肠出血性大肠杆菌O157∶H7主要保护性抗原单克隆抗体的研制及特性分析

命名为 ? 分别 .个 免 疫 学 上 没 有 交 叉 反 应 的 群 ’ *和 ? . ’ @ A @ A 由噬菌体 _ + + + + * > a和 _ b 编码 7 一株 1 21 3可能只产生 ? @ A .或者两者都产生 ’ ? @ A毒素由 9 和 8.个亚基组成 ’ 9亚 ? @ A 亚基负责毒素的受体结合和免疫原性 基是毒力部分 ’ 7 8 本试验利用表达的紧密素和志贺毒素融合蛋白制备了针 对几种毒力因子的单克隆抗体’ 从而为 1 5 6 % 26的 21 3 4* 检测和防治研究提供了物质基础 7
* 材料与方法
肠出血性大肠杆菌) 5 6 1 21 3/ 4* 为1 同时产生 ? *和 ? .毒 _ + + ’ 21 3国 际 标 准 菌 株 ’ @ A @ A 1 d : 素’ 由本室保存 O 是由 1 5 61 _ + + ) eH * / ’ _ + + 1 21 34* d : @ A d : " c " 缺失 ? 由 本 室 保 存O 菌株 *毒 素 产 生 的 基 因 缺 失 突 变 菌 株 ’ @ A 是 本 室 构 建 的 双 基 因 缺 失 突 变 菌 株’ . 5 ’ 5 6 %26M ; f 4* G IH @ A
第) m卷
第 "期 t # # m !" a ) m ?" a " u v wxyz { | } v c_ ~) n
生 腹 水! 无 菌 抽 出! 取上清分装备 "# # #$ % #&’ ! &’ (离 心 ) ( 用* 腹水用二氧化硅脱脂澄清 ! 辛酸 + 硫酸铵法纯化 * 纯化的腹 水进行效价测定和 , + * , . /0 1 鉴 定 单 抗 特 异性 2 3 2 4 56 ; 7 8 6 9 : < = > 8 表达融合蛋白的重组
" c $ 腹水的制备和纯化 选 P ‘* ,周 龄 . ,U以 上 8 ; 9: 8 < 雌 性小鼠’ 腹腔注射无菌液体石蜡) 只/ , C 5S: ; ’ *周 以 后 腹
-个 只 腔 注射培养的阳性杂交瘤细胞) * E* , ; / ’ * ,w左 右 产
) Q m
中国兽医学报
) # # m年 A月
* ^ 等疾病 ] 7
存7 " c s 免疫原的制备和纯化 挑取表达融合蛋白的重组菌单 菌 落接种于 5S:含抗生素的 : + 6 t 摇床 ) * 5 ,I ; 8培养基中 ’ 振摇培养至 u以* C -时 ’ v 菌种量接种于含 : / 8培 SV J , ,为 , 养基的 . 继续 培 养 至 u为, 加终浓 , ,S:摇瓶中 ’ C D ‘, C ’ , , 用 低 速 冷 冻 离 心 机 +, 度 *SSN ; , , M :B k h = 诱 导 DR以 上 ’ 离心 收 集 菌 体 超 声 破 碎 提 取 包 涵 体 聚 丙 烯 ; * ,SV ’ ’ ’ ’ I SV J J 分 离 蛋 白’ 将电泳后的凝胶浸泡 酰胺凝胶电泳) K / ? d ? k 9= 1 于生理盐水中 ’ 放置 显 色 从 凝 胶 上切下目的蛋白带’ D t .R ’ ] ^ 捣碎 ’ 电洗脱回收蛋白 ’ k 8 ?透析 7 纯 化 的 蛋 白 利 用 双 波 长 紫外分光光度计法测定浓度 7 " c # 动 物 免 疫 取 D只 P周 龄 * PU左 右 雌 性 8 ; 9: 8 <小 鼠’ 首次免疫取纯化的 1 K * ; . T G H @ A 8蛋白 *S:与等量完全弗 氏佐剂乳化’ 每只小鼠腹腔注射乳化抗原 , 首次免疫 C 5S: O 周 后 用 不 完 全 弗 氏 佐 剂 乳 化 抗 原 腹 腔 注 射 进 行 第 + ’ .次 免 疫O 此 后 每 隔 .周 用 不 完 全 弗 氏 佐 剂 乳 化 抗 原 腹 腔 注 射 免 疫 直至 1 *次 ’ 0 * ,, , ,以 上 7 于 融 : B ? 9 检测血清抗体效价达 * 合前 +w 选择血清 抗 体 效 价 最 高 的 小 鼠 腹 腔 注 射 , ’ C DS:无 佐剂抗原加强免疫 7 " c x 间接 y z { | }检 测 方 法 的 建 立 在 酶 标 板 上 作 方 阵 点 样7纯化蛋白抗原横向用包被液 * ,倍 > . ,倍 > 5 ,倍 > * , ,倍 > 每孔 * , ,~ D t过 夜’ + v . , ,倍 稀 释 ’ :包 被 ’ k 8 ?洗 涤 +次 ’ 明胶封闭 *R 洗涤 次 免疫小鼠多抗血清纵向用保温 ’ + 7 k 8 ? 液 * 每孔 * , ,倍 > *, , ,倍 > 5, , ,倍 > * ,, , ,倍 稀 释 ’ , ,~ ’ : 二 抗 用 保 温 液 5, ’ , ,倍 稀 释 的 + 6 t 作 用 *R k 8 ?洗 涤 +次 O 标 记 羊 抗 鼠 抗 体 每 孔 作 用 ’ * , ,~ ’ + 6 t *R ’ : k 8 ?洗 涤 2m k 抗体最佳稀释度 7 D次 ’ 4k d 显色 7 根据反应结果确定抗原 > " c $ 细胞融合及阳性克隆的筛选 细胞融合按常规方法进 行 7 阳性克隆的筛选采用建立的间接 1 用融合蛋 : B ? 9 方法’ 用融合蛋白 白1 K * ; . T G H @ A 8包 被 1 : B ? 9 板 进 行 第 *遍 筛 选 ’ 阳性对照为小鼠多 * ; . ? @ A 8包 被 1 : B ? 9 板 进 行 第 .遍 筛 选 ’ 抗 血清 ’ 阴性对照为 ? 培养上清 以 . ; , ’ u值 ? ; k !" D判定为 利用有限稀释法进行亚克隆 ’ 克隆 + 直至杂交瘤 阳性7 ‘D次 ’ 细胞株分泌抗体稳定 7 " c # 亚类鉴定 进行 7 按鼠源单克隆抗体亚类鉴定试剂盒说明书
大肠杆菌不反应 7 关键词 0 肠出血性大肠杆菌 4* 单克隆抗体 O 紧密素 O 志贺毒素 5 6 %26 O 中图分类号 0 文献标识码 0 文章编号 0 P 5 . C * . O P * , , 5 K D 5 D 5 ) . , , / , + K , . 6 5 K , + ? Q6 9 肠 出 血 性 大 肠 杆 菌 4* 5 6 % 26是 肠 出 血 性 大 肠 杆 菌 的典型菌株 ’ 它主要引起 ) C ’1 / 1 J @ G I N R G SN I I R T U V < W X Y Z [ 21 3 婴幼儿腹泻 > 出血性结肠炎 ) 和溶血性尿路综合征 / ) / 23 2\?
) 结果
^ 3 2 免疫原的制备和纯化 纯化的融合蛋白 1 + D % ) T _ ‘ W X Y C
图 ) 腹水纯化的 , + , . /0 1 结 果 c3低 分 子 量 蛋 白 标 准 d 纯 化 的 腹 水 d ) 3 D " 3 " m纯 化 的 腹 D 3 D 0)未 纯 化 的 腹 水 d @ 0) 水d E 3 " m未纯化的腹水 @
包括由 : 5 6 % 26主 要 的 毒 力 因 子 ’ 4* 1 1致 病 岛 上 G T G 基因编码的紧密素和插入到细菌染色体上的原噬菌体编码的
. ^ 志 贺毒素 ] 紧密素为 _ 是一种肠 7 D, , , ‘_ 6, , ,的外膜蛋白 ’ 细胞粘附因子 ’ 在肠细胞粘附中具有重要作用 7 志贺毒素包含
摘要 0 以基因重组技术构建工程菌株表达肠出血性大肠杆菌 ) / 5 6 %26主要保护性抗原 紧 密 素 和 志 贺 毒 素 的 1 21 3 4* 用纯化的蛋白抗原免疫 8 小鼠 ’ 细胞融合后获得的 +株 融合蛋白 7 融合蛋白采用凝胶分离电洗脱法回收纯化 ’ ; 9: 8 < 杂 交瘤细胞株 * 能分别稳定分泌针对紧密素 > 志贺毒素 ? > + > * * , ’ *和 ? .的单克隆抗体 7+株单抗分别制备 =. 3 8 @ A @ A
+ ^ 不 产 生 紧 密 素 和 志 贺 毒 素] 7表达融合蛋白抗原的重组菌
菌株和抗原
由本 . * ) P 0 0 * ; . / > . * ) P 0 0 K * ; . / ’ 8 : g 1 h. H @ A 8 8 : g 1 h. G T G H @ A 8 D K 5 ^ 室 构建 ] 和 蛋白均以包涵体形式表 7? * ; . K * ; . @ A 8 1 T G H @ A 8 相对分子质量分别为 * 达’ -+ , ,和 D P_ , , 7 培养基> 弗氏佐剂> 杂 " c i 试剂 h ) / ? 8 h I j g @ V < T H GH N jT U T I 鼠源单克隆抗体亚类鉴定试剂盒 > 融合 用 交瘤细胞用培养基 > 丙 烯 酰 胺 等’ 购自 ? 羊抗鼠辣根 , , , / > k 1 =) lFD V U ST公 司 O 过氧化 物 酶 ) 标记的 B 购自北京中杉公 / 2m k U = 酶 标 二 抗’ 购自上海丽珠东风生化 试 剂 公 司O k 9= 1低分子量标准蛋白 ’ 司O 硝酸纤维薄膜 ’ 购自 FR T @ ST J公司 7 小鼠’ 购自卫生部长春生 " c n 实验动物及细胞系 8 ; 9: 8 < 由本所兽医公共卫生实验室保 物制品所 7 . ; ,骨髓瘤细胞 ’ ? k
D % ) a ) Ab % a D "b % ! + , X Y C质 量 浓 度 分 别 为 # R和 # R , , . /0 1 结果证明为均一的蛋白带 U 图D Z *
中国兽医学报
. , , -年 5月
第. -卷