细菌防腐剂挑战性实验

摘要：对建立化妆品防腐体系的各种要素进行了分析，就国内外有代表性的微生物挑战试验的评价方法进行了比较，提出了符合实践情况并适用于我国化妆品行业的化妆品防腐体系的效能测试方法的评价标准，还为化妆品防腐体系筛选过程的快速判定提供了经验依据。

关键词：化妆品；防腐剂；防腐体系；微生物挑战试验大多数化妆品富含微生物生长所需的养分，环境中的微生物一俟进入，即可迅速繁殖，破坏产品的感官品质，损害消费者的健康。

因此，一个良好的防腐体系，对于化妆品产品来说是必不可少的。

1 化妆品的防腐体系化妆品的防腐体系实际上是由若干种防腐剂（和助剂）按一定比例构建而成。

防腐体系的基本要素是防腐剂，但其效能大小又与其用量和使用对象的剂型（液态、粉状、乳状、膏霜状等）特性、组成（是否含碳水化合物、蛋白质、动植物抽提物等）、pH值、可能污染的微生物种类和数量等密切相关。

1.1化妆品防腐剂早期使用的防腐剂有：尼泊金脂类、苯甲醇、烷基二甲基苄基铵氯化物、对氯间二甲酚、苯氧基乙醇、布罗波尔（Bronopol，2-溴-2-硝基丙烷-1，3-丙二醇）、道维希尔200（Dowicil-200,六亚甲基四胺衍生物）、杰马-115(Germall-115，咪唑烷基脲)、脱氢醋酸、甲醛、山梨酸等。

这些防腐剂至今很多仍在使用。

近期推广商品化的化妆品防腐剂见表1。

至于复配而成的防腐剂商品更是数不胜数。

防腐剂对微生物的最低抑制浓度（cmc）是判断一种防腐剂效果的首先考虑的基本指标，MIC值越小，表明其效力越高。

表2是某些化妆品防腐剂对主要测试微生物的MIC。

表1一些化妆品防腐剂商品及化学成分商品名称化学成分Enxylk400 甲基二溴戊二腈和苯氧乙醇Biopure100 咪唑烷基脲Nipaguard DMDMH 二甲基二羟基乙内酰脲Nipaguard TCC N-（4-氯苯基-N-3，4-二氯苯基）脲Nipacide PX (PCMX) 对氯间二甲苯酚GERMALLⅡ双咪唑烷基脲GERMALL PLUS 双咪唑烷基脲和碘丙炔基氨基甲酸丁酯（IPBC）ALLANTOIN 乙醛双酰脲SUTTOCIDE A 羟甲基甘氨酸钠华科-98、凯松CG、2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮和5-氯-2-2甲基-4-异JX-515、YN-H3 噻唑啉-3-酮GLYDANT 二甲基二羟基乙内酰脲GLYDANT PLUS DMDM和IPBCIRGASAN DP300（玉洁新DP-300）、2，4，4’-三氯-2’-羟基二苯醚Oletron1.2化妆品的防腐体系的构建1.2.1防腐剂的复配一种万能的防腐剂是不存在的。

多种防腐剂的相互配合，优缺点的互补，至少有如下优势：①拓宽抗菌谱；某种防腐剂对一些微生物效果好而对另一些微生物效果差，而另一种防腐剂刚好相反。

两者合用，就能达到广谱抗菌的防治目的。

②提高药效：两种杀菌作用机制不同的防腐剂共用，其效果往往不是简单的叠加作用，而是相乘作用，这种所谓增效作用，通常在降低使用量的情况下，仍保持足够的杀菌效力。

③抗二次污染：有些防腐剂对霉腐微生物的杀灭效果较好，但残效期有限，而另一类防腐剂的杀灭效果不大，但抑制作用显著，两者混用，既能保证贮存和货架质量，又可防止使用过程中的重要污染。

④提高安全性：单一使用防腐剂，有时要达到防腐效果，用量需超过规定的防治目的，又可保证产品的安全性。

⑤预防抗药性的产生：如果某种微生物对一种防腐剂容易产生抗药性的话，它对两种以上的防腐剂都同时产生抗药性的机会自然就困难得多。

1.2.2化妆品防腐体系构建需考虑的其它因素并不是说，简单地把几种抗菌效果较好的防腐剂混配起来就能获得一个好的防腐体系了，各类化妆品的组分复杂，理化性能差异很大，防腐剂的效能能否充分发挥出来，还受到其中多方面因素的干扰和制约。

1.2.2.1防腐剂使用量化妆品防腐剂用量必须以安全性作为前提，我国和有关国家的组织允许使用的化妆品防腐剂都有一定的规定。

然而，要使防腐体系的效力能发挥出来，还须保证足够的使用量，在使用量选定时，可先参考防腐剂的MIC值和商品的说明书指导，但更重要的是必须通过具体产品的使用试验才能作出最终决定，因此，MIC值很小的杀菌剂，在产品中应用时表现得很糟糕的现象是经常发生的。

1.2.2.2产品的pH值大多数的防腐剂都容易在酸性和中性的环境中发挥其效能，在碱性环境中效力显著减低，甚至失效，而季铵盐类防腐剂却在pH值大于7时才有效。

环境中的pH 值主要是通过两方面的作用影响防腐剂效能的。

①pH值变化引起微生物的细胞膜结构的变化，从而改变其通透性，进而影响防腐剂分子的存在形式（例如离子形式或分子形式），而许多有机类的防腐剂通过常以分子形式才容易通过微生物细胞膜的脂质层。

1.2.2.3溶解性能这是一个较为复杂的因素。

微生物的生长繁殖必需在有水的环境中进行。

因此，在多相系统中、水相中须溶解有足够的防腐剂。

然而，只是强调防腐剂的水溶性显然是片面的，好的防腐剂还需要具有一定的脂溶性（或者说有一个恰当的油水分配系数），这样才有利于通过蛋白质（亲水）和脂质（亲油）构成的微生物细胞膜，进入细胞内，发挥其“毒害”细胞的作用。

1.2.2.4化学相容性一般来说，防腐剂和化妆品中的活性物质和助剂之间是有可能发生相互作用，也就是说，组分之间也具有一定的不相容性。

在筛选化妆品的防腐体系的时候，以下的一些情况是值得注意的：①化妆品中的某些组成材料如碳水化合物、滑石粉、金属氧化物、纤维素等会吸附防腐剂，降低其效力。

②产品中含有淀粉类物质，可影响尼泊金酯类的抑菌效果。

③高浓度的蛋白质一方面可能通过对微生物形成保护层，降低防腐剂的抗菌活性，另一方面又能促进微生物的增长。

④金属离子如Mg2+、Ca2+、Zn2+，对防腐剂的活性有很大的影响，一般情况下，过量的金属离子在香料、润滑剂、天然或敏感的化合物中易形成难溶物或发生催化氧化反应。

⑤防腐剂可和化妆品的某些组分形成氢键或螯合物，通过“束缚”或“消耗”的方式，降低防腐体系的效能。

⑥少量表面活性剂增加防腐剂对细胞膜的通透性，有增效作用，但是量大时会形成胶束，吸引水相中的防腐剂，降低了防腐剂在水相中的含量，影响了其杀菌效能。

⑦某些防腐剂和表面活性剂如硫酸盐、碳酸盐、含氮表面活性剂作用、和色素荧光染料作用、和包装材料作用、在影响防腐剂效力的表面张力，产品的发泡性，组分的溶解性，色素的显色性，香料的气味，活性因子的生物活性等多方面的影响或潜在影响等都应该在考虑之列。

1.2.2.5产品中微生物的初始污染量对防腐剂效能的发挥也有直接的影响当产品或原料污染严重时，微生物分泌的代谢产物与防腐剂作用，防腐剂杀死大量的菌体都会“消耗”一部分防腐剂；更重要的是，许多微生物在大量繁殖时，能分泌一种类似蛋白质物质，把菌体包裹起来，起到“抵御”外来化学物理因素的损害；有报道甚至指出，当微生物已经大量繁殖后，某些杀菌剂还可作为营养物被微生物利用。

由此可见，即使是同一防腐剂，在不同组成、不同剂型的化妆品中发挥出的防腐效能都可能很不一样。

一个防腐体系对一种特定的产品效果优良，而对另一种产品却很不理想是常有的事情，因此，在投产前对产防腐体系的可靠性做效能测试是十分必要的。

2化妆品防腐体系效能的评价2.1评价方法近年来，以微生物挑战试验作为测试和评价化妆品的防腐效能已经逐步被国内外化妆品生产企业接受和推行，这是基于微生物挑战试验能够模拟化妆品生产和使用过程中受到高强度的微生物污染的潜在可能性和自然界中微生物生长的最适条件，使简测试结果更接近“残酷的现实”，能经受“严峻的考验”，从而为保证产品避免由微生物污染造成的损失和保障消费者的健康提供可靠的保证。

虽然，目前世界各国及其有关组织对化妆品微生物挑战试验还未有一个统一的方法，但其基本设计则是相同的，这就是，在待测样本中人为地接种若干种类、一定数量的微生物，在适当的温度下存放，定期分离样本的微生物，并根据微生物的数量变化情况评价样本的抗菌效能。

不过，在微生物挑战试验的具体操作步骤里，不同国家和组织采用的测试菌种、接种方式、分离时间等还是有差异的，评价方法自然也有所不同，下面是几个典型的例子。

CTFA的方法初始的霉菌和细菌的接种量分别为104cfu/g（mL）和106cfu/g（mL），要求在第7天时霉菌降低90%，细菌降低99.9%，并且在28天内菌数持续下降。

美国在CTFA评价方法的基础上提出更为严格的标准，即，若单菌接种的三个平行试验中任何一种微生物数量的平均值，在第七天时下降到100 cfu/g（mL）以下，28天全部为0，则视为效果优良；通过挑战试验若第七天时下降到1000 cfu/g（mL）以下，则视为勉强通过：若单菌接种的任何一种微生物，任何一个平行样达不到上述标准，也达不到CTFA的要求，防腐体系则评定为无效。

S&M KOKO试验方法，每星期在25g同一样品中接种0.1mL 108 cfu/g~109 cfu/g（mL）的混合菌液，连续6星期，若每星期接种前的菌数下降至10 cfu/g（mL）以下，则视为合格。

本实验室参照CTFA的方法，根据目前国内生产企业的现状，特别是通过大量的实际测试数据分析和跟踪调查，提出了以下供化妆品企业参考的评价标准：[初始接种量细菌106 cfu/g~103 cfu/g（mL）]：①第28天时，样品中含细菌或霉菌＞103cfu/g（mL）该样品不能通过微生物攻击的挑战试验，表明样品的防腐体系不能有效地志到抑制微生物的作用，产品在生产、贮藏和使用中很容易受到微生物的污染。

②第28天时，样品中含细菌或霉菌在102 cfu/g~103 cfu/g（mL），该样品有条件地通过挑战试验，即当产品中蛋白质或其他动植物材料成分不是特别高，同时生产的卫生环境符合要求，包装物不易发生二次污染时，该防霉体系可以使用，否则不能。

③第28天时，样品中含细菌或霉菌在10 cfu/g~102 cfu/g（mL），表明该样品的防腐体系对微生物有较强的抑杀效果，通过挑战试验，产品在生产、贮藏和使用时不容易受到微生物污染。

④从第7天起，样品中的细菌或霉菌＜10 cfu/g（mL），说明该样品的防腐体系对微生物有特强的抑杀作用，通过挑战试验，产品在生产、贮藏和使用时很不容易被微生物污染。

2.2化妆品防腐体系快速评价方法探讨常规的微生物挑战试验方法的试用周期都在28天以上，这对于确定一个产品的防腐体系是必须的。

但很多生产企业在产品的防腐体系的筛选时，稍嫌摸索试验周期太长，不利于尽快淘汰无效的防腐体系而选择有希望的防腐体系作进一步试验，以缩短研究周期。

通过检测数据，可看到：①当测试进行到第7天时，若细菌和霉菌数均能降低到103级以下时，第28天时的结果和评价一般都能通过挑战试验；②当测试进行到第14天时，细菌和霉菌数在104级以上时，第28天时的评价基本都不能通过挑战试验。