第三章 酶的生物合成 PPT课件
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生物化学 第三章 酶(共65张PPT)
概念: 抑制剂和底物的结构相似，能与底物竞争酶的活性中心,从而阻碍酶底物复合物的形成，使酶的活性降低。
含多条肽链则为寡聚酶，如RNA聚合酶，由4种亚基构成五聚体。
(cofactor)
别构酶(allosteric enzyme):能发生别构效应的酶
9 D-葡萄糖6-磷酸酮醇异构酶 磷酸葡萄糖异构酶
esterase)活性中心丝氨酸残基上的羟基结合，使酶失活。
酶蛋白
酶的磷酸化与脱磷酸化
五、酶原激活
概念
酶原(zymogen)：细胞合成酶蛋白时或者初分 泌时,不具有酶活性的形式
酶原 切除片段 酶
（–）
（+）
酶原激活
本质：一级结构的改变导致构象改变，激活。
胰蛋白酶原的激活过程
六、同工酶
同工酶(isoenzyme)是指催化相同的化学反应， 而酶蛋白的分子结构、理化性质乃至免疫学性质 不同的一组酶。
正协同效应（positive cooperativity） 后续亚基的构象改变增加其对别构效应剂
的亲和力，使效应剂与酶的结合越来越容易。
负协同效应（negative cooperativity） 后续亚基的构象改变降低酶对别构效应剂
的亲和力，使效应剂与酶的结合越来越难。
协同效应
正协同效应的底物浓度-反应速率曲线为S形曲线
/ 即： Vmax = k3 [Et]
Km 和 Vmax 的测定
双倒数作图法 Lineweaver-Burk作图
将米氏方程式两侧取倒数
1/v = Km/Vmax[S] + 1/Vmax = Km/Vmax •1/ [S] + 1/Vmax 以 1/v 对 1/[S] 作图, 得直线图
斜率为 Km/Vmax
含多条肽链则为寡聚酶，如RNA聚合酶，由4种亚基构成五聚体。
(cofactor)
别构酶(allosteric enzyme):能发生别构效应的酶
9 D-葡萄糖6-磷酸酮醇异构酶 磷酸葡萄糖异构酶
esterase)活性中心丝氨酸残基上的羟基结合，使酶失活。
酶蛋白
酶的磷酸化与脱磷酸化
五、酶原激活
概念
酶原(zymogen)：细胞合成酶蛋白时或者初分 泌时,不具有酶活性的形式
酶原 切除片段 酶
（–）
（+）
酶原激活
本质：一级结构的改变导致构象改变，激活。
胰蛋白酶原的激活过程
六、同工酶
同工酶(isoenzyme)是指催化相同的化学反应， 而酶蛋白的分子结构、理化性质乃至免疫学性质 不同的一组酶。
正协同效应（positive cooperativity） 后续亚基的构象改变增加其对别构效应剂
的亲和力，使效应剂与酶的结合越来越容易。
负协同效应（negative cooperativity） 后续亚基的构象改变降低酶对别构效应剂
的亲和力，使效应剂与酶的结合越来越难。
协同效应
正协同效应的底物浓度-反应速率曲线为S形曲线
/ 即： Vmax = k3 [Et]
Km 和 Vmax 的测定
双倒数作图法 Lineweaver-Burk作图
将米氏方程式两侧取倒数
1/v = Km/Vmax[S] + 1/Vmax = Km/Vmax •1/ [S] + 1/Vmax 以 1/v 对 1/[S] 作图, 得直线图
斜率为 Km/Vmax
第三章酶的生产
第三章酶的生产
2023年5月15日星期一
第三章 酶的生产制备
酶的生产方式
1.提取法: 植物、动物、微生物
2.化学合成法
生物合成法： 利用植物、动物、微生物细胞合成。 上个世纪50年代起利用微生物生产酶
。 1949年细菌发酵生产淀粉酶
上个世纪70年代以来利用植物细胞和 动物细胞培养技术生产酶。
木瓜细胞培养生产木瓜蛋白酶和木瓜 凝乳蛋白酶 人黑色素瘤细胞培养生 产血纤维蛋白溶酶原激活剂
34
2.生长偶联型中的特殊形式——中期合成型
酶的合成在细胞生长一段时间后才开始，而在细胞生 长进入平衡期以后，酶的合成也随着停止。 特点：酶的合成受产物的反馈阻遏或分解代谢物阻遏。
所对应的mRNA是不稳定的。
枯草杆菌碱性磷酸酶合成曲线 35
3.部分生长偶联型（又称延续合成型）
酶的合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进入 平衡期后，酶还可以延续合成较长一段时间。 特点：可受诱导，一般不受分解代谢物和产物阻遏。
所对应的mRNA相当稳定。
黑曲霉聚半乳糖醛酸酶合成曲线 36
4. 非生长偶联型（又称滞后合成型）
只有当细胞生长进入平衡期以后，酶才开始合成并 大量积累。许多水解酶的生物合成都属于这一类型。 特点：受分解代谢物的阻遏作用。
所对应的mRNA稳定性高。
黑曲霉酸性蛋白酶合成曲线 37
总结：影响酶生物合成模式的主要因素
②发酵代谢调节：理想诱导物的添加，解除 反馈阻遏和分解代谢物阻遏（难利用的碳 氮源的使用，补料发酵）。
③降低产酶温度。
二、细胞生长动力学
微生物细胞生长的动力学方程：
Monod方程：
S－限制性基质浓度； μm—最大比生长速率； Ks —Monod常数
2023年5月15日星期一
第三章 酶的生产制备
酶的生产方式
1.提取法: 植物、动物、微生物
2.化学合成法
生物合成法： 利用植物、动物、微生物细胞合成。 上个世纪50年代起利用微生物生产酶
。 1949年细菌发酵生产淀粉酶
上个世纪70年代以来利用植物细胞和 动物细胞培养技术生产酶。
木瓜细胞培养生产木瓜蛋白酶和木瓜 凝乳蛋白酶 人黑色素瘤细胞培养生 产血纤维蛋白溶酶原激活剂
34
2.生长偶联型中的特殊形式——中期合成型
酶的合成在细胞生长一段时间后才开始，而在细胞生 长进入平衡期以后，酶的合成也随着停止。 特点：酶的合成受产物的反馈阻遏或分解代谢物阻遏。
所对应的mRNA是不稳定的。
枯草杆菌碱性磷酸酶合成曲线 35
3.部分生长偶联型（又称延续合成型）
酶的合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进入 平衡期后，酶还可以延续合成较长一段时间。 特点：可受诱导，一般不受分解代谢物和产物阻遏。
所对应的mRNA相当稳定。
黑曲霉聚半乳糖醛酸酶合成曲线 36
4. 非生长偶联型（又称滞后合成型）
只有当细胞生长进入平衡期以后，酶才开始合成并 大量积累。许多水解酶的生物合成都属于这一类型。 特点：受分解代谢物的阻遏作用。
所对应的mRNA稳定性高。
黑曲霉酸性蛋白酶合成曲线 37
总结：影响酶生物合成模式的主要因素
②发酵代谢调节：理想诱导物的添加，解除 反馈阻遏和分解代谢物阻遏（难利用的碳 氮源的使用，补料发酵）。
③降低产酶温度。
二、细胞生长动力学
微生物细胞生长的动力学方程：
Monod方程：
S－限制性基质浓度； μm—最大比生长速率； Ks —Monod常数
酶学与酶工程第三章酶生物合成学生
要有黑曲霉、米曲霉、青霉、木霉、根霉、毛霉等。 黑曲霉：黑曲霉，半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，
丛梗孢科，曲霉属真菌中的一个常见种。
酶学与酶工程第三章酶生物合成学生College of Life Sciences
米曲霉：半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，从梗孢科， 曲霉属真菌中的一个常见种。米曲霉菌落生长快， 10d直径达5~6cm，质地疏松，初白色、黄色，后变 为褐色至淡绿褐色。背面无色。分生孢子头放射状， 一直径150~300μm，也有少数为疏松柱状。分生孢 子梗2mm左右。
链霉菌
酶学与酶工程第三章酶生物合成学生College of Life Sciences
3．酵母菌 酵母菌(yeast)是—类单细胞微生物，但不同于细菌，
属于真核微生物。
酿酒酵母 球拟酵母 假丝酵母
拟酵母
酶学与酶工程第三章酶生物合成学生College of Life Sciences
4. 霉菌 霉菌是一类丝状真菌，用于酶的发酵生产的霉菌主
二、产酶微生物的来源
1．土壤中的产酶微生物 2．水体中的产酶微生物 3．空气中的产酶微生物 4．极端环境中的产酶微生物
酶学与酶工程第三章酶生物合成学生College of Life Sciences
三、产酶微生物的分离和筛选
酶学与酶工程第三章酶生物合成学生College of Life Sciences
第三章 酶的生物合成
酶学与酶工程第三章酶生物合成学生
第一节 微生物发酵产酶
微生物发酵产酶的优点： 1）微生物种类繁多； 2) 微生物生长周期短，繁育快； 3) 微生物易改造，可通过多种手段育种。
酶学与酶工程第三章酶生物合成学生College of Sciences
一、产酶微生物的种类 用于酶的生产的细胞必须具备几个条件 (1)酶的产量高 (2) 容易培养和管理 (3) 产酶稳定性好，不易变异退化，不易被感染 (4) 利于酶的分离纯化 (5) 安全可靠，无毒性
丛梗孢科，曲霉属真菌中的一个常见种。
酶学与酶工程第三章酶生物合成学生College of Life Sciences
米曲霉：半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，从梗孢科， 曲霉属真菌中的一个常见种。米曲霉菌落生长快， 10d直径达5~6cm，质地疏松，初白色、黄色，后变 为褐色至淡绿褐色。背面无色。分生孢子头放射状， 一直径150~300μm，也有少数为疏松柱状。分生孢 子梗2mm左右。
链霉菌
酶学与酶工程第三章酶生物合成学生College of Life Sciences
3．酵母菌 酵母菌(yeast)是—类单细胞微生物，但不同于细菌，
属于真核微生物。
酿酒酵母 球拟酵母 假丝酵母
拟酵母
酶学与酶工程第三章酶生物合成学生College of Life Sciences
4. 霉菌 霉菌是一类丝状真菌，用于酶的发酵生产的霉菌主
二、产酶微生物的来源
1．土壤中的产酶微生物 2．水体中的产酶微生物 3．空气中的产酶微生物 4．极端环境中的产酶微生物
酶学与酶工程第三章酶生物合成学生College of Life Sciences
三、产酶微生物的分离和筛选
酶学与酶工程第三章酶生物合成学生College of Life Sciences
第三章 酶的生物合成
酶学与酶工程第三章酶生物合成学生
第一节 微生物发酵产酶
微生物发酵产酶的优点： 1）微生物种类繁多； 2) 微生物生长周期短，繁育快； 3) 微生物易改造，可通过多种手段育种。
酶学与酶工程第三章酶生物合成学生College of Sciences
一、产酶微生物的种类 用于酶的生产的细胞必须具备几个条件 (1)酶的产量高 (2) 容易培养和管理 (3) 产酶稳定性好，不易变异退化，不易被感染 (4) 利于酶的分离纯化 (5) 安全可靠，无毒性
酶的生产方法ppt课件
30
（五）生产种子的制备
生产种子：由原始保藏菌种，经过活化，扩大培养，用 于发酵罐接种的大量菌体。
1、种子制备工艺过程
保藏菌种
活化培养
逐级摇瓶培养
种子罐培养
接种至发酵罐
31
（1 ）菌种活化
目的：保藏的菌种在用于发酵生产之前，必须接 种于新鲜的斜面培养基上，在一定的条件下培养，以 恢复细胞的生命活动能力。
指酶催化反应的产物或代谢途径 的末端产物使该酶的生物合成受到 阻遏的现象。
色氨酸过量时会阻遏催化色氨酸合成的相关酶
A→×E → →→ →B
（2）分解代谢物阻遏（营养源阻遏）
是指某些物质经过分解代谢产生的物质阻 A1
遏其他酶合成的现象。
葡萄糖阻遏ß-半乳糖苷酶的生物合成 果糖阻遏a-淀粉酶的生物合成
B1
原生质体是指除去了细胞壁的微生物细胞或植物细胞。 7
第二节 酶生物合成的基本理论
一、酶生物合成的过程
转录
翻译
DNA
RNA
蛋白质（新生多肽链）
加工
成熟蛋白质（酶）
分泌或定位
胞内
胞外
8
二、酶生物合成的调节
按酶生物合成的速度把细胞中合成的酶分为两类：
组成酶—恒定（速度、浓度）
诱导酶—
(适应型酶、 调节型酶)
3、无机盐：大量元素和微量元素。 基本功能：构成细胞的成分； 构成酶产品的组分； 作为酶的激活剂。
35
4、生长因子
指微生物生长繁殖所必不可缺的微量有机物，主要包括各 种氨基酸、嘌呤或嘧啶、维生素等三类物质。
酶制剂中所用的生长因子，大多是由天然原料提供，如玉 米浆、麦芽汁、豆芽汁、麸皮、米糠、酵母膏等。
玉米粉 8%
（五）生产种子的制备
生产种子：由原始保藏菌种，经过活化，扩大培养，用 于发酵罐接种的大量菌体。
1、种子制备工艺过程
保藏菌种
活化培养
逐级摇瓶培养
种子罐培养
接种至发酵罐
31
（1 ）菌种活化
目的：保藏的菌种在用于发酵生产之前，必须接 种于新鲜的斜面培养基上，在一定的条件下培养，以 恢复细胞的生命活动能力。
指酶催化反应的产物或代谢途径 的末端产物使该酶的生物合成受到 阻遏的现象。
色氨酸过量时会阻遏催化色氨酸合成的相关酶
A→×E → →→ →B
（2）分解代谢物阻遏（营养源阻遏）
是指某些物质经过分解代谢产生的物质阻 A1
遏其他酶合成的现象。
葡萄糖阻遏ß-半乳糖苷酶的生物合成 果糖阻遏a-淀粉酶的生物合成
B1
原生质体是指除去了细胞壁的微生物细胞或植物细胞。 7
第二节 酶生物合成的基本理论
一、酶生物合成的过程
转录
翻译
DNA
RNA
蛋白质（新生多肽链）
加工
成熟蛋白质（酶）
分泌或定位
胞内
胞外
8
二、酶生物合成的调节
按酶生物合成的速度把细胞中合成的酶分为两类：
组成酶—恒定（速度、浓度）
诱导酶—
(适应型酶、 调节型酶)
3、无机盐：大量元素和微量元素。 基本功能：构成细胞的成分； 构成酶产品的组分； 作为酶的激活剂。
35
4、生长因子
指微生物生长繁殖所必不可缺的微量有机物，主要包括各 种氨基酸、嘌呤或嘧啶、维生素等三类物质。
酶制剂中所用的生长因子，大多是由天然原料提供，如玉 米浆、麦芽汁、豆芽汁、麸皮、米糠、酵母膏等。
玉米粉 8%
第三章酶的生物合成法生产
• 10）红曲霉
• 淀粉酶、糖化酶、蛋白酶
• 11）啤酒酵母
• 啤酒和酒类生产 • 转化酶、丙酮酸脱羧酶
• 12假丝酵母
• 脂肪酶、尿酸酶、转化酶、醇脱氢酶
2植物细胞
• 植物细胞培养主要用于:色素、药物、香精 和酶蛋白的生产 • 其中用于产酶的细胞 • 番木瓜细胞------木瓜蛋白酶 • 大蒜细胞----------超氧化物歧化酶 • 胡萝卜细胞-------糖苷酶
•解除反馈阻遏 选育结构类似物抗性突变株 •解除分解代谢物阻遏——选育抗分解代谢阻遏突变株
2. 基因工程育种
（二）条件控制 1. 添加诱导物
酶的底物类似物最有效。
2. 降低阻遏物浓度
除去终产物 产物阻遏 添加阻止产物形成的抑制剂 避免使用葡萄糖 分解代谢物阻遏 避免培养基过于丰富 添加一定量的cAMP
固定化原生质体技术
• 20世纪80年代发展 • 便于胞内酶的分离纯化
微生物酶的类型
1.胞外酶：大多是水解酶（如淀粉酶、蛋白酶、
纤维素酶、果胶酶），是微生物为了利用环境中的 大分子而释放到细胞外的，即使胞外浓度很高，胞 内也能维持较低水平，受到的调节控制少。 2.胞内酶：指合成后仍留在细胞内发挥作用的酶， 酶活性和浓度受到中间产物和终产物的调控。
所需的 酶
分离纯化技术
酶的发酵液
第一节 细胞的选择
• • • • • • 用于酶生产的细胞必须具备条件： 1）酶的产量高； 2）容易培养和管理； 3）产酶稳定性好； 4）利于酶的分离纯化； 5）安全可靠，无毒性。
大多数酶采用微生物发酵生产，部分采用 植物细胞和动物细胞
1产酶微生物
• 利用微生物产酶优势：
4动物细胞培养基
第三章第一节酶生物合成的调节
(4) 各种小分子RNA在分子修饰和代谢调节等方面有重要作用。
转录过程的特点
1、转录的不对称性
反义链 antisense strand（无意义链，负链） 有义链 coding strand（编码链，正链）
2、转录所需酶
转录过程
• 起始位点的识别 recognition • 转录起始 initiation • 链的延伸 elongation • 转录终止 termination • 转录后加工 modification
• 阻遏型操纵子
– 无诱导物——正常表达 – 有诱导物——转录受阻
（2）原核生物中酶生物合成的调节机制
a.分解代谢物阻遏作用 b.酶生物合成的诱导作用 c.酶生物合成的反馈阻遏作用
a.分解实代质谢：物cA阻M遏P通作过用启动基因对 酶生物合成例物：合进葡成行萄糖调阻节遏β控-半制乳糖。苷酶的生
是指容易利用的碳源 经过分解代谢产生的 物质阻遏某些酶（主 要是诱导酶）生物合 成的现象。
• 以mRNA为模板,合成一定结构的多肽链的过程 (翻译)，就是将mRNA分子中的核苷酸排列顺 序转变成蛋白质分子中的氨基酸排列顺序。
蛋白质合成的几个要素-遗传密码， nucleotide triplet codon
• mRNA分子中,每三个相邻的核苷酸组成的三联体代表 某种氨基酸或其它信息，称为密码子或三联密码。
60年代中期，在操纵子中还发现了另一个开关基因，称为启动基因。启 动基因位于操纵基因之前，二者紧密相邻。启动基因由环腺苷酸（cAMP）启 动，而环腺苷酸能被葡萄糖所抑制。这样，葡萄糖便通过抑制环腺苷酸而间 接抑制启动基因，使结构基因失活，停止合成半乳糖苷酶。
由此可知，结构基因同时受两个开关基因——操纵基因与启动基因的调 控。只有当这两个开关都处于开启状态时，结构基因才能活化。当培养基中 同时存在葡萄糖和乳糖时，葡萄糖通过抑制环腺苷酸而间接抑制启动基因， 并进而抑制结构基因，使细菌不产生半乳糖苷酶。这种情况下，细菌便会自 动优先利用葡萄糖，因为葡萄糖果是比乳糖更好的能源。
转录过程的特点
1、转录的不对称性
反义链 antisense strand（无意义链，负链） 有义链 coding strand（编码链，正链）
2、转录所需酶
转录过程
• 起始位点的识别 recognition • 转录起始 initiation • 链的延伸 elongation • 转录终止 termination • 转录后加工 modification
• 阻遏型操纵子
– 无诱导物——正常表达 – 有诱导物——转录受阻
（2）原核生物中酶生物合成的调节机制
a.分解代谢物阻遏作用 b.酶生物合成的诱导作用 c.酶生物合成的反馈阻遏作用
a.分解实代质谢：物cA阻M遏P通作过用启动基因对 酶生物合成例物：合进葡成行萄糖调阻节遏β控-半制乳糖。苷酶的生
是指容易利用的碳源 经过分解代谢产生的 物质阻遏某些酶（主 要是诱导酶）生物合 成的现象。
• 以mRNA为模板,合成一定结构的多肽链的过程 (翻译)，就是将mRNA分子中的核苷酸排列顺 序转变成蛋白质分子中的氨基酸排列顺序。
蛋白质合成的几个要素-遗传密码， nucleotide triplet codon
• mRNA分子中,每三个相邻的核苷酸组成的三联体代表 某种氨基酸或其它信息，称为密码子或三联密码。
60年代中期，在操纵子中还发现了另一个开关基因，称为启动基因。启 动基因位于操纵基因之前，二者紧密相邻。启动基因由环腺苷酸（cAMP）启 动，而环腺苷酸能被葡萄糖所抑制。这样，葡萄糖便通过抑制环腺苷酸而间 接抑制启动基因，使结构基因失活，停止合成半乳糖苷酶。
由此可知，结构基因同时受两个开关基因——操纵基因与启动基因的调 控。只有当这两个开关都处于开启状态时，结构基因才能活化。当培养基中 同时存在葡萄糖和乳糖时，葡萄糖通过抑制环腺苷酸而间接抑制启动基因， 并进而抑制结构基因，使细菌不产生半乳糖苷酶。这种情况下，细菌便会自 动优先利用葡萄糖，因为葡萄糖果是比乳糖更好的能源。
《酶生物合成的调节》课件
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目录
01.
02.
03.
04.
05.
06.
酶具有高效性、专一性和稳 定性等特点
酶是一种生物催化剂，能够 加速生物化学反应的速度
酶在生物体内参与各种代谢过 程，如糖代谢、脂质代谢、蛋
白质代谢等
酶的缺乏或异常会导致代谢 紊乱和疾病发生
转录： DNA模板 链被RNA 聚合酶识 别并转录 成mRNA
酶生物合成调节在药物筛选 中的应用
酶生物合成调节在药物研发 中的作用
酶生物合成调节在药物合成 中的应用
酶生物合成调节在药物代谢 中的应用
酶生物合成调节 在生物制药中的 应用
酶生物合成调节 在生物能源中的 应用
酶生物合成调节 在生物环保中的 应用
酶生物合成调节 在生物农业中的 应用
农业：提高作物产量，改善作物品质 工业：提高生产效率，降低生产成本 环保：减少污染，降低能耗 医药：开发新药，提高药物疗效
翻译效率可以通过翻译起始、延伸和终止来调节
蛋白质稳定性可以通过蛋白质的降解和合成来调节
翻译水平调节在细胞内具有广泛的应用，如细胞分化、细胞周期和应激 反应等
转录后修饰：在 mRNA转录后进行 的修饰，如5'端加 帽、3'端加尾等
修饰类型：包括甲 基化、乙酰化、磷 酸化、泛素化等
பைடு நூலகம்
修饰作用：影响 mRNA的稳定性、 翻译效率和蛋白质 的活性
免疫球蛋白的合成调节实例： 抗体的产生、免疫应答等
基因克隆：通过 PCR技术将目标基 因克隆到载体中
基因表达分析：通 过RT-PCR、 Western blot等技 术分析基因表达情 况
蛋白质纯化：通过 亲和层析、离子交 换等技术纯化目标 蛋白质
目录
01.
02.
03.
04.
05.
06.
酶具有高效性、专一性和稳 定性等特点
酶是一种生物催化剂，能够 加速生物化学反应的速度
酶在生物体内参与各种代谢过 程，如糖代谢、脂质代谢、蛋
白质代谢等
酶的缺乏或异常会导致代谢 紊乱和疾病发生
转录： DNA模板 链被RNA 聚合酶识 别并转录 成mRNA
酶生物合成调节在药物筛选 中的应用
酶生物合成调节在药物研发 中的作用
酶生物合成调节在药物合成 中的应用
酶生物合成调节在药物代谢 中的应用
酶生物合成调节 在生物制药中的 应用
酶生物合成调节 在生物能源中的 应用
酶生物合成调节 在生物环保中的 应用
酶生物合成调节 在生物农业中的 应用
农业：提高作物产量，改善作物品质 工业：提高生产效率，降低生产成本 环保：减少污染，降低能耗 医药：开发新药，提高药物疗效
翻译效率可以通过翻译起始、延伸和终止来调节
蛋白质稳定性可以通过蛋白质的降解和合成来调节
翻译水平调节在细胞内具有广泛的应用，如细胞分化、细胞周期和应激 反应等
转录后修饰：在 mRNA转录后进行 的修饰，如5'端加 帽、3'端加尾等
修饰类型：包括甲 基化、乙酰化、磷 酸化、泛素化等
பைடு நூலகம்
修饰作用：影响 mRNA的稳定性、 翻译效率和蛋白质 的活性
免疫球蛋白的合成调节实例： 抗体的产生、免疫应答等
基因克隆：通过 PCR技术将目标基 因克隆到载体中
基因表达分析：通 过RT-PCR、 Western blot等技 术分析基因表达情 况
蛋白质纯化：通过 亲和层析、离子交 换等技术纯化目标 蛋白质
第三章 酶
第三章酶一名词解释米氏常数（K m值）/ 单体酶（monomeric enzyme）/ 寡聚酶（oligomeric enzyme）/ 多酶体系（multienzyme system）/ 激活剂（activator）/ 抑制剂（inhibitor inhibiton）/ 变构酶（allosteric enzyme）/ 同工酶（isozyme）/ 酶的比活力（enzymatic compare energy）/ 活性中心（active center）①米氏常数（Km值）：酶促反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度。
②单体酶：仅有一个活性中心，由一条或多条共价相连的肽链组成的酶分子。
③寡聚酶：由两个或多个相同或不同亚基组成的酶。
单独的亚基一般无活性。
④多酶体系：多种酶靠非共价键相互嵌合催化连续反应的体系。
⑤激活剂：凡是能提高酶活性、加速酶促反应进行的物质。
⑥抑制剂：能使酶的活性下降而不引起酶蛋白变性的物质。
⑦变构酶：生物体内的一些代谢物可以与酶分子的调节部位进行非共价可逆性结合，改变酶分子构像，进而改变酶的活性。
酶的这种调节作用称为变构调节(allosteric regulation)。
受变构调节的酶称为变构酶。
⑧同工酶：能催化相同的化学反应，但在蛋白质分子的结构、理化性质和生物学性质方面都存在明显差异的一组酶。
⑨酶的比活力：比活力是指每毫克蛋白所具有的酶活力。
单位：U/mg蛋白质⑩活性中心：酶分子中能直接与底物分子结合，并催化底物化学反应的部位。
二英文缩写符号及功能NAD+ / FAD / FH4 / NADP+ / FMN / CoA / ACP / TPP / PLP①NAD+:烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，在氧化还原反应中传递氢原子。
②FAD：黄素腺嘌呤二核苷酸，作为多种氧化还原酶的辅基，起传递氢原子作用。
③FH4：四氢叶酸，是体内一碳单位转移酶系的辅酶。
④NADP+：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，在氧化还原反应中传递氢原子。
生物化学——第三章酶
2）高度专一性
• 酶的专一性 （Specificity）(特异性)
指酶在催化生化反应时对底物的选择性。
3）反应条件温和,对环境变化敏感
• 酶促反应一般在pH 5-8 水溶液中进行，反应温度范
围为20-40C。 • 高温或其它苛刻的物理或化学条件，将引起酶的失活。
4) 酶的催化活力受调控
如抑制剂调节、共价修饰调节、反馈调节、酶原激活 及激素控制等。
结构专一性 键专一
基团专一
1）绝对专一性
（结构专一性）
• 酶对底物的要求非常严格，只作用于一个特定的 底物。这种专一性称为绝对专一性（Absolute specificity)。
• 例：脲酶、
O
2HN-C-NH2
• 精氨酸酶
2)相对专一性(Relative Specificity)
• 酶的作用对象不是一种底物，而是一类化合物或
+ E
酶 与 中 间 产 物
3、决定酶专一性的机制
（a）锁钥学说：认为整个酶分子的天然构象是具有刚
性结构的，酶表面具有特定的形状。酶与底物的结合如
同一把钥匙对一把锁一样
（b）诱导契合学说：
酶表面并没有一种与底物互补的固定形状，但酶的活性 中心具有一定的柔性，两者相遇底物诱导酶构象发生变 化，才形成了互补形状。
(2)酸碱性基团：
CH2 H2N CH2 C
• Asp和Glu的羧基
• Lys的氨基
OH H2N
• Tyr的酚羟基
• His的咪唑基 • Cys的巯基等
活性中心的结构特点
• 只占酶分子总体积的很小一部分 • 具有三维空间结构
• 酶的活性部位和底物的辨认和结合过程，称
为诱导契合（induced-fit）
酶生物合成的基本理论
（1）双链RNA：在某些RNA病毒中，作为遗传信息的载体。
（2）tRNA: 在蛋白质的生物合成过程中，tRNA作为氨基酸载体，并 由其上的反密码子识别mRNA分子上的密码子；
（ 3 ）催化活性 RNA： 属于核酸类酶，在一定条件下，可以催化有关 的生化反应。 （4）sRNA：各种小分子RNA在分子修饰和代谢调节等方面有重要作 用。 （5） mRNA：携带遗传信息，在蛋白质合成时充当模板的RNA。 （ 6 ） rRNA ：是细胞中含量最多的 RNA ，约占 RNA 总量的 82% 。 rRNA单独存在时不执行其功能，它与多种蛋白质结合成核糖体， 作为蛋白质生物合成的“装配机”。
转录过程
起始位点的识别 recognition 转录起始 initiation 链的延伸 elongation 转录终止 termination 转录后加工 modification
2018/11/25
11
湖州师范学院 Ming
RNA合成过程
起始 双链DNA 局部解开 磷酸二酯 键形成
中心法则
Reverse transcription
2018/11/25
4
湖州师范学院 Ming
中心法则
Replication 复制：亲代DNA或RNA在一系列酶的作用下， 生成与亲代相同的子代DNA或RNA的过程。 Transcription 转录：以DNA为模板，按照碱基配对原则将
其所含的遗传信息传给RNA，形成一条与DNA链互补的
2018/11/25 13 湖州师范学院 Ming
转录的主要过程（以大肠杆菌为例）
二、RNA链的延伸 1 、从起始阶段到延伸阶段， RNA 聚合酶 分子的构象发生变化。 2、RNA链的延伸沿着5’至3’的方向进行。 延伸的速率大约为50 nt/s. 3 、 RNA 聚合酶不具有外切核酸酶的活性， 无校对功能， RNA生物合成的差错率为 10-4-10-5，比DNA复制的差错率10-9-10-10 大的多。
（2）tRNA: 在蛋白质的生物合成过程中，tRNA作为氨基酸载体，并 由其上的反密码子识别mRNA分子上的密码子；
（ 3 ）催化活性 RNA： 属于核酸类酶，在一定条件下，可以催化有关 的生化反应。 （4）sRNA：各种小分子RNA在分子修饰和代谢调节等方面有重要作 用。 （5） mRNA：携带遗传信息，在蛋白质合成时充当模板的RNA。 （ 6 ） rRNA ：是细胞中含量最多的 RNA ，约占 RNA 总量的 82% 。 rRNA单独存在时不执行其功能，它与多种蛋白质结合成核糖体， 作为蛋白质生物合成的“装配机”。
转录过程
起始位点的识别 recognition 转录起始 initiation 链的延伸 elongation 转录终止 termination 转录后加工 modification
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RNA合成过程
起始 双链DNA 局部解开 磷酸二酯 键形成
中心法则
Reverse transcription
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中心法则
Replication 复制：亲代DNA或RNA在一系列酶的作用下， 生成与亲代相同的子代DNA或RNA的过程。 Transcription 转录：以DNA为模板，按照碱基配对原则将
其所含的遗传信息传给RNA，形成一条与DNA链互补的
2018/11/25 13 湖州师范学院 Ming
转录的主要过程（以大肠杆菌为例）
二、RNA链的延伸 1 、从起始阶段到延伸阶段， RNA 聚合酶 分子的构象发生变化。 2、RNA链的延伸沿着5’至3’的方向进行。 延伸的速率大约为50 nt/s. 3 、 RNA 聚合酶不具有外切核酸酶的活性， 无校对功能， RNA生物合成的差错率为 10-4-10-5，比DNA复制的差错率10-9-10-10 大的多。
酶生物合成的调节
第三节酶生物合成的调节一、原核生物细胞中酶生物合成的调节二、真核细胞中酶生物合成的调节知识点Review生物中心法则与酶生物合成的关系酶的调节控制转录水平的调控转录产物的加工翻译水平的调节翻译产物的加工调节酶降解的调节细胞内组成型酶和调节型酶组成型合成蛋白质适应型或调节型蛋白质1 组成型酶：(constitutive)每一个生物细胞都可以在一定的条件下，合成几千种酶：有的酶在细胞中的量比较恒定，环境因素对这些酶的合成速率影响不大，这类酶称为~例：DNA聚合酶、RNA聚合酶等。
2 调节型酶：酶在细胞中含量变化较大，即其合成速率明显受到环境因素影响,这类酶称为~例：半乳糖苷酶一、原核生物细胞中酶生物合成的调节•原核基因组的一个典型特征：绝大多数的基因都按照功能的相关性组成基因群首尾连接。
•原核生物中酶生物合成的调节主要是转录水平的调节（transcriptional regulation）。
原核生物细胞转录水平的调节模式1.分解代谢物的阻遏作用2.酶生物合成的诱导作用3.酶生物合成的反馈阻遏作用分解代谢物阻遏作用是指某些物质(主要是指容易利用碳源)经过分解代谢产生的如解代谢物阻遏某些酶(主要是诱导酶)生物合成现象。
(一)分解代谢物的阻遏作用结果：cAMP-CAP复合物浓度随之降低，而启动基因上存在cAMP-CAP复合物的结合位点，这样在低浓度时，会影响到RNA聚合酶与启动子的结合。
酶的生物合成受到阻遏。
(二)酶生物合成的诱导作用Lactose operon操纵子（operon）•Jacob和Monod根据对lac Z,Y,A基因突变体的研究,于1961年提出了操纵子学说。
•其要点是:一个或几个结构基因与一个调节基因和一个操纵位点组成一个转录单元。
这个单元就称其为操纵子。
调节基因产生的阻遏蛋白与操纵位点结合从而阻碍了结构基因转录成为mRNA;而诱导物又可以与阻遏蛋白相结合从而阻止阻遏蛋白与操作子的结合。
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酶工程 Enzyme Engineering
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第三章 酶的生物合成
第一节 产酶微生物概述 第二节 微生物产酶的发酵工艺条件及控制 第三节 植物细胞培养产酶的特性、工艺条件及控制 第四节 动物细胞培养产酶的特性、工艺条件及控制
第一节 产酶微生物概述
一、 微生物产酶的特点 二、 产酶微生物的种类 三、 微生物酶的种类 四、 产酶微生物的来源
一、 微生物产酶的特点
工业生产酶制剂一般都以微生物为主要来源
为什么酶制剂的生产主要以微生物为材料？
(1) 微生物种类多，酶种丰富，且菌株易诱变，菌种多样 (2) 微生物生长繁殖快，酶易提取，特别是胞外酶 (3) 来源广泛，价格便宜 (4) 微生物易得，生长周期短 (5) 可以利用以基因工程为主的分子生物学技术，选育和改造
橘青霉 (P. citrinum)
(5) 犁头霉(Absidia)
葡萄糖氧化酶
葡萄糖氧化酶，中性、碱性蛋白酶和青霉素V酰化酶 5’-磷酸二脂酶(水解RNA，生产4种5’-单核苷酸，肌苷酸和鸟苷
酸)，脂肪酶，凝乳酶和真菌细胞壁溶解酶等
蓝色犁头霉 (A. coerulea)
糖化酶
李克犁头霉 (A. lichtheimi)
绿色木霉 (T. viride)
康氏木霉 (T. Koningii)
酶及功能
生产淀粉糖化酶、脂肪酶 生产果胶酶 生产酸性蛋白酶、 α-半乳糖苷酶等
产纤维素酶(C1、Cx酶)、纤维二糖酶、淀粉酶、乳糖酶、真菌细胞 壁溶解酶、青霉素V酰化酶等
4、 霉菌
菌种
(3) 毛霉(Mucor)
微小毛霉 (M.pusillus) 灰蓝毛霉 (M. griseo-cyanus) 刺状毛霉 (M. spinosa) 爪哇毛霉 (M. javanicus) 高大毛霉 (M.mucedo)
酶及功能
α-淀粉酶，蛋白酶，青霉素酶，溶菌酶 5’-磷酸二酯酶，用于水解RNA，生产核苷酸和核苷等 纳豆激酶，溶解血栓，抑制金黄色葡萄球菌、大肠埃氏菌O157菌株
及沙门氏菌的作用 α-半乳糖苷酶，青霉素酶等
异构酶，溶菌酶等
环糊精葡基转移酶(用于由淀粉生产环状糊精)，丁酰苷酶A、B等
头孢菌素酰化酶(用于酶法半合成生产各种头孢菌素衍生物，如先 锋毒素Ⅰ－Ⅴ等)
假单胞菌属 (Pseudomonas Migula)
β-酪氨酸酶，用于合成L-多巴，治疗帕金森病 葡萄糖异构酶，溶菌酶，青霉素G酰化酶，脂肪酶
1、 细菌
菌种 (2) 芽孢杆菌
枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)
嗜热脂肪芽孢杆菌 (B. stearothermophilus)
果糖芽孢杆菌 (B. fructosus) 环状芽孢杆菌 (B. circulans) 巨大芽孢杆菌 (B. megaterium)
弗氏链霉菌 (S. fradiae )
葡萄糖异构酶 葡萄糖异构酶，溶菌酶 葡萄糖异构酶，溶菌酶 葡萄糖异构酶 产生角蛋白酶
ห้องสมุดไป่ตู้
酶及功能
2、 放线菌
菌种
(1) 链霉菌属
(Streptomyces)
密执安链霉菌 (S. michiganensisi)
金色链霉菌 (S. aureus) 淡紫灰叶链霉菌 (S. lavendulae)
菌种，增加产酶率和开发新酶种
二、 产酶微生物的种类
1、 细菌 2、 放线菌 3、 酵母菌 4、 霉菌
1、 细菌
菌种
(1) 无芽孢杆菌
大肠埃希氏菌属 (Escherichia)
酶及功能
天门冬酰氨酶，抗肿瘤，治疗白血病 青霉素酰化酶，制备6-APA母核，生产半合成青霉素 酰基转移酶，拆分DL-氨基酸，制备L-氨基酸 溶菌酶，用于消炎、抗菌等 谷氨酸脱羧酶，在味精工业中用于谷氨酸的定量分析
(2) 诺卡氏菌属
(Ncardia)
酶及功能
产生抗胰酶，可抑制食道癌和乳腺癌的发生，抑制烧伤疼痛和水泡 形成等
产生青霉素V酰化酶
产生单加氧酶，双加氧酶(用于烃类、氰、腈类物质的降解)
3、 酵母菌
菌种
酶及功能
酿酒酵母(S. cerevisiae) 球拟酵母属(Torulopsis)
又称啤酒酵母，是糖酵母属中最主要的酵母种，也是发酵工业上最 常用、最重要的菌种之一，用于生产凝血激酶、尿激酶等药用酶
生产酪氨酸脱羧酶、链激酶、链道酶、双链酶等(有溶解血栓、血 块，加速伤口愈合等作用)
产生葡萄糖异构酶
2、 放线菌
菌种
(1) 链霉菌属
(Streptomyces)
委内瑞拉链霉菌 (S. venezulae)
灰色链霉菌 (S. griseus) 白色链霉菌 (S. albus)
不产色素链霉菌 (S. achromogenes)
制取青霉素酰化酶，谷氨酸脱羧酶和酸性蛋白酶等
假丝酵母属(Candida)
产生单加氧酶，双加氧酶，用于烃类等石油产品的降解
4、 霉菌
菌种
(1) 根霉(Rhizopus)
少根根霉 (R.arrhizus) 代氏根霉 (R. delemar) 匍枝根霉 (R. stolonifer) 其它
(2) 木霉
(Trichoderma)
1、 细菌
菌种
(3) 球菌
微球菌属(Micrococcus) 溶壁微球菌
(M. lysodeikticus) 玫瑰色微球菌 (M. roseus)
酶及功能
用于生产青霉素酰化酶和溶壁酶等多种酶类
链球菌属 (Streptococcus)
β-溶血性链球菌 (S. β-hemolyticus)
明串珠菌属 (Leuconostoc)
总状毛霉 (M.racemosus)
酶及功能
凝乳酶 果胶酶 产生用于腐乳发酵的蛋白酶和淀粉糖化酶等(高大毛霉还可产脂肪
酶)
4、 霉菌
菌种
酶及功能
(4) 青霉(Penicillium)
点青霉 (P. notatum) 产紫青霉 (P. ururogenum)
产黄青霉 (P. chrysogenum)
α-半乳糖苷酶
4、 霉菌
菌种
(6) 曲霉
(Aspergillus)
黑曲霉 (A. niger) 黄曲霉 (A. flavus) 米曲霉 (A. oryzae) 栖土曲霉 (A. terricola) 亮白曲霉 (A. candidus)
黄柄曲霉 (A. flacipes)
酶及功能
淀粉酶，蛋白酶，果胶酶葡萄糖氧化酶等 蛋白酶， 果胶酶等 蛋白酶，果胶酶等 蛋白酶 葡萄糖氧化酶 葡萄糖氧化酶
退出
第三章 酶的生物合成
第一节 产酶微生物概述 第二节 微生物产酶的发酵工艺条件及控制 第三节 植物细胞培养产酶的特性、工艺条件及控制 第四节 动物细胞培养产酶的特性、工艺条件及控制
第一节 产酶微生物概述
一、 微生物产酶的特点 二、 产酶微生物的种类 三、 微生物酶的种类 四、 产酶微生物的来源
一、 微生物产酶的特点
工业生产酶制剂一般都以微生物为主要来源
为什么酶制剂的生产主要以微生物为材料？
(1) 微生物种类多，酶种丰富，且菌株易诱变，菌种多样 (2) 微生物生长繁殖快，酶易提取，特别是胞外酶 (3) 来源广泛，价格便宜 (4) 微生物易得，生长周期短 (5) 可以利用以基因工程为主的分子生物学技术，选育和改造
橘青霉 (P. citrinum)
(5) 犁头霉(Absidia)
葡萄糖氧化酶
葡萄糖氧化酶，中性、碱性蛋白酶和青霉素V酰化酶 5’-磷酸二脂酶(水解RNA，生产4种5’-单核苷酸，肌苷酸和鸟苷
酸)，脂肪酶，凝乳酶和真菌细胞壁溶解酶等
蓝色犁头霉 (A. coerulea)
糖化酶
李克犁头霉 (A. lichtheimi)
绿色木霉 (T. viride)
康氏木霉 (T. Koningii)
酶及功能
生产淀粉糖化酶、脂肪酶 生产果胶酶 生产酸性蛋白酶、 α-半乳糖苷酶等
产纤维素酶(C1、Cx酶)、纤维二糖酶、淀粉酶、乳糖酶、真菌细胞 壁溶解酶、青霉素V酰化酶等
4、 霉菌
菌种
(3) 毛霉(Mucor)
微小毛霉 (M.pusillus) 灰蓝毛霉 (M. griseo-cyanus) 刺状毛霉 (M. spinosa) 爪哇毛霉 (M. javanicus) 高大毛霉 (M.mucedo)
酶及功能
α-淀粉酶，蛋白酶，青霉素酶，溶菌酶 5’-磷酸二酯酶，用于水解RNA，生产核苷酸和核苷等 纳豆激酶，溶解血栓，抑制金黄色葡萄球菌、大肠埃氏菌O157菌株
及沙门氏菌的作用 α-半乳糖苷酶，青霉素酶等
异构酶，溶菌酶等
环糊精葡基转移酶(用于由淀粉生产环状糊精)，丁酰苷酶A、B等
头孢菌素酰化酶(用于酶法半合成生产各种头孢菌素衍生物，如先 锋毒素Ⅰ－Ⅴ等)
假单胞菌属 (Pseudomonas Migula)
β-酪氨酸酶，用于合成L-多巴，治疗帕金森病 葡萄糖异构酶，溶菌酶，青霉素G酰化酶，脂肪酶
1、 细菌
菌种 (2) 芽孢杆菌
枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)
嗜热脂肪芽孢杆菌 (B. stearothermophilus)
果糖芽孢杆菌 (B. fructosus) 环状芽孢杆菌 (B. circulans) 巨大芽孢杆菌 (B. megaterium)
弗氏链霉菌 (S. fradiae )
葡萄糖异构酶 葡萄糖异构酶，溶菌酶 葡萄糖异构酶，溶菌酶 葡萄糖异构酶 产生角蛋白酶
ห้องสมุดไป่ตู้
酶及功能
2、 放线菌
菌种
(1) 链霉菌属
(Streptomyces)
密执安链霉菌 (S. michiganensisi)
金色链霉菌 (S. aureus) 淡紫灰叶链霉菌 (S. lavendulae)
菌种，增加产酶率和开发新酶种
二、 产酶微生物的种类
1、 细菌 2、 放线菌 3、 酵母菌 4、 霉菌
1、 细菌
菌种
(1) 无芽孢杆菌
大肠埃希氏菌属 (Escherichia)
酶及功能
天门冬酰氨酶，抗肿瘤，治疗白血病 青霉素酰化酶，制备6-APA母核，生产半合成青霉素 酰基转移酶，拆分DL-氨基酸，制备L-氨基酸 溶菌酶，用于消炎、抗菌等 谷氨酸脱羧酶，在味精工业中用于谷氨酸的定量分析
(2) 诺卡氏菌属
(Ncardia)
酶及功能
产生抗胰酶，可抑制食道癌和乳腺癌的发生，抑制烧伤疼痛和水泡 形成等
产生青霉素V酰化酶
产生单加氧酶，双加氧酶(用于烃类、氰、腈类物质的降解)
3、 酵母菌
菌种
酶及功能
酿酒酵母(S. cerevisiae) 球拟酵母属(Torulopsis)
又称啤酒酵母，是糖酵母属中最主要的酵母种，也是发酵工业上最 常用、最重要的菌种之一，用于生产凝血激酶、尿激酶等药用酶
生产酪氨酸脱羧酶、链激酶、链道酶、双链酶等(有溶解血栓、血 块，加速伤口愈合等作用)
产生葡萄糖异构酶
2、 放线菌
菌种
(1) 链霉菌属
(Streptomyces)
委内瑞拉链霉菌 (S. venezulae)
灰色链霉菌 (S. griseus) 白色链霉菌 (S. albus)
不产色素链霉菌 (S. achromogenes)
制取青霉素酰化酶，谷氨酸脱羧酶和酸性蛋白酶等
假丝酵母属(Candida)
产生单加氧酶，双加氧酶，用于烃类等石油产品的降解
4、 霉菌
菌种
(1) 根霉(Rhizopus)
少根根霉 (R.arrhizus) 代氏根霉 (R. delemar) 匍枝根霉 (R. stolonifer) 其它
(2) 木霉
(Trichoderma)
1、 细菌
菌种
(3) 球菌
微球菌属(Micrococcus) 溶壁微球菌
(M. lysodeikticus) 玫瑰色微球菌 (M. roseus)
酶及功能
用于生产青霉素酰化酶和溶壁酶等多种酶类
链球菌属 (Streptococcus)
β-溶血性链球菌 (S. β-hemolyticus)
明串珠菌属 (Leuconostoc)
总状毛霉 (M.racemosus)
酶及功能
凝乳酶 果胶酶 产生用于腐乳发酵的蛋白酶和淀粉糖化酶等(高大毛霉还可产脂肪
酶)
4、 霉菌
菌种
酶及功能
(4) 青霉(Penicillium)
点青霉 (P. notatum) 产紫青霉 (P. ururogenum)
产黄青霉 (P. chrysogenum)
α-半乳糖苷酶
4、 霉菌
菌种
(6) 曲霉
(Aspergillus)
黑曲霉 (A. niger) 黄曲霉 (A. flavus) 米曲霉 (A. oryzae) 栖土曲霉 (A. terricola) 亮白曲霉 (A. candidus)
黄柄曲霉 (A. flacipes)
酶及功能
淀粉酶，蛋白酶，果胶酶葡萄糖氧化酶等 蛋白酶， 果胶酶等 蛋白酶，果胶酶等 蛋白酶 葡萄糖氧化酶 葡萄糖氧化酶