第3章 DNA的复制

DNA聚合酶催化的链延长反应
3´ 5´ 5´
3´
3´
3´
5´
3´
5´ 5´
模板链
RNA引物
5´
子链
3´
DNA聚合酶(DNA Polymerase)
共同性质
[1] 以脱氧核苷酸三磷酸 (dNTP) 为前体催化合成 DNA;
[2]需要模板和引物的存在; [3]不能起始合成新的DNA链; [4]催化dNTP加到生长中的DNA链的3'-OH末端; [5]催化DNA合成的方向是5'→3'。
思考

楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国
遗传信息传递的 中心法则
生物的遗传信息以密码的形式储 存在DNA分子上，表现为特定的核苷 酸排列顺序。在细胞分裂的过程中， 通过DNA复制把亲代细胞所含的遗传 信息忠实地传递给两个子代细胞。在 子代细胞的生长发育过程中，这些遗 传信息通过转录传递给 RNA ，再由 RNA通过翻译转变成相应的蛋白质多 肽链上的氨基酸排列顺序，由蛋白质 执行各种各样的生物学功能，使后代 表现出与亲代相似的遗传特征。后来 人们又发现，在宿主细胞中一些RNA 病毒能以自己的RNA为模板复制出新 的病毒RNA，还有一些RNA病毒能以 其RNA为模板合成DNA，称为逆转录 这是中心法则的补充。
第三章 DNA的复制
本章重点介绍遗传中心法则和 DNA 的半 保留复制以及逆转录的过程和机理，对DNA 的损伤和修复、突变和重组作一般介绍。
DNA 是绝大多数生物体遗传信息的载体，继 1953年Watson & Crick提出DNA双螺旋结构模型 后， 1958 年， Crick 提出了‚中心法则‛ (Central dogma)揭示了遗传信息的传递规律。
楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国
单链DNA结合蛋白(SSBP)
螺旋酶沿复制叉方向向前推进产生了一段单链区，但是这种单链 DNA不会长久存在，会很快重新配对形成双链 DNA或被核酸酶降解 。在细胞内有大量单链DNA结合蛋白能很快地和单链DNA结合，防 止其重新配对形成双链 DNA或被核酸酶降解。一个SSBP四聚体结 合于单链DNA上可以促进其他SSBP四聚体现相邻的单链DNA结合， 这个过程称为协同结合 (cooperative binding)，SSBP结合到单 链DNA上后，使其呈伸展状态，没有弯曲和结节，有利于单链DNA 作为模板。SSBP 可以重复使用，当新生的DNA链合成到某一位置 时，该处的SSBP便会脱落，并被重复利用。
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[2]3'→5'外切酶活性──校对作用
这种酶活性的主要功能是从3'→5'方向识别和切除 不配对的DNA生长链末端的核苷酸。
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[3]5'→3'外切酶活性──切除修复作用 从5’→3’方向水解 DNA生长链前方的 DNA链，主 要产生5’-脱氧核苷酸。这种酶活性只对DNA上配对 部分(双链)磷酸二酯键有切割活力作用。每次能切除 10个核苷酸，而且DNA的聚合作用能刺激5'→3'外切 酶活力达 10 倍以上。因此，这种酶活性在 DNA 损伤 的修复中可能起着重要作用。对冈崎片段5'末端DNA 引物的去除依赖此种外切酶活性。
螺旋酶（helicase）可以促使DNA在复制叉处打 开双链。螺旋酶可以和单链 DNA 结合，并且与 ATP 结合，利用 ATP 分解成 ADP 时产生的能量沿 DNA 链向前运动促使 DNA 双链打开。目前，大肠 杆菌中发现有两种螺旋酶参与这个过程，一种 称为螺旋酶Ⅱ或螺旋酶Ⅲ，与前导链的模板DNA 结合沿 5 '→ 3' 方向运动 ; 第二种称为 Rep 蛋白， 和前导链的模板DNA结合沿3'→5'方向运动。
DNA PolⅠ在空间结构上近似球体，直径约6.5 nm。 在酶的纵轴上有一个约 20A 的深沟 (cleft) ，带有正电 荷，这是该酶的活性中心位置，在此位置上至少有 6 个结合位点: [1] 模板DNA结合位点; [2] DNA生长链 或引物结合位点; [3] 引物末端结合位点，用以专一引 物或DNA生长链的3'-OH; [4] 脱氧核苷三磷酸结合位 点; [5] 5'→3'外切酶活性位点，用以结合生长链前方 的5'-端脱氧核苷酸并切除之; [6] 3'→5'外切酶活性位 点，用以结合和切除生长链上未配对的
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(3)该酶对作用底物的选择性较强，一般只能将2
－脱氧核苷酸掺入到DNA链中。
(4)该酶不是复制的主要聚合酶，因为此酶缺陷的
大肠杆菌突变株的DNA复制都正常。可能在DNA
的损伤修复中该酶起到一定的作用。
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大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ
这是1956年由Arthur Kornberg 首先发现的 DNA 聚合 酶，又称Kornberg酶。此酶研 究得清楚而且代表了其他 DNA 聚合酶的基本特点。
DNA的损伤与修复
DNA突变 DNA的遗传重组
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DNA生物合成有两种方式
1. DNA的复制（DNA指导下的DNA合成）
DNA体内复制：原核、真核生物的染色体、细菌质 粒（环状，双链）、真核细胞器DNA（线粒体、叶 绿体）、病毒（双链，环状） DNA的体外复制：分子克隆。
[1]聚合作用 在引物 RNA3'-OH 末端，以 dNTP 为底物，按模板 DNA上的指令由DNA polⅠ逐个将核苷酸加上去， 就是 DNA polⅠ的聚合作用。酶的专一性主要表现 为新进入的脱氧核苷酸必须与模板 DNA配对时才有 催化作用。dNTP进入结合位点后，可能使酶的构象 发生变化，促进3'-OH与5'-PO4结合生成磷酸二酯键 。若是错误的核苷酸进入结合位点，则不能与模板 配对，无法改变酶的构象而被 3'-5'外切酶活性位点 所识别并切除之。
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大肠杆菌三种DNA聚合酶比较
比较项目 分子量 每个细胞的分子统计数
DNA DNA DNA 聚合酶Ⅰ 聚合酶Ⅱ 聚合酶Ⅲ
109，000 400 120，000 400，000 100 10-20
5´-3 ´聚合酶作用
3´-5 ´核酸外切酶作用 5´-3 ´核酸外切酶作用 转化率 功能
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DNA在细胞内往往以超螺旋状态存在， DNA 拓扑酶催化同一 DNA 分子不同超螺 旋状态之间的转变。DNA拓扑异构酶有 两类，大肠杆菌的ε蛋白(MW-110000) 就是一种典型的拓扑异构酶Ⅰ.它的作 用是暂时切断一条DNA链，形成酶-DNA 共价中间物而使超螺旋 DNA松弛化，然 后再将切断的单链 DNA连接起来，而不 需要任何辅助因子。而大肠杆菌中的 DNA旋转酶(DNA gyrase)则是典型的拓 扑异构酶Ⅱ，能将负超螺旋引入DNA分 子，该酶能暂时性地切断和重新连接 双链DNA，同时需要ATP水解为ADP以供 能。
DNA聚 合酶III DNA聚 合酶I
5´
3´
解旋酶 解链酶 引物酶和 引发体
SSB
RNA引物
3´ 5´ RNA
引物
3´
5´
大肠杆菌的引物酶也是 DNA 复制所必需的一种酶。 该酶由一条多肽链组成， MW为 60 KD ，每个细胞中 有50-100个分子由大肠杆菌的dnaG基因编码。引物 酶催化引物RNA分子的合成，但它和传统的RNA聚合 酶不一样。[1]引物酶对雷米封不敏感，而RNA聚合 酶则敏感 ;[2] 引物酶既可以利用核糖核苷酸，而 RNA 聚合酶只能利用核糖核苷酸 ;[3]引物酶只在复 制起点处合成 RNA 引物而引发 DNA 的复制，而RNA 聚 合酶则是启动 DNA 转录合成 RNA 从而将遗传信息由 DNA 传递到 RNA 。但在单链噬菌体 M13DNA 和质粒 Co1E1DNA 复制时，引物的合成是由 RNA 聚合酶催化 的。噬菌体 T7的Gene4 蛋白，T4 的Gene41和61蛋白 等也具有引物酶的活性和具有大肠杆菌引物酶相似 的功能。
复制
DNA
转录 逆转录 RNA 复制 蛋白质
翻译ห้องสมุดไป่ตู้
中心法则总结了生物体内遗传信息的流动规律，揭示遗传的分子基础，不仅使人 们对细胞的生长、发育、遗传、变异等生命现象有了更深刻的认识，而且以这方面的 理论和技术为基础发展了基因工程，给人类的生产和生活带来了深刻的革命。
目
第一节
录
DNA生物合成
第二节
第三节 第四节
大肠杆菌DNA聚合酶Ⅱ(DNApolⅡ)
1970年发现了DNA pol Ⅱ。此酶MW为120 KD，每 个细胞内约有100个酶分子，但活性只有DNA polⅠ 的5%。
(1) 聚合作用 : 该酶催化 DNA 的聚合，但是对模板 有特殊的要求。该酶的最适模板是双链 DNA 而中间 有空隙(gap)的单链DNA部份，而且该单链空隙部份 不长于100个核苷酸。对于较长的单链DNA模板区该 酶的聚合活性很低。 (2)该酶具有 3 '→5' 外切酶活性，但无 5 '→3' 外切 酶活性。
DNA的半保留复制可以说明 DNA在代谢上
的稳定性。经过多代复制， DNA 的多核苷
酸链仍可以保持完整，并存在于后代而不
被分解掉。
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范树国
DNA的半保留复制实验依据
1958年Meselson & stahl用同位素示踪标记加密度梯度离心技术实验,
证明了DNA是采取半保留的方式进行复制.
楚雄师范学院化学与生命科学系
范树国
复制中的大肠杆菌染色体放射自显影图 (Cairns实验)