第七节抗菌药物敏感性试验和细菌耐药性检查概要
抗菌药物敏感性试验与耐药检测ppt生物技术实验教学中心课件
8.联合药物敏感试验
1）方法很多，其中纸片法最为常用。先将试验菌均 匀涂布于培养基表面，盖好平皿，放置5分钟，待 平板表面水分吸收后，将两种含药纸片贴于平板 上，两纸片中心距离2--4mm左右。然后35℃ 孵育 过夜，取出观察结果。
2）结果判断 联合药物敏感试验可出现四种结果： A.无关作用： 甲+乙=甲单或乙单 B.拮抗作用： 甲+乙＜甲单或乙单 C.相加作用： 甲+乙=甲单+乙单 D.协同作用： 甲+乙＞甲单+乙单
三、实验操作步骤
（一）纸片扩散法：
1. M-H平板：直径为90mm，厚度 4mm。 2. 菌悬液制备：无菌挑取菌落于无菌生理盐水中，校
正浊度至0.5 麦氏。 3. 用无菌棉签浸入细菌悬液中，将棉签在试管壁上轻
轻挤压以挤去过多的菌液，用棉签以连续划线的方 式均匀涂抹琼脂平板表面三次（每次转60℃）使 菌液均匀分布，最后沿平板内缘涂抹一周。盖上 平板的盖子，放置3~10min。
一、实验目的：
1. 掌握纸片扩散法（K-B法）的原理、操作方法、结 果的判读及临床意义。
2. 了解各种稀释法抗生素敏感性试验的原理、操作 方法、结果判读和临床意义。
3. 掌握纸片扩散法的质量控制，了解稀释法的质量 控制。
二、实验原理
1. 抗菌药物敏感性试验是测定抗生素或其他抗 微生物制剂在体外抑制细菌生长的能力。这 种能力可以通过稀释或扩散方法来测定。
六、影响因素：
1. 培养基：厚度，PH，离子浓度，成份，添加剂； 2. 抗菌药物的配制方法，纸片的含量，大小，
渗透性，保存方式等； 3. 细菌的接种量； 4. 培养的环境，温度与时间； 5. 结果的判断及解释标准等。
4.每个孔加入100ul浓度为105菌悬液（大肠或金 葡），混匀，胶布封口，37°C培养。
细菌药敏试验及其耐药表型检测
药敏试验
MIC：在与微生物生长速率有关的特定 时间间隔内，通常是18～24小时，能够 抑制被测菌生长的最低药物浓度。
对倍稀释的优点：
操作容易 敏感株的MIC呈正态分布 区分异常(R)与敏感(S)的菌群
药敏试验折点的建立
1. MIC的分布 2. 药代动力学和药效学 定 MIC的折点 3. 临床疗效和细菌清除率 4. 抑菌圈直径的分布 ………定抑菌圈折点
统计学的线性回归 计算错误率：尽可能减少极重要误差 (假敏感率)
MIC的分布
20 15 10 5 0
0.008 0.032 0.125
0.5
二级 红霉素类
万古霉素
克林霉素，万古霉素
三级 氯霉素
庆大霉素
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常规测试并报告的药物分组(3)
一级 二级 三级
流感嗜血杆菌
氨苄西林，青霉素 复方磺胺 头孢呋肟，头孢噻肟 头孢他啶，氯霉素 阿奇霉素，头孢克罗 环丙沙星，亚胺培南
2
8
32 128 512
药代动力学和药效学
药代动力学：药物吸收，分布，代谢，排泄 药效学：药物对机体的作用
时间依赖型（％T>MIC〕：β-内酰胺类，大环内酯类 浓度依赖型（AUC/MIC比率〕：AGS, FQ 这些参数可用于计算具有最佳药效的给药方案
MIC与抑菌圈直径的线性关系
规定常规测试报告的抗生素； 不同的药判定标准不同； 不同的菌判定标准也不同。
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常规测试并报告的药物分组(1)
实验七++细菌的药敏试验与耐药性检测
实验七细菌的药敏试验及耐药性检测【目的和要求】1.掌握纸片扩散法（K-B法）、液体稀释法两种药敏试验的原理和方法。
2.熟悉上述两种药敏试验方法的应用。
3.了解几种细菌耐药表型检测的原理、方法及意义。
【试剂与器材】1．培养基：一般需氧和兼性厌氧菌采用水解酪蛋白（M-H）琼脂或M-H液体培养基（pH7.2~7.4）。
对于营养要求高的细菌，则需在M-H培养基中加入其它营养成分。
2．抗菌药物纸片：直径为6.0~6.35mm的滤纸片上，含有一定量的某种抗菌药物。
市场有售，但生产厂家须获得国家食品药品监督管理局（SFDA）批准。
不同种类的待测菌药敏试验选择不同的抗菌药物，药敏纸片的选择见表7-1。
3．待测细菌接种普通营养琼脂经35℃16~18h的纯培养物。
4. 0.5%麦氏比浊管配制方法如下：0.048mol BaCl2 (1.17% W/V BaCl2 . 2H2O) 0.5ml0.18mol H2SO4 (1%, V/V) 99.5ml将二液置冰水浴中冷却后混合，置螺口试管中，放室温暗处保存。
用前混匀。
有效期为6个月。
5.其它：无菌生理盐水、无菌棉签、无菌试管、酒精灯、镊子、生物安全柜、培养箱等。
【实验容】一、纸片扩散法（K-B法）药敏试验1．原理将含有定量的抗菌药物纸片贴在已接种待测细菌的琼脂平板表面，纸片上的药物随即溶于琼脂中，并沿纸片周围由高浓度向低浓度扩散，形成逐渐减少的梯度浓度。
在纸片周围，一定浓度的药物抑制了细菌的生长从而形成了透明的抑菌环，抑菌环的大小则反映了待测菌对该种药物的敏感程度。
K-B法是由Kirby - Bauer 建立，美国NCCLS推荐，目前为世界所公认的标准纸片扩散法（定性法）。
2．方法（1）培养基的准备：将无菌M-H琼脂加热融化，趁热倾注入无菌的直径90mm平皿中。
琼脂厚为4mm（约23~25ml培养基），琼脂凝固后塑料包装放4℃保存，在5日用完，使用前应在37℃培养箱放置30min使表面干燥。
抗菌药物敏感试验细菌耐药性检测讲义
点的刻度浓度即为抗菌药物抑制细菌的MIC。
依照CLSI标准判断其敏感、耐药、中介。
26
有菌生长区 无菌生长区Βιβλιοθήκη 27椭圆形细菌 生长抑制区
256 128
8
判读抑菌浓度
（MIC ug/ml)
016
28
E test 法特点
优点 连续浓度梯度，与琼脂稀释法相关性好 （相关系数为0.9）.可测MIC。 操作简单，影响因素少，稳定性高。
32
两种药物的联合使用的效果
增强作用：两种抗生素联用的效果大于它们单
独使用时的效果之和； 20％～25％
相加作用：它们联用时的效果等于单用两种抗
生素效果之和； 60％～70％
无关作用：两种抗生素联用的效果，仅相当于 其中一种具有较强作用的抗生素的效果；
拮抗作用：两种抗生素联用时的效果反而小于
系列1
5
10
15
20
Diameter（mm）
13
纸片法药敏试验抑菌圈直径与结果解释的标准
抗菌药物与细菌 纸片含量 抑菌圈直径：mm 相应MIC μg/ml 耐药 中介度 敏感 耐药 敏感
丁胺卡那霉素 氨苄青霉素
测肠杆菌 测葡萄球菌 测嗜血杆菌 测肠球菌
30μg ≤14 15-16 ≥ 17 ≥32 ≤16
药物敏感细菌在纸片周围一定距离内的生长受到 抑制，形成抑菌圈。
抑菌圈的大小反映测试菌 对药物的敏感程度。 二者呈正相关。
11
抑菌圈边缘的药物浓度 与 MIC
12
抑菌圈的大小与MIC： 二者呈负相关，即抑菌圈愈大，MIC愈小。
lgMIC
50 40 30 20 10
0 0
实验七++细菌的药敏试验及耐药性检测
实验七细菌的药敏试验及耐药性检测【目的和要求】1.掌握纸片扩散法（K-B法）、液体稀释法两种药敏试验的原理和方法。
2.熟悉上述两种药敏试验方法的应用。
3.了解几种细菌耐药表型检测的原理、方法及意义。
【试剂与器材】1．培养基：一般需氧和兼性厌氧菌采用水解酪蛋白（M-H）琼脂或M-H液体培养基（pH7.2~7.4）。
对于营养要求高的细菌，则需在M-H培养基中加入其它营养成分。
2．抗菌药物纸片：直径为6.0~6.35mm的滤纸片上，含有一定量的某种抗菌药物。
市场有售，但生产厂家须获得国家食品药品监督管理局（SFDA）批准。
不同种类的待测菌药敏试验选择不同的抗菌药物，药敏纸片的选择见表7-1。
3．待测细菌接种普通营养琼脂经35℃16~18h的纯培养物。
4. 0.5%麦氏比浊管配制方法如下：0.048mol BaCl2 (1.17% W/V BaCl2 . 2H2O) 0.5ml0.18mol H2SO4 (1%, V/V) 99.5ml将二液置冰水浴中冷却后混合，置螺口试管中，放室温暗处保存。
用前混匀。
有效期为6个月。
5.其它：无菌生理盐水、无菌棉签、无菌试管、酒精灯、镊子、生物安全柜、培养箱等。
【实验内容】一、纸片扩散法（K-B法）药敏试验1．原理将含有定量的抗菌药物纸片贴在已接种待测细菌的琼脂平板表面，纸片上的药物随即溶于琼脂中，并沿纸片周围由高浓度向低浓度扩散，形成逐渐减少的梯度浓度。
在纸片周围，一定浓度的药物抑制了细菌的生长从而形成了透明的抑菌环，抑菌环的大小则反映了待测菌对该种药物的敏感程度。
K-B法是由Kirby - Bauer 建立，美国NCCLS推荐，目前为世界所公认的标准纸片扩散法（定性法）。
2．方法（1）培养基的准备：将无菌M-H琼脂加热融化，趁热倾注入无菌的直径90mm平皿中。
琼脂厚为4mm（约23~25ml培养基），琼脂凝固后塑料包装放4℃保存，在5日内用完，使用前应在37℃培养箱放置30min使表面干燥。
抗菌药物敏感性实验及细节耐药检测
抗菌药物敏感性实验与细节耐药性监测来源：查验医学在线2009-4-15 南网编辑2010-7-6一、需氧菌及兼性厌氧菌的药物敏感实验(一)纸片琼脂扩散法纸片琼脂扩散法又称Kirby-Bauer实验，是操作最简易、利用最普遍的抗菌药物敏感性实验。
1．实验原理将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上。
纸片中所含的药物吸收琼脂中的水分溶解后不断向纸片周围区域扩散形成递减的梯度浓度。
在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制，从而形成透明的抑菌圈。
抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的最低抑菌浓度(MIC)呈负相关关系，即抑菌圈越大，MIC越小。
2．培育基和抗菌药物纸片(1)培育基：水解酪蛋白(Mueller-Hin-ton，MH)培育基是CLSI/NCCLS采用的兼性厌氧菌和需氧菌药敏实验标准培育基，pH值为～，对那些营养要求高的细菌如流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌、链球菌等需加入补充物质。
琼脂厚度为4mm。
配制琼脂平板当天利用或置塑料密封袋中4℃保留，利用前应将平板置35℃孵育箱孵育，使其表面干燥。
(2)抗菌药物纸片：选择直径为6.35mm，吸水量为20ul的专用药敏纸片用逐片加样或浸泡方式使每片含量达到规定所示。
含药纸片密封贮存2～8℃或-20℃无霜冷冻箱内保留，β-内酰胺类药敏纸片应冷冻贮存，且不超过l周。
利用前将贮存容器移至室温平衡l～2h，避免开启贮存容器时产生冷凝水。
3．细菌接种细菌接种采用直接菌落或细菌液体生长方式。
用麦氏比浊标准的菌液浓度。
校正浓度后的菌液应在15min内接种完毕。
接种步骤如下：①用无菌棉拭子蘸取菌液，在管内壁将多余菌液旋转挤去后，在琼脂表面均匀涂片接种3次，每次旋转60°，最后沿平板内缘涂抹1周；②平板置室温下干燥3～5min，用纸片分离器或无菌镊将含药纸片紧贴于琼脂表面；③置35℃孵育箱孵育16～18h后阅读结果，对甲氧西林和万古霉素药敏感实验结果应孵育24h。
抗菌药物敏感性试验及细菌耐药性监测技术
抗菌药物敏感性试验及细菌耐药性监测技术第一节常用抗茵药物应用的注意事项一、应用原则抗菌药物是指具有杀菌或抑菌活性，主要供全身应用(含口服、肌注、静注、静滴等，部分也可用于局部)的各种抗生素和磺胺类、硝基咪唑类、喹诺酮类、呋喃类等化学药物。
抗菌药物在临床医疗中应用广泛，是人类治疗或预防感染性疾病必不可少的重要药物。
抗菌药物虽可防病治病，但几乎每个品种都有一定的毒性反应，用得合理即为“药”，用得不当就是“毒”。
因此如何正确地应用抗菌药物一直是众多医务工作者研究和关心的重点问题。
合理应用抗菌药物的最基本原则是在全面了解患者、致病原与抗菌药物三者的基本情况和相互关系的基础上，安全有效地应用抗菌药物，这就要求医务工作者必须遵守以下原则：(一)尽早确立感染性疾病的病原菌在开始使用抗菌药物治疗前，应对各种标本(血、尿、痰、脓液和伤口渗出液、伤口引流液、胆汁、脑脊液及其他体液)进行涂片检查和培养，常规方法不易分离的病原微生物应尽量选用免疫学试验或其他诊断试验。
分离和鉴定病原菌后必须做抗菌药物敏感试验(药敏试验)，必要时宜同时测定联合药敏试验，以及时选用针对性强、抗菌活性高的药物，取得抗感染疗效。
(二)必须熟悉并掌握抗菌药物的适应证、抗菌活性、药动学特性和毒理学抗菌药物的选用应参考药物的抗菌活性、药动学特性、药效学、毒理学、药源、价格等因素综合考虑。
处理重度感染患者时，在病原菌检查和药敏试验结果未知晓前应根据临床诊断预测致病菌的种类，尽快开始经验治疗。
药敏结果获知后，仍应结合经验治疗的效果决定是否调整用药。
(三)应按照患者的生理、病理、免疫状态等合理用药要注意针对特殊人群选择抗菌药物的品种、剂量、疗程的特殊性。
新生儿和老年人能肝肾功能不全，血浆蛋白结合药物的能力较低；多数抗菌药物的排泄较慢，故应适当调节剂量。
多种青霉素类抗生素能分布到胎盘、乳汁，故对妊娠及哺乳妇女用药要慎重。
(四)注意用药方式的选用尽量避免皮肤、黏膜等局部应用抗菌袭物，特别是青霉素类的局部应用，以免产生过敏反应。
抗菌药物敏感性试验执行标准
抗菌药物敏感性试验执行标准抗菌药物敏感性试验是临床微生物学中非常重要的一项实验，它可以帮助医生选择最有效的抗菌药物来治疗感染性疾病。
执行标准的严格性和准确性对于试验结果的可靠性至关重要。
下面将介绍抗菌药物敏感性试验执行标准的相关内容。
首先，进行抗菌药物敏感性试验前，需要准备好所需的培养基、试验材料和各种试剂。
同时，要做好实验室的消毒和无菌操作，以确保试验的准确性和可靠性。
在进行试验时，需要按照严格的操作规程进行。
首先，要准备好待测菌株的悬浮液，然后按照一定比例将其接种到含有不同浓度抗菌药物的琼脂平板上。
接种后，要在恒温培养箱中进行培养，培养时间一般为16-18小时。
培养结束后，需要观察菌落的生长情况，并进行相关的数据记录和分析。
根据菌落的生长情况和抗菌药物的浓度，可以判断出菌株对抗菌药物的敏感性。
在记录和分析数据时，要注意细致入微，确保数据的准确性和可靠性。
在执行标准中，对试验结果的解释和判定也非常重要。
根据试验结果，可以判断出菌株对抗菌药物的敏感性、耐药性或者中间敏感性。
这些判定对于临床治疗具有指导意义，可以帮助医生选择最合适的抗菌药物来治疗感染性疾病。
此外，在执行标准中，还需要对试验过程中可能出现的干扰因素进行控制和排除。
比如，培养条件、试剂质量、操作技术等都可能对试验结果产生影响，需要在试验过程中进行严格的控制和调节。
总的来说，抗菌药物敏感性试验执行标准的严格性和准确性对于试验结果的可靠性至关重要。
在实验过程中，需要严格按照操作规程进行，确保试验过程的准确性和可靠性。
同时，对试验结果的解释和判定也非常重要，可以帮助医生选择最合适的抗菌药物来治疗感染性疾病。
在执行标准中，还需要对试验过程中可能出现的干扰因素进行控制和排除，以确保试验结果的准确性和可靠性。
抗菌药物敏感性试验与细菌耐药性检测
2.试验方法及结果判读
三、实验内容
1、实验材料
（1）药敏纸片： ① 用于G+c：红霉素、克林霉素、万古霉素、替考
拉宁、复方新诺明、新生霉素、头孢 西丁 ② 用于G-b：环丙沙星、亚胺培南、头孢曲松、 头孢噻肟、头孢他啶、氨曲南、 阿莫西林/棒酸
（2）菌株： 金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌标准菌株；
3、掌握葡萄球菌克林霉素诱导耐药（D试验） 的检测方法及结果判读。
二、实验原理
（一）抗菌药物敏感性试验检测
（二）细菌耐药表型检测
（一）抗菌药物敏感性试验
四种方法
1、纸片琼脂扩散法（K-B法） 2、稀释法 （1）肉汤稀释法 （2）琼脂稀释法 3、E-test法 4、联合药敏试验
纸片琼脂扩散法
1.基本原理
2、试验方法
MRS菌株的表型检测方法主要有头孢西丁 纸片扩散法、苯唑西林稀释法和苯唑西林盐 平板筛选试验，以头孢西丁纸片扩散法最常 用。
头孢西丁纸片扩散法解释标准
葡萄球菌克林霉素诱导耐药的检测 （D-test）
1.基本原理：
对大环内酯类耐药的葡萄球菌可能有天 然或诱导性对克林霉素的耐药，或只对大环 内酯类耐药。本试验可以测定诱导性的克林 霉素耐药。
2、什么叫D-test？该项检测有何意义？
2.试验方法
7
3.结果判读
用游标卡尺量取抑菌环直径，根据CLSI标准， 报告细菌对该抗菌药物是敏感（S）、中介 （I）还是耐药（R）。
4.注意事项
（1）菌液浊度应配制成0.5麦氏单位； （2）菌液调配好后应在15min内接种完； （3）菌液涂布药敏琼脂后应放置3-5min再贴
药敏纸片； （4）贴完纸片后不能再移动纸片；
金黄色葡萄球菌抗菌药物敏感性试验
第七章细菌对抗菌药物敏感性的检验
• 4、联合药敏试验 • 方法：一般应用两种抗菌药物同时对被检菌进行 扩散法或稀释法药敏试验，根据抑制圈的形态变 化，可判断两种药物是否具有协同、累加无关或 拮抗作用。以检测两种抗菌药物之间的药效相关 性。 • 特点是可预期任何两种抗菌药物联合用药的治疗 效果，指导临床选择最佳治疗方案。在提高疗效， 减少用药剂量，降低毒性反应，防止或延缓耐药 菌株的产生等方面有重要意义。 • 应用：主要用于各种严重感染、多重感染、耐药 菌株感染或慢性感染等情况下的药敏试验。
细菌药敏试验- E-test法
•E-test •Strips containing a gradient of antibiotic are placed on lawn of bacteria and incubated overnight. MIC is determined at point where zone of inhibition intersects scale on strip. •Combines ease of KB with an MIC method. Particularly useful for S. pneumoniae.
细菌药敏试验-宏量稀释法
mg/ml
4
2
1
0.5
0.25
0.12
0
微量液体稀释法
3.E-test法
• 方法：是结合了扩散法和稀释法的原理和特点， 操作时用宽5mm、长5Omm的塑料试条与抗菌药 物浓度梯度试条粘合，贴在涂有细菌的琼脂板上。 抗菌药物在琼脂内向四周扩散，可使敏感细菌在 一定范围内的生长受到抑制，形成抑菌圈。可根 据药敏试纸条两侧抑菌圈与试条相交位置的刻度 数值，准确、定量地测出抗菌药物对被检菌的最 低抑菌浓度(MIC)。 • 特点：同时具有扩散法和稀释法的优势，操作简 单、定量检测、结果直观准确、重复性好，可获 得与稀释法相同的效果，且较稀释法读出不连续 值更为准确。可广泛应用于许多微生物的药敏试 验。对各种耐药表型如中低度耐药株、延迟表达 耐药的菌株均可获得良好的效果。
抗菌药物敏感性试验
方法：
菌液制备：生理盐水校正测试菌和质控菌至 0.5麦氏比浊标准，再用MH肉汤稀释到 107CFU/ml；
加菌液：用微量加样器取0.1ml稀释菌液由低 到高加于各排试管中，其最终的接种量为 5×105 CFU/ml。测试菌排、测试菌生长对照 管加测试菌液；质控菌排、质控菌生长对照 管加质控菌液。
实验内容
常用抗菌药物敏感性试验与耐药检测 方法介绍。
纸片扩散法。 肉汤稀释法。
一、常用抗菌药物敏感性试验与耐药 检测方法介绍
纸片扩散法（Kirby-Bauer test） 稀释法（dilution test） E试验法（E test） 联合药物敏感试验 特殊耐药菌及耐药酶的表型检测
耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）的检测 β-内酰胺酶、超广谱β-内酰胺酶检测等
二、纸片扩散法（K-B法）
原理：
含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上， 纸片所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后便不断向纸片周 围区域扩散，形成递减的梯度浓度。在纸片周围抑菌浓度 范围内的细菌生长被抑制，形成透明的抑菌圈。
抗菌药物
青霉素 苯唑西林 万古霉素 庆大霉素 红霉素 克林霉素 磺胺药
纸片含药量
10U 1μg 30μg 10μg 15μg 2μg 1.25/23.75μg
耐药 ≤28 ≤10 — ≤12 ≤13 ≤14 ≤10
抑菌圈直径(mm)
中介
敏感
—
≥29
11～12
≥13
—
≥15
13～14
≥15
14～22
≥23
涂布接种：无菌棉拭蘸取菌液，在试管壁旋转挤去多 余菌液后在MH琼脂表面均匀涂布接种3次，每次旋转 平板60º，最后沿平板内缘涂抹1周；
公选-抗菌药物的敏感性试验
稀释法
• 稀释法药敏试验（dilution method）是在体外定量检
测抗菌药物对细菌之抗菌活性的方法，它测定的是抗
菌药物的最小抑菌浓度（minimum inhibitory
concentration ,MIC），故稀释法药敏试验常简称为 “MIC测定”。
一、 常量肉汤稀释法
• 试验材料 • 抗菌药物溶液的制备、储存和稀释
感染部位通常所能达到的浓度可抑制该感染菌
的生长。
耐药
• 所谓耐药(resistant，R)是指使用常规推荐剂量的抗菌 药物进行治疗时，该抗菌药在患者感染部位通常所能
达到的浓度不能抑制该感染菌的生长；或者该药对该
感染菌的临床疗效尚未在以往的治疗研究中被证实是 可靠的；或者抑菌圈直径落在特定细菌发挥耐药机制 （如β -内酰胺酶）的合适范围。
抗菌药物敏感性试验的目的
• 测定细菌对抗菌药物的敏感性 • 地区性耐药监测 • 评价新药的抗菌药效 • 分析医院感染流行株的药敏谱
抗菌药物敏感性试验的指征
当某些致病菌或条件致病菌的药敏特点不能从其 种属特征上了解时，或其药敏结果易变时，这些菌的
临床分离株必须进行药敏试验。如：肠杆菌科的细菌、
革兰阴性葡萄糖非发酵菌、葡萄球菌属和肠球菌属的 细菌等.
抗菌药物的联合药敏试验
• 纸片法联合药敏试验
纸片法联合药敏试验所用的培养基、药敏纸片、菌液 和培养条件等均和纸片法药敏试验相同。将所要试验 的两种药敏纸片邻近贴在涂菌的琼脂平板上，使两纸 片的中心距离恰好等于两药敏纸片单独试验时抑菌圈
的半径之和，按规定条件孵育之后观察抑菌圈的形状
改变，并据此判断两药联合药敏试验的结果
抗菌药物 的敏感性试验
第一节 抗菌药物敏感性试验 的目的及试验指征
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细菌耐药性的生物化学机制
• 抗菌药物渗透障碍
对革兰阴性菌而言，外膜的通透性对药物进 出菌体至关重要。亲水性的药物通道蛋白为 OmpF 、OmpC 和PhoE。抗生素可以直接扩散进 入膜内并到达菌体内相应作用部位 。疏水性越强 的抗生素 、带负电荷越多的抗生素分子 、较大 的药物分子也不易通过 。外膜蛋白的缺失可导致 细菌耐药性的发生 。 细菌的外膜上特殊的药物泵出系统 使菌 体内的药物浓度不足导致耐药 。铜绿假单胞菌外 膜上有一种蛋白OprK，泵出多种抗生素 ，是产 生耐药的重要机制 。
八、肠杆菌科
• 肺炎克雷伯菌的耐药性主要表现在产生 超广谱-内酰胺酶（ESBL）。产ESBL细 菌对青霉素类、第1、2、3代头孢菌素及 单环菌素耐药，仅对头霉素类、碳青霉 烯类及酶抑制剂（克拉维酸）敏感。 ESBL检测现已作为医院细菌室常规检测 项目。
莫西林/克拉维酸、头孢曲松、头孢噻肟、 头孢呋辛、氧氟沙星、万古霉素的敏感率 为95.6%～100% ，85.1%的PRSP株对头孢曲 松敏感。而红霉素、四环素、复方磺胺甲 恶唑的耐药率高达62.9%～77.4%。
三、金黄色葡萄球菌 • 近年来由于抗生素的广泛应用，耐药菌株迅速增 多，尤其是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 （methicillin-resistant S. aureus，MRSA） 已成为医院感染最常见的致病菌。细菌药敏试验 常规首选抗生素为苯唑西林和青霉素；通过药敏 试验可筛选出耐甲氧西林葡萄球菌(methecillin resmtant Staphylococcus，MRS)，该菌株耐所有 青霉素、头孢菌素、碳青霉烯类和β-内酰胺药、 β-内酰胺酶抑制剂类抗生素，同时对氨基糖苷类、 大环内酯类和四环素类抗生素也耐药。
第七节抗菌药物敏感性试验 和细菌耐药性检查
• 抗微生物药物敏感性试验 （antimicrobial susceptibility tet， AST） 是对敏感性不能预测的临床分离菌 株进行药敏试验，以指导临床选择治疗 药物和了解区域或医院内常见病原菌耐 药性变迁，有助于临床经验性治疗选药。
药敏试验用药的选择
细菌耐药性检测方法
• 一、 细菌耐药表型检测 • 二、β -内酰胺酶检测
– 碘淀粉测定法（iodometric test） – 头孢色原菌素纸片法（nitrocefin test）
• 三、 耐药基因检测
一、肺炎链球菌 • 值得注意的是耐青霉素的肺炎链球菌
(penicillin resistant streptococous pneomonia， PRSP)。PRSP占肺炎链球菌13.8%，对策阿
• 联合药物敏感试验意义
• 联合抑菌试验 • 最低杀菌浓度测定
常用敏感性试验的方法
• 监控治疗效果试验：
• 1、血清抗菌药物浓度测定（serum antimicrobial level） • 2、血清抗菌活性测定（serum antimicrobial avtivity）
产生细菌耐药性的主要原因
• （4）U组：仅用于治疗泌尿道感染的抗 菌药物（如呋喃妥因和某些喹诺酮类药 物）和针对一些特定的泌尿道致病菌 （如铜绿假单胞菌）的抗菌药物。
常用敏感性试验的方法
• 预测治疗效果的试验：
• 1、稀释法（minimal inhibitory concentration，MIC） • 2、K-B纸片琼脂扩散法(Kirby-Barer disc agar diffusion method) • 3、E试验（Epsilometer test） • 4、最低杀菌浓度测定（minimal bactericidal concentration，MBC） • 5、联合药敏试验（test of antibiotic combination）
四、铜绿假单胞菌
• 铜绿假单胞菌对多数抗生素不敏感，呈现明显的 固有耐药性。长期以来假单胞菌的固有耐药性认 为是由于该菌具有外膜的低通透性（主要是外膜 微孔蛋白突变，阻止抗生素由外膜进入胞质）， 最近的研究表明，假单胞菌耐药的产生机制与细 菌具有能量依赖性的主动外排系统有关，也可能 同时存在其他耐药机制。由于在长期抗生素治疗 过程中铜绿假单胞菌可能发生耐药，因此，初代 敏感的菌株在治疗3~4周后，测试重复分离株的抗 生素敏感性是必要的。目前，对假单胞菌感染多 采用联合治疗，如选用一种β内酰胺类抗生素与 一种氨基糖苷类或一种喹诺酮类抗菌药物联合。
细菌耐药性的生物化学机制
• 药物作用靶位的改变 通过靶位的改变使抗 生素不易结合，是耐药发生的重要机制。 1.核糖体靶位酶亲和力的改变导致对四环素、 红霉素、喹诺酮、氨基糖苷类、甲氧嘧啶、磺 胺类抗生素耐药 。 2.核糖体位点的改变引起对大环内酯类和林可 霉素类抗生素耐药 。 3. DNA螺旋酶的改变是对喹喏酮类抗生素耐药 的重要机制 。
Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) （National Committee for
Clinical Laboratory Standards，NCCLS）
• 经常更新和发布临床微生物实验室常规药敏试 验的药物选择和报告指南， • 可供我们参考。该指南将抗菌药物分成A、B、 C、U四组（表8-11、12）： • （1）A组：为常规药敏试验的首选药物，其 结果也应常规报告。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
• （2）B组：包含一些临床上重要的特别 针对医院感染的药物，亦可作为首选药 物，但只是选择性地报告给临床，当细 菌对A组同类药物耐药、特定的标本来 源、多种细菌感染、多部位感染等情况 也应报告B组药物的敏感结果。对A组药 过敏、耐受或无效的病例和以流行病学 调查为目的向感染控制部门报告。
• （3）C组：为一些替代性或补充性的抗菌药 物，可在以下情况选择并进行试验：医院内 潜在有对数种基本药物耐药（特别是耐同一 类药物，如β-内酰胺类或氨基苷类）的菌株 的局部流行或广泛流行；治疗对基本药物过 敏的患者；治疗特定致病菌的感染（如选择 氯霉素用于肠道外分离的沙门菌属的感染和 耐万古霉素的肠球菌的感染）和以流行病学 调查为目的向感染控制部门报告。
细菌耐药性的生物化学机制
• 药物作用靶位的改变 4.核酸合成途径中序列靶位酶的改变 对磺胺-甲氧嘧啶 耐药，二氢叶酸还原酶改变致甲氧嘧啶耐药。 5. PBP发生改变 , β-内酰胺类抗生素不能结合或亲和 力降低，则产生耐药，如金黄色葡萄球菌中PBP转变 为PBP2a。大肠埃希菌中PBP3改变，引起对头孢氨苄 和其他头孢抗生素耐药 。 6.肠球菌van基因编码产生肽聚糖上一种前体蛋白，阻 碍万古霉素和肽链间相互作用而导致耐药。
• 药敏试验用药需综合考虑下列因素：①根据本 地致病菌的流行病学和耐药性调查结果，分析 感染常见菌以及它们的耐药模式，选取对当地 流行株敏感的抗菌药物；②不选择细菌所具固 有耐药的抗菌药物如革兰阴性杆菌对万古霉素 固有耐药，革兰阳性球菌对氨曲南固有耐药； ③优先选用高效低毒的抗菌药物；④选用价格 便宜、供应充足的抗菌药物。
抗菌药物的滥用，导致对细菌产生巨大的 选择压力（ selective pressure ），使那 些原来只占极小比例的耐药菌（10-6~109，自发突变频率），迅速繁殖。
动物很可能是一个蓄积耐药细菌，并向 人体传递耐药细菌的储蓄库。
细菌耐药性的生物化学机制
• 灭活酶和钝化酶的产生 1.β-内酰胺酶 水解药物β-内酰胺环使酰胺 键断裂而失去抗菌活性 。 2.氨基糖苷类钝化酶 有3类：乙酰转移酶 (AAC)、磷酸转移酶(APH)、核苷转移酶 (AAD)，分别通过乙酰化作用、磷酸化作用、 核苷化作用灭活此类抗生素。 3.氯霉素乙酰转移酶 4.红霉素酯酶和其他灭活酶