符合标准为防腐剂有效( 通过测试) , 不符合为防腐剂无效(不通过测试).DXDiT。
分析与检测. . 重复次加菌地微生物挑战试验此方法参照国际（国际化妆品、香精和洗涤剂协会）推荐地微生物挑战性试验.称取受试样品 , 每隔周加菌一次( 即实验地第、和周) , 每次加细菌量为×～×个样品和霉菌×个～×个样品.在加菌后地天、天和天( 后一次加菌前) 采样分析样品中含菌量, 方法同前.此方法可将受检样品分为三类:RTCrp。
化妆品微生物检验方法
化妆品微生物检验方法化妆品微生物检验方法是保证化妆品质量和安全性的重要环节之一、微生物检验旨在检测化妆品中是否存在致病或有害微生物，并评估其对人体的危害程度。
常用的化妆品微生物检验方法包括总生菌数、霉菌与酵母菌数、大肠菌群、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌等指标的检测。
首先，样品的制备过程中需要选择适当的培养基和增菌条件。
通常将适量的化妆品样品加入到无菌的苗条瓶或小瓶中，加入适量的培养基并混匀。
对于含有高浓度防腐剂或抗菌剂的化妆品样品，还需要将样品进行稀释以降低防腐剂的作用。
然后，将样品进行摇匀或振荡，以保证样品的均匀分布。
接下来，进行微生物的富集。
一般来说，化妆品样品中的微生物数量较少，因此需要对样品进行富集处理以增加微生物的检出率。
常用的富集方法包括摇床富集法、过滤富集法、以及使用适当的抑菌剂来抑制防腐剂对微生物的影响。
然后，进行微生物的分离。
富集样品后，将样品取一定量均匀涂布在适当的培养基上，并进行培养。
通过分离纯菌的方式，可以获得单一的微生物菌株，从而进行后续的鉴定和计数。
最后，进行微生物菌株的鉴定和计数。
常用的鉴定方法包括形态学观察、生理生化特性检测、API试纸和分子生物学方法等。
形态学观察是最常用的方法，通过观察菌落的颜色、形状、大小、质地和透明度等特征来初步鉴定细菌的种属。
生理生化特性检测则是通过检测菌落的气味、产酶和耐受性等特征来进一步鉴定菌株。
API试纸是一种常用的微生物鉴定试剂，可以根据菌株对不同化学物质的反应来判断其种属。
分子生物学方法可以根据菌株的基因序列进行鉴定，如16SrRNA基因测序等。
微生物计数则可以通过在适当的培养基上进行菌落计数或数量化培养等方法进行。
综上所述，化妆品微生物检验方法是确保化妆品安全性和质量的重要环节。
通过适当的样品制备、微生物富集、分离和鉴定等步骤，可以准确评估化妆品中的微生物负荷，从而为化妆品行业的发展提供保障。
一种新的化妆品微生物挑战实验方法
一种新的化妆品微生物挑战实验方法
范新雨;张太军;程双印;洪胜保;周生
【期刊名称】《香料香精化妆品》
【年(卷),期】2007(000)001
【摘要】针对 USP等法选用单个菌种进行激发实验,工作量大而繁琐、检测费用高、未考虑实际生产环境微生物污染等不足,提出了一套适合国内化妆品企业研发、生产控制的微生物挑战实验方法--混合标准菌和环境菌激发实验方法,并与USP法进行实验比较.结果表明:采用该方法,比USP法更切合实际,既能保证检测结果的客
观性、准确性,又能减少工作量降低检测费用,可作为化妆品企业进行化妆品防腐体
系功效性评价的参考方法.
【总页数】4页(P13-16)
【作者】范新雨;张太军;程双印;洪胜保;周生
【作者单位】广东名臣化妆品有限公司技术开发部,广东汕头,515834;广东名臣化
妆品有限公司技术开发部,广东汕头,515834;广东名臣化妆品有限公司技术开发部,
广东汕头,515834;广东名臣化妆品有限公司品质管理部,广东汕头,515834;广东名
臣化妆品有限公司品质管理部,广东汕头,515834
【正文语种】中文
【中图分类】TQ65
【相关文献】
1.过氧化氢挑战实验：一种新的近似实时检测啤酒风味稳定性的方法 [J], 李勇强（摘译）
2.化妆品微生物挑战试验 [J], 刘树葆;臧跃;杨桂菊
3.用微生物挑战性试验考察一种新型复合防腐剂在化妆品中的防腐效果 [J], 王珊珊;孔秋婵;冯小玲;龚盛昭
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化妆品微生物挑战试验
刘树葆臧跃扬桂菊
（天津化妆品科学技术研究皖有强公司）
摘要：本文参照美国化妆品、盥洗用品和香精协会（ＣＴＦＡ）推荐的防腐体系效能评价方法，研究了不同产品在相同防腐条件下，微生物挑战试验结果的差异性。
关键词：防腐体系，微生物挑战试验，膏霜，乳液，水剂。
目前，化妆品琳琅满目，产品配方复杂多样，通常包含多种成分，尤其许多化妆品中的营养成分非常适合微生物的生长，而微生物存在于我们生活着的世界的每一个角落，从而为化妆品的生产和保存带来困难。
微生物污染将导致产品在气味、颜色、粘度、性能上都会发生改变。
因此化妆品微生物污染对产品质量、正常使用以及使用者健康来说是一个极大的冒险“’。
为防止微生物污染，就对产品的防腐提出了挑战，所以必须建立很好的防腐体系，以保证产品的安全、稳定性“’，为消费者提供安全和高品质的产品。
评价化妆品质量的～个重要指标就是微生物是否达到化妆品卫生规范的要求，本实验参照美国化妆品、盥洗用品和香精协会（ＣＴＦＡ）推荐的防腐体系效能评价方法。
’，对相同防腐体系不同功能的膏霜、乳液及水剂产品进行微生物挑战试验，以指导配方师合理添加防腐剂。
１．实验方法
ｉ．Ｉ．ＣＴＦＡ推荐的防腐单次挑战试验
ＣＴＦＡ推荐的经典的为期２８天的防腐单次挑战实验，是将防腐剂混入配方基质中，然后～次性接入若干种类、～定数量的微生物进行挑战，将样品存放于适当的温度下，定期抽样检测其中残存的微生物，并根据微生物的数量变化情况评价样品的抗菌效果。
１．２试验仪器
恒温培养箱：霉菌培养箱：显微镜：灭菌平皿：直径为９ｃｍ；ｐＨ计；高压灭菌锅；酒精灯：锥形烧瓶；量筒：灭菌刻度吸管：ｌＯｍｌ、２ｍｌ、ｉｍｌ；试管。
Ｉ．３．培养基和试剂
生理盐水：ＳＣＤＬＰ液体培养基：卵磷脂、吐温８０一营养培养基：乳糖胆盐培养基：蛋白胨水：靛基质试剂：十六烷三甲基溴化铵培养基；绿脓菌素测定用培养基：硝酸盐蛋白胨水培养基：普通琼脂斜面培养基：血琼脂培养基；甘露醇发酵培养基：血浆：孟加拉红培养基。
ｌ＿４挑战用微生物
测试用菌种由天津市卫生防病中心提供，霉菌和杂菌由实验室从污染产品中分离到的菌珠。
菌种包括：金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯氏菌、大肠埃希氏菌。
实验前，将各菌种接种于合适的培养基中，于３７。
Ｃ（细菌）和２８℃（霉菌）培养箱中培养。
细菌培养４８小时，霉菌培养７２小时后，挑选典型的菌落于灭菌的液体培养基中制成～定浓度的细菌和霉菌混合悬液，置于冰箱冷藏备用。
１．５待测样品
选择了８种化妆品基质，其中膏霜２种、乳液２种、水剂２种。
按相同的防腐体系常规方法加入基质中，在进行微生物挑战性实验前预先进行细菌总数及霉菌和酵母菌的测定，试验样品的菌落数均应小于１０，作为待测样品。
１．６接种的方式和数量
接种的方式：采用混合接种。
因为自然界的微生物有混生杂居的特点，所以混合接种符合实际污染的情况。
接种的数量：将各菌种接种于合适的培养基中，于３７。
Ｃ（细菌）和２８。
Ｃ（霉菌培养箱中培养。
细菌培养４８小时，霉菌培养７２小时后，挑选典型的菌落于灭菌的液体培养基中制成～定浓度的细菌和霉菌混合悬液，置于冰箱冷藏备用。
细菌：每克悬液含菌量为５Ｘ１０８ｃＦｕ／克或ＣＦＵ／ｎ，１；霉菌；每克悬液含菌量为３×１０６ＣＦＵ／克或ＣＦＵ／ｍｌ。
１．７微生物挑战实验
称取８种化妆品基质样品各１００克，加入灭菌的容器内，加入混合细菌和霉菌悬液，充分混匀。
每克样品含细菌量为５Ｘ１０６ＣＦＵ／克或ＣＦＵ／Ｍ；含霉菌量为３×１０４ＣＦＵ／克或ＣＦＵ／ｍｌ。
然后置于２８。
Ｃ下。
在接菌的０、７、１４、２１、２８天取样分析：准确称取１０克样品，加到含有玻璃小球和９０ｍｌ灭菌生理盐水的锥形瓶内，充分震荡混匀，此悬液为１：１０稀释液：然后再用生理盐水按１：１０依次稀释。
按平板倾注法计数样品中含菌量细菌培养３７。
Ｃ下４８小时；霉菌培养２８。
｜Ｃ下７２小时。
１．８评价方法
在２８天全部降至小于ＩＯＣＦＵ／ｇ（ＣＦＵ／ｍ１）视为防腐效果优秀，在第７天下降到１０００ＣＦＵ／ｇ（ＣＦＵ／ｍ１）以下视为勉强通过，其它视为不通过。
２．实验结果与讨论
在接种的０、７、１４、２ｌ和２８天取样检测，其结果如下表：
微生物挑战试验结果（混合菌量）（ＣＦＵ／ｇ）
样品菌种初始浓第０天第７天第１４天第２ｌ天第２８天评价
度
膏霜ｌ＃细菌５×ｌ０６４×１舻（１０＜１０（１０＜１０、，霉菌３×１０４３Ｘ１０４（１０（１０（１０（１０
膏霜２＃细菌５×１０６５×１０６２×１０。
４×１０４（１０（１０Ｘ霉菌３×１０４３×ｉ０４２×１０３（１０（１０＜１０
５×１０６
膏霜３＃细菌２Ｘ１０６（１０（１０（１０（１０√
３×１０４
霉菌３×１０４（１０（１０（１０（１０
乳液１＃细菌５×１０６５×１０６３×１０４６×１０４２×１０５２×１０６×霉菌３×１０４３Ｘ１０４（１０（１０＜１０（１０
乳液２＃细菌５×１０６５×１０６（１０（１０（１０（１０√霉菌３Ｘ１０＇３×１０４（１０（ｔ０＜ｉ０《１０
乳液３＃细菌５×１０６４×１０６（１０（１０（１０（１０√霉菌３×１０４２×１０４（１０（１０（１０（１０
水剂ｌ＃细菌５×１０６５×１０６（１０（１０（１０（１０√霉菌３Ｘ１０４３×１０４（１０（１０（１０（１０
水剂２＃细菌５×１０６４×１０６＜１０（１０＜１０（１０√霉菌３×１０４３×１０４（１０（１０（１０（１０从表中可以看到，２＃膏霜和Ｉ＃－￥Ｌ液没能通过微生物挑战试验，而其它产品则通过了试验。
一个
有效、稳定的防腐体系的存在是保证产品保质期质量的重要因素，但它并不能替代良好的严格的生产操作工艺，而原材料质量、包装设计、货架期以及消费的使用（包括可预见的误用）等因素都会对化妆品中微生物的污染产生影响。
化妆品中微生物的污染主要有两种途径，一是在化妆品制造过程中受到的污染，称为一级污染，包括设备、原料、生产及包装四个过程。
另一种途径是在消费者的使用过程中造成的污染，称为二级污染。
除了配方中的防腐体系，正确控制和完善这些因素也是提高产品微生物质量的保证“’。
３．结论
原料选择、配方组合、生产设备、生产过程、存放条件及使用过程都会对产品微生物稳定性产生影响，配方师调配方过程中应考虑防腐剂的品种、使用剂量及合理配伍等，但对最终产品直接进行微生物挑战试验最为客观和重要“１”。
以上试验表明，虽然上述产品防腐体系相同，但由于产品体系不同（膏霜、乳液及水剂），产品功能不同，加入的成分也不完全相同，所以防腐效果也不尽相同。
配方师可以参照试验结果对没有通过测试的产品配方的防腐体系进行调整，正确选择防腐体系以保证产品质量。
参考文献
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ＴｈｅＭｉｃｒｏｂｉａｌＣｈａｌｌｅｎｇｅＴｅｓｔｏｆＣｏｓｍｅｔｉｃｓ
Ａｂｓｔｒａｃｔｓ：Ｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓｏｆｍｉｃｒｏｂｉａｌｃｈａｌｌｅｎｇｅｔｅｓｔｆｏｒａｓｅｒｉｅｓｏｆｐｒｏｄｕｃｔｓｉｓｓｔｕｄｉｅｄｉｎｔｈｅｓａｎｌｅｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅｓｙｓｔｅｍ，ａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏＣＴＦＡ＇ｓｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ．
Ｋｅｙｗｏｒｄ：Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅｓｙｓｔｅｍ，ＭｉｃｒｏｂｉａｌＣｈａｌｌｅｎｇｅｔｅｓｔ，Ｃｒｅａｍ，ＭｉｌｋＴｏｎｅｒ．
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