凝胶过滤层析分离纯化纤维素酶的研究_王玢
凝胶过滤及离子交换层析介质详解
温度对分离效果也有一 定影响，可以通过控制 实验温度来优化分离效 果。
案例分享：成功应用案例剖析
案例一
使用琼脂糖凝胶成功分离大分子蛋白质混合物，通过优化流动相和洗脱条件，实现了高 纯度蛋白质的获取。
案例二
应用离子交换层析技术成功分离了复杂样品中的痕量金属离子，通过选择合适的离子交 换树脂和优化实验条件，提高了分离效果和检测灵敏度。
现状
目前，凝胶过滤层析介质已经广泛应用于生物大分子的分离纯化，如蛋白质、酶、多糖等。同时，随着技术的不 断进步，新型凝胶过滤层析介质不断涌现，为生物分离领域提供了更多的选择。
应用领域与前景
要点一
应用领域
凝胶过滤层析介质在生物医药、生物工程、食品科学等领 域具有广泛的应用。例如，在生物医药领域，可用于药物 的分离纯化、蛋白质组学研究、抗体药物研发等；在生物 工程领域，可用于基因工程产物的分离纯化、酶工程产物 的分离纯化等；在食品科学领域，可用于食品添加剂的分 离纯化、功能性食品的研发等。
对未来发展趋势进行预测
层析技术的创新与应用拓展
随着科学技术的不断发展，层析技术将继续创新并拓展应用领域。例如，开发新型高效层析介质、优化层析条件、提 高分离效率等。
与其他技术的联合应用
层析技术可以与多种其他技术联合应用，如质谱、光谱等，实现复杂样品的高效分离和检测。这种联合应用将在未来 得到更广泛的关注和应用。
在生物医药等领域的应用前景
生物医药等领域对高纯度、高活性物质的需求不断增加，层析技术作为一种重要的分离纯化方法，将在 这些领域发挥越来越重要的作用。
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03
离子交换层析介质
根据目标离子的电荷性质和大小，选择合适的离子交换树脂，如阳离子
应用凝胶过滤层析方法分离纯化蚓激酶
【实验方法】 1 凝胶的装填： 〔1〕凝胶的溶胀：凝胶是脱水的干粉，在 使用前需要溶胀。 ①1份凝胶加10份的缓冲液，原则上应将凝 胶颗粒放入洗脱缓冲液中。 ②在摇床上或手动搅拌混合。 ③自然溶胀需要24小时至数天，为了加速 溶胀，可用热法溶胀，1-2小时即可完成。 ④为了防止气泡影响层析，需用水泵或真 空泵对凝胶浆抽气1小时。
【实验方法】
1 离子交换介质： 选用Hitrap DEAE-Sepharose FF 阴离子交换层 析柱。蚓激酶的PI为3.5-4.0，洗脱缓冲液为 pH7.5，此时PI<pH,目的蛋白带负电荷，故选 择阴离子交换介质。 2 洗脱缓冲液的选择：选用起始洗脱液为0.05M Tris-HCl pH7.5。洗脱液的离子强度及pH可根 据具体实验情况而定。一般情况下，起始缓冲 液的离子强度应高于10-20mmol/L。 3 样品的准备：称取30mg蚓激酶用起始洗脱液 1.5ml溶解配制成20mg/ml溶液。10000g/5min 离心或0.22um膜过滤除去杂质，取上清进样。
3 洗脱： 洗脱缓冲液: 0.05mol/L Tris-HCl , 0.2mol/L NaCl , pH7.5 注:选择的缓冲液应该有利于蛋白质活性的保持 并可防止非特异的蛋白质之间或蛋白质与凝胶 之间的相互作用。一般低离子强度的盐溶液（ 20-100mmol/L）, 足以阻断非特异的离子间相 互作用。通常用泵控制 流速，使用泵的压力不 要超过凝胶的耐受程度，低流速可提高蛋白峰 的分辨力。设定流速为20ml/小时。
Байду номын сангаас
【实验材料】 0.05mol/L Tris-HCl 0.2mol/L NaCl pH7.5 、 SephadexG-75、 20%乙醇、 蚓激酶粗提物、 蓝聚糖2000、 AKTA purifier层析系统、 层析柱〔1×40cm〕、 高速离心机、 电子天平、 玻璃滤器、 1ml一次性注射器、 2mlEppendorf管、 冲洗瓶、 一次性滤器
里氏木霉产纤维素酶分离纯化工艺研究
里氏木霉产纤维素酶分离纯化工艺研究发布时间：2021-11-11T06:46:02.936Z 来源：《中国科技人才》2021年第22期作者：侯龙龙谢军任晓辉白冠章[导读] 目前，世界各国都在积极研究利用非粮发酵手段生产生物燃料，用以解决日益严重的能源危机、气候问题以及粮食短缺问题。
义马煤业集团煤生化高科技工程有限公司河南省三门峡市 472300摘要：目前，世界各国都在积极研究利用非粮发酵手段生产生物燃料，用以解决日益严重的能源危机、气候问题以及粮食短缺问题。
木质纤维素作为地球上储量最丰富的多糖类物质，利用其生产燃料乙醇已成为各国研究的热点领域。
但由于木质纤维素结构致密复杂，大多数微生物并不能将其作为直接碳源来生产乙醇，只有将其水解成可发酵单糖类物质后，才能被微生物利用。
酶解法由于其反应条件温和、效率高、能耗低、选择性强以及环保效果好等优点，被广泛应用于纤维素水解过程中。
但由于纤维素酶的酶组分多体系，底物结构较为复杂，加大了从发酵液中分离提取较高纯度的纤维素酶的难度，目前文献报道的纤维素酶提取工艺大多是为了获得纯纤维素酶组分并进行酶学性质的研究，其工艺很难在工业中进行应用。
关键词：纤维素酶；分离提取工艺；盐析；膜分离；色谱层析前言：在传统的酶粗提方法中，盐析法过程温和，不会使酶分子发生变性，硫酸铵由于其具有较强的盐析能力、较高的水溶性以及较低的温度系数，因此在蛋白质及酶的盐析过程中常被使用。
陈红漫等在芽孢杆菌-葡萄糖苷酶的分离纯化及特性的研究中采用硫酸铵分级沉淀法对粗酶液分离纯化，结果显示在硫酸铵饱和度区间为20%-60%时，经硫酸铵沉淀后，酶纯化倍数为1.42,回收率为11.41 %。
但盐析过程适合小规模酶的分离提取过程，而当生产规模较大时，由于需要大量的无机盐，会对后续环保处理带来较大压力；而膜分离过程不需要添加化学试剂，而且整个过程温和，不会造成酶分子的变性失活，当然，膜分离过程也存在投资成本偏高，膜易堵塞等问题。
纤维素酶的生产工艺及分离提纯
纤维素酶的生产工艺及分富提纯:来帅艸学号：4 3晓三连通信工程摘要：纤维素酶是一种重要的酶产洗，是一种复合酶，主要由外切（3-葡聚糖酶、切卩■葡聚毎酶和B •葡萄热苜酶等组成，还有很需话力的木聚糖酶。
由于纤维素酶亦饲料、酒精、纺织和食品等领域具有巨丸的市场潜力，己菠国外业人士看好，将是继糖化酶、淀粉酶和蛋勺酶之后的第四大工业酶种，甚至亦中国完全有可能成为第一大酶种，因此纤维素酶是酶制剂工业中的一个新的增长点。
是可以将•纤维素分鮮成篆糖或单毎的蛋勺质。
关键词：发酵由；盐析法；凝胶过滤；离子交换层析；电冰Abstract:Cellulase is an important enzyme products, a complex enzyme, mainly by the exo- j3 -glucanase. en do- j3 -glucanase and 3-glucosidase and other components, there are very high energy Xylanase. Because cellulase has great market potential in the fields of feed, alcohol, textile and food, it has been regarded as the fourth largest in dustrial enzyme after saccharifyi ng enzyme, amylase and protease, even in China it is entirely possible to become the largest enzyme species, so the enzyme enzyme industry is a new growth point. Is a protein that can decompose cellulose into oligosaccharides or monosaccharides.Keywords: Fermentation> Salting out, Gel filtration, Ion exchange chromatography, Electrophoresis.一、纤维素酶的概述纤维素酶是一种对纤维素大分子的水鮮具有特殊催化作用的话性蛋勺质，它是一组酶的总称，不是单成分酶，而是由多个酶起协同作用的多酶体糸。
蛋白酶的分离纯化方法小结
酶的分离纯化方法小结摘要：随着酶工程研究的进一步深化，酶的分离和纯化技术也有了日新月异的进步。
本文简单介绍了酶分离纯化过程中的常用的一些方法，以纤维素酶为例，从最古老的沉淀法，离心法到色谱技术等都做了简略介绍。
1.沉淀法目前，常用的酶大多数是蛋白质，因而其分离方法一般采用蛋白质的分离方法。
下文中的蛋白类催化酶均以酶简称。
酶在溶液中的稳定性与分子大小、带电荷量和水化作用有一定的相关性，改变这些因素会对酶的稳定性有所影响。
当酶的稳定性遭到破坏时就会沉淀析出。
常见的沉淀法有盐析法、有机溶剂沉淀法、重金属沉淀法及加热变性沉淀法，其中盐析法多用于酶的分离纯化。
1.1盐析沉淀盐析沉淀法是根据不同酶在一定浓度盐溶液中溶解度降低程度不同达到彼此分离的方法。
酶易溶于水，因为其分子的-COOH、-NH2和-OH都是亲水基团，这些基团与极性水分子相互作用形成水化层，包围于酶分子周围形成1~100nm大小的亲水胶体，从而削弱了酶分子之间的作用力。
酶分子表面亲水基团越多，水化层越厚，酶分子与溶剂分子之间的亲和力就越大，因而溶解度也越大。
亲水胶体在水中的稳定因素有两个，即电荷和水膜。
因为中性盐的亲水性大于酶分子的亲水性，当水中加入少量盐时，盐离子与水分子对酶分子的极性基团的影响，使酶在水中溶解度增大。
但盐浓度增加一定程度时，水的活度降低，酶表面的电荷大量被中和，水化膜被破坏，于是酶相互聚集而沉淀析出。
1.2等电点沉淀利用酶在等电点时溶解度最低，而各种酶又具有不同的等电点来分离酶的方法，称为等电点沉淀法。
酶的等电点(pI)即酶的净电荷为零时的pH值，由于等电点时的酶净电荷为零，因而失去了水化膜和分子间的相斥作用，疏水性氨基酸残基暴露，酶分子相互靠拢、聚集，最后形成沉淀析出。
1.3有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀法是指有机溶剂能使酶分子间极性基团的静电引力增加，与水作用能破坏酶的水化膜，而水化作用降低，促使酶聚集沉淀。
常用的有机溶剂是乙醇和丙酮，由于有机溶剂的加入易引起变性失活，尤其乙醇和水混合释放热量，操作一般宜在低温下进行，且在加入有机溶剂时注意搅拌均匀以免局部浓度过大。
《凝胶层析技术》课件
将过滤后的样品加入层析柱中，确保样品均匀分布在凝胶颗 粒表面。
洗脱与分离
01
02
03
洗脱液的选择
根据待分离组分的性质选 择合适的洗脱液，如缓冲 液、有机溶剂等。
洗脱速度的控制
根据分离效果和分离时间 的要求，调整洗脱液的流 速。
洗脱分馏
通过控制洗脱液的流速和 组分的吸附特性，使不同 组分依次从凝胶层析柱中 洗脱出来。
蛋白质分离
凝胶层析技术可用于分离和纯化 蛋白质，通过凝胶颗粒的孔径大 小和电荷性质，将不同大小的蛋
白质分子进行分离。
去除杂质
凝胶层析技术可以用于去除蛋白质 样品中的杂质，如盐、DNA、 RNA等，提高蛋白质的纯度。
蛋白质定量
凝胶层析技术还可以用于蛋白质的 定量分析，通过测量洗脱液中蛋白 质的浓度，计算蛋白质的含量。
高分辨率与高灵敏度
为了满足更精细的分离需求，凝胶层析技术将向 高分辨率和高灵敏度方向发展。这需要研发新型 凝胶介质和优化分离条件，以提高分离效果。
多功能化与集成化
随着应用领域的拓展，凝胶层析技术将向多功能 化和集成化方向发展。这包括与其他分离技术的 结合，以及在微流控芯片上的集成应用，以满足 复杂样品处理的需求。
自动化与智能化
随着机器人技术和人工智能的进步，凝胶层析技 术的自动化和智能化将成为未来的重要发展趋势 。这不仅可以提高分离效率，减少人为误差，还 能大幅减少人力成本。
高通量与快速分离
高通量和快速分离是凝胶层析技术的另一重要发 展趋势。通过改进凝胶介质和优化分离流程，可 以实现更高流速下的高效分离，缩短分离时间。
凝胶的清洗与再生
清洗
在每次使用后，用适量的 溶剂清洗凝胶层析柱，去 除残留的杂质和洗脱液。
纤维素酶的分离纯化..
通常采用的中性盐有
硫酸铵、硫酸钠、硫酸
钾、硫酸镁、氯化钠和磷
酸钠等。
纤维素酶的分离纯化多采用硫酸铵分级沉淀法，因 为硫酸铵具有溶解度大，对温度变化不敏感，分级 效果好等特点。
陈红漫等在芽孢杆菌β-葡萄糖苷酶的分离纯化及特 性的研究中采用硫酸铵分级沉淀法对粗酶液分离纯 化，结果显示在硫酸铵饱和度区间为20%~60% 时，经硫酸铵沉淀后，酶纯化倍数为 1.42，回收 率为 11.41%。
纤维素酶的分离纯化
纤维素酶的组分大多为糖蛋白，工业上用于生 产纤维素酶的粗酶制剂常采用硫酸铵沉淀法，酒精 沉淀法，丹宁沉淀法和离心喷雾干燥等方法。凝胶过滤法等。
沉淀法（盐析）
☻盐析沉淀法的原理：
高盐浓度下盐离子与酶蛋白质分子争夺水分 子，除去蛋白质的水合外壳， 降低溶解度而沉淀。
纤维素酶用作饲料添加剂,能明显提高饲料消化率 和利用率,促进动物生长。在奶牛的养殖上,纤维素 酶能增强奶牛食欲,增加其对粗饲料的采食量,提高 饲料的消化率和利用率,提高产奶量,同时,还能降 低奶牛消化道的发病率。
天然纤维如棉、麻等纺织品具有较强的吸湿、 透气性，备受消毒者青睐。但棉、麻及其混纺布料 上存在细毛，与皮肤接触时会产生刺痒感，因此近 几年来，利用纤维素酶进行生物整理越来越受到纺 织界的重视。利用纤维素酶进行酶处理，能使麻、 棉表面剥离和纵向复合细胞间层侵蚀，使纤维梢丝 束化或脱落，能极大地降低对皮肤的刺痒，提高棉 麻织物的服用性能及产品档次。
凝胶过滤
• 凝胶过滤层析法是根据蛋白质的大小和形状，即 蛋白质的质量进行分离和纯化。 层析柱中的填料是多孔凝胶填料，多是交联的聚 糖类物质，使蛋白质混合物中的物质按分子大小 的不同进行分离，一般是大分子先流出来。小分 子后流出来。 具有条件温和,简便,分离范围广,回收率高等特点
镰刀菌发酵培养液中纤维素酶的分离纯化
取 。其 中研究 最多 的 是木 霉 属 （ ｒｃ ｏ ｅｍａ 和 曲 霉 Ｔ ｉ ｄｒ ） ｈ
属 （ ｐ ｒ ｉｌｓ ， 们 都 能 产 生 大 量 的纤 维 素 酶 ， Ａｓ ｅｇ ｌ ） 它 ｕ 尤
亿 学 与 生 物 互 狸 ２１， １７ ｏ１ ００Ｖ ． ２ ｏ２ Ｎ
Ｃｈ ｍｉｔｙ ＆ Ｂｉ ｅ ｇｉｅ ｒ ｇ ｅ ｓｒ ｏ ｎ ｎ ｅｉ ｎ
镰 刀 茵 发 酵 培 养 液 中 纤 维 素 酶 的 分 离 纯 化
郑 金 花 。 建 平 郁
（ 州大 学生化 营养研 究所 ， 州 贵 阳 ５ ０ ２ ） 贵 贵 ５ ０ ５
Ｇ２ ０ 乙醇 ， 酸 ， 烯 酰胺 ， ５， 磷 丙 甲叉 双 丙烯 酰 胺 ， ｉ， Ｔｒ ｓ
Ｓ ， 硫 酸铵 ， 甲基 己二 胺 （ ＭＥ ， 氨 酸 ， ＤＳ 过 四 ＴＥ Ｄ） 甘 甘 油 ， 酚 蓝 ，一 基 乙 醇 ， 醇 ， 醋 酸 ， 有 试 剂 均 为 溴 ２巯 甲 冰 所 分 析纯 。 透 析 袋 （ Ｄ ３ ） Ｓ ｐ ａ ｅ 一Ｏ 、 Ａ — ｅ ｈ — Ｍ ４ ； ｅ ｈ ｄ ｘＧ １ ０ ＤＥ Ｅ Ｓ ｐ ａ ｄ ｘ Ａ ５ ， ｈ ｒ ｃ ； Ｄ — ＡＧＥ低 分 子 量 标 准 蛋 白 ｅ 一０ Ｐ ａｍａ ｉ Ｓ ＳＰ ａ
摘 要 ： 用 镰 刀 茵 菌 株 液 体 培 养 产 纤维 素 酶 。将 菌 株 在 ３ ＂ １ ０ｒ 选 ００、２ ・ｍｉ＿ 摇 床 培 养 １ ８ｈ ５０ ｒｉ 离心 ｎ１ ０ ，０ ０ｒ。 ｎ ａ
２ ｎ 取 上 清 Ｏ ｍｉ ， Ｓ ｐ ａ ｅ ｌ ０凝胶 过 滤 层 析 和 Ｄ ＡＥ Ｓ ｐ ａ ｅ ５ 离子 交换 层 析 进 行 纤 维 素 Ｅ — ｅ ｈ ｄ ｘＡ一０ 酶 的 分 离 纯化 ， 用 Ｓ － ＡＧ 并 ＤＳ Ｐ Ｅ进 行 纯 度检 验 。 结 果 表 明 ， 离 纯化 后 的 纤 维 素 酶 酶 活 为 ３ ． ５ Ｕ ・ｍＬ ， 活 力提 高 分 ５ ２ 比 到 １ ． ６倍 。为 进 一 步 研 究 纤维 素 酶 的组 分 、 构 奠 定 了基 础 。 ９５ 结 关 键 词 ： 维 素 酶 ； 离 纯化 ； 析 ； ＤＳＰ ＧＥ 纤 分 层 Ｓ －Ａ 中 图分 类 号 ： ５ Ｑ ５ 文献标识码 ： Ａ 文章 编 号 ： ６ ２ ５ ２ （ ０ ０ １ — ０ ６ — ０ １ ７ — ４ ５２ １ ）２ ０ ５ ４
纤维素酶的分离纯化及其应用研究
纤维素酶的分离纯化及其应用研究第一章绪论纤维素酶是一类能够降解植物纤维素的酶，广泛存在于许多生物体中，如真菌、细菌和昆虫等。
在生物质能源利用、动物饲料加工和纸浆、纺织、食品等工业中，纤维素酶都有重要的应用。
然而，由于纤维素基质的复杂性和纤维素酶的多样性，纤维素酶的分离纯化和应用研究一直是一个研究热点和难点。
本文通过对纤维素酶的分离纯化方法和应用领域的综述，探讨了纤维素酶的分离纯化及其应用研究的现状和存在的问题，为纤维素酶的进一步研究提供参考。
第二章纤维素酶的分离纯化方法纤维素酶的分离纯化方法主要包括超滤法、离子交换、凝胶过滤、逆流层析、亲和层析、等电聚焦和高效液相色谱等。
2.1 超滤法超滤法是一种静态的分离方法，可用于去除低分子量的杂质和离子，是纤维素酶的常规预处理方法。
超滤法在分离纯化中的运用主要是将蛋白质和营养物质剥离出来，使得目标产物的含量和纯度提高。
但是，超滤法在大规模产生目标诱导产物时，也会产生诸如集膜、渗漏、破损和引起阻塞等操作问题。
2.2 离子交换离子交换是一种静态的分离方法，可用于去除离子和低分子量杂质。
离子交换树脂是一种稳定的、高度功能化的糖蛋白，它可以根据不同的性质选择性地吸附、脱附和提取离子或分子。
但是，离子交换也存在一些问题，如对产物活性的影响、树脂使用寿命的影响等。
2.3 凝胶过滤凝胶过滤是一种动态的分离方法，可用于分离和分析分子量超过10 kDa的蛋白质和多肽。
凝胶过滤所采用的是大分子量筛选剂，可把分子量大的物质排除在外，具有分离纯化效果较好的特点。
但是，凝胶过滤也有一定的限制，如分子量分析范围有限、处理速度较慢等。
2.4 逆流层析逆流层析是一种对大分子生物分离纯化非常有效的动态分离方法，具有高效和优良活性的特点。
它能够通过反向溶剂流动而分离目标群，从而精细控制和分离纯化生物学分子。
逆流层析在纤维素酶分离纯化中的应用可以有效地提高分离纯化的效率和产率。
2.5 亲和层析亲和层析是一种静态分离技术，通过配合分子、抗体和亲和剂吸附和脱附产物，得到产物的高纯度和高产率。
凝胶过滤层析的特点
凝胶过滤层析的特点
凝胶过滤层析是一种常用的分离、纯化生物大分子的技术方法。
它的主要特点是操作简便、分离效果好、适用范围广。
下面将就凝胶
过滤层析的特点进行详细论述。
首先，凝胶过滤层析具有操作简便的特点。
相比其他分离方法，
凝胶过滤层析不需要复杂的设备和条件，只需要使用凝胶过滤柱，将
样品加入柱上，经过适当的洗涤和洗脱，即可得到目标物质。
其操作
过程简单明了，不需要专业化的知识和技能，即使是初学者也可以轻
松上手。
其次，凝胶过滤层析具有分离效果好的特点。
凝胶过滤层析能够
根据分子大小进行分离，较大的分子无法通过凝胶基质的孔隙，从而
得到纯净的目标物质。
与其他方法相比，凝胶过滤层析的分离效果更
为准确，能够有效地去除杂质，提高产物的纯度。
此外，凝胶过滤层析适用范围广。
凝胶过滤层析不仅适用于蛋白
质的纯化和富集，还适用于核酸、多肽、糖类等生物大分子的分离。
不同类型的凝胶基质可以选择不同的分离范围，满足不同实验需求。
凝胶过滤层析的广泛适用性，使其成为生物科研和生产领域中不可或
缺的工具。
综上所述，凝胶过滤层析作为一种常用的生物大分子分离技术，
具有操作简便、分离效果好和适用范围广的特点。
通过凝胶过滤层析，我们可以轻松地获得纯净的目标物质，为后续的实验和应用奠定基础。
在未来的研究中，我们将进一步探索凝胶过滤层析的优化与应用，以
提高其分离效率和经济性。
凝胶过滤法名词解释
凝胶过滤法名词解释
凝胶过滤法又称分子排阻法，这是一种高效分离纯化蛋白质的方法。
原理是不同的蛋白质分子对固定化在载体上的特殊配基具有不同的识别和结合能力。
选择与待纯化蛋白质具有特殊识别和结合作用的配基，然后应用化学方法将该配基与载体共价链接。
将这种有配基的载体装入层析柱中，当含有待纯化的蛋白质溶液通过层析柱时，该蛋白质即与配基发生特异性结合而被吸附在层析柱上，而其他蛋白质则流出柱外。
被特异性结合在层析柱上的蛋白质，可以用适当的配体洗脱液洗脱。
缺点：从凝胶过滤的原理可知，蛋白质分子通过凝胶柱的速度(即洗脱体积的大小)并不直接取决于分子的质量，而是它的斯笃克半径，利用凝胶过滤法测定蛋白质分子量时，标准蛋白质(已知分子量和斯笃克半径)和待测蛋白质必须具有相同的分子形状(接近球体)，否则不能得到比较准确的分子量。
分子形状为线形的或与凝胶能发生吸附作用的蛋白质，则不能用此方法测定分子量。
而且柱子成本比较高，整个实验过程耗时很长。
纤维素酶的分离纯化
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凝胶过滤
? 凝胶过滤层析法是根据蛋白质的大小和形状，即 蛋白质的质量进行分离和纯化。 层析柱中的填料是多孔凝胶填料，多是交联的聚 糖类物质，使蛋白质混合物中的物质按分子大小 的不同进行分离，一般是大分子先流出来。小分 子后流出来。 具有条件温和 ,简便,分离范围广 ,回收率高等特点
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食品工业 饲料工业
纤维素酶
洗涤剂工业 其他
应用
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纤维素酶在食品工业应用极为广泛。 如将纤维素酶应用于豆腐生产工艺中，结果表 明，在大豆浸渍时添加 0.5%~5.0% 纤维素酶，可提 高4.00%~11.01% 豆腐品率，且所产豆腐色质和风 味无明显变化，同时不改变原有生产工艺路线，其 经济效益比较明显 。
贺刚等运用葡聚糖凝胶层析柱sephdedxg75法对草鱼肠道一菌株产纤维素酶粗酶液进行分离纯化结果显示分离纯化后酶的比活力提高了292倍回收率为53810等电聚焦电泳是依据蛋白质分子的等电点不同在一个连续的稳定的线性ph梯度中电泳的蛋白质分离和分析技术等电聚焦电泳具有很高的分辨率可以分离等电点相差001002个ph单位的蛋白质
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纤维素酶用作饲料添加剂 , 能明显提高饲料消化率 和利用率, 促进动物生长。在奶牛的养殖上 , 纤维素 酶能增强奶牛食欲 , 增加其对粗饲料的采食量 , 提高 饲料的消化率和利用率 , 提高产奶量 , 同时, 还能降 低奶牛消化道的发病率。
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天然纤维如棉、麻等纺织品具有较强的吸湿、 透气性，备受消毒者青睐。但棉、麻及其混纺布料 上存在细毛，与皮肤接触时会产生刺痒感，因此近 几年来，利用纤维素酶进行生物整理越来越受到纺 织界的重视。利用纤维素酶进行酶处理，能使麻、 棉表面剥离和纵向复合细胞间层侵蚀，使纤维梢丝 束化或脱落，能极大地降低对皮肤的刺痒，提高棉 麻织物的服用性能及产品档次。
凝胶过滤层析法教学专用
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2013年8月20日星期二
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Bio－Gel A系型号及性能
2013年8月20日星期二
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Sepharose系型号能性能
2013年8月20日星期二
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Sepharose是该系中最早的产品， 为非交联结构，因此不能进行高压 灭菌，仅能在2～40℃范围内使用。 根据琼脂糖含量的不同，对含量为2 ％、4％及6％的产品分别命名为2B、 4B和6B。由于新型凝胶的不断出现， 此型凝胶有逐渐被淘汰的趋势。
2013年8月20日星期二 27
2013年8月20日星期二
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Sephacryl系列产品性能
2013年8月20日星期二
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(五)、Superdex系列产品 是最新的凝胶 过滤介质，属BioProcess介质中的一种。 是将葡聚糖以共价键方式结合到高交联 的多孔琼脂糖珠体上形成的复合凝胶。 是将交联葡聚糖优良的过滤选择性及高 交联的琼脂糖的物理化学稳定性集于一 身的具有优良选择性和高分辨率的产品。 可在0.1mol/LHCl或1mol/LNaOH溶液中 40℃处理400小时而分辨率保持不变。
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Superdex结构
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Superdex(BioPrecess介质)素列产品性能
2013年8月20日星期二
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(六)、聚乙烯醇系(Toyopearl)：以交联 聚乙烯醇为骨架的凝胶过滤介质，20世 纪80年代初部世，由美国R&H公司与日 本曹达公司联合开发。是多孔的三维网 状结构，大分子链上含有丰富的羟基， 使其具有高度亲水性，进行化学改性后 可转变为含有多种功能基的离子交换剂 及亲和吸附剂。Fractogel TSK是该系列 的类似产品，适用于HPLC(高效液相层 析)。
纤维素酶在发酵液中的分离与纯化技术研究
纤维素酶在发酵液中的分离与纯化技术研究邮寄地址: 湖北省武汉市武昌区静安路凯旋名邸一号邮寄姓名:田田151****3126摘要：随着全球需求的增加，纤维素酶在生物燃料和食品工业中的应用不断扩大。
然而，发酵液中纤维素酶的分离与纯化仍面临挑战。
本研究旨在探索高效的分离与纯化技术。
选择合适的固液分离方法将发酵液和固体废弃物分离，然后运用不同的蛋白质分离技术，如离子交换层析和凝胶过滤层析，获得高纯度的纤维素酶。
采用酶活测定和SDS-PAGE技术验证纤维素酶的纯化效果。
结果表明，该研究建立了一套有效的纤维素酶分离与纯化技术，为其广泛应用提供了有力支持关键词：纤维素酶；发酵液；纯化技术引言随着全球需求的增加，纤维素酶在生物燃料和食品工业中的应用不断扩大。
然而，发酵液中纤维素酶的分离与纯化仍面临挑战。
高效的纤维素酶分离与纯化技术对于提高酶的活性和纯度至关重要。
本研究旨在探索一套有效的分离与纯化技术，通过选择合适的分离方法和蛋白质分离技术，实现纤维素酶的高纯度提取o所得到的结果将为纤维素酶的广泛应用提供有力支持，并推动相关领域的发展1.分离与纯化技术的探索1.1固液分离方法的选择在纤维素酶的分离与纯化中，固液分离是一个关键步骤。
有几种常用的固液分离方法可供选择。
其中，压滤和离心是常见的机械分离方法，通过利用颗粒物质的相对大小和密度来实现分离。
另外，沉降和扩散是一种基于不同物质的相对沉降速度和分子扩散速度进行分离的方法。
而且，超滤是一种利用膜孔径尺寸以及应用外部压力差逆向排除微小颗粒的方法，其中可选择填充压力过滤等技术。
最后，还可以考虑使用离子交换或吸附树脂、凝胶过滤等方法，根据纤维素酶和其他杂质的特性进行选择。
1.2蛋白质分离技术的应用在纤维素酶的分离与纯化过程中，蛋白质分离技术发挥着重要作用。
以下是几种常见的蛋白质分离技术及其应用：离子交换层析：这种技术基于样品在固定相上的电荷特性进行分离。
通过选择合适的离子交换介质和缓冲液pH条件，可有效地分离不同电荷性质的蛋白质。
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收稿日期:2003)07)11作者简介:王玢(1962)),女,山东济南市人,讲师;袁方曜(1962)),男,山东济南市人,副研究员。
凝胶过滤层析分离纯化纤维素酶的研究王 玢1,袁方曜2(1.山东教育学院生物系, 山东 济南 250013;2.山东省农科院,山东 济南 250100)摘要:海洋细菌M B1产生的纤维素酶粗酶液,经盐析、透析,分别上葡聚糖凝胶层析柱Sephadex G-100,Sephadex G-75和Sephadex G-50进行分离纯化,以Sephadex G-75分离效果最好,得到一个电泳纯的外切酶组分,该酶的比活力由6.94U mg -1提高到200.9U mg -1,提高了28.9倍,总收率8.6%。
关键词:纤维素酶;外切酶;凝胶过滤;柱层析;分离纯化中图分类号:Q814.1 文献标识码:A 文章编号:1008)2816(2003)06)0088)03随着各种蛋白质纯化技术的出现,纤维素酶的分离纯化研究也取得了很大进展,纤维毒酶已广泛应用于食品、医药、饲料和纺织等领域。
纤维素酶来源广泛、组分复杂,各组分的分子量和等电点相差很小,分离纯化工作比较困难。
而纤维素酶的分纯工作非常重要,只有得到纯酶,才能了解其组成、性质及相互关系,并可根据纤维素酶的不同理化性质纤维材料的作用特点,开展纤维素降解机制的研究,为纤维素酶分子结构研究、酶基因克隆、新酶分子的构建和DNA 体外定点诱变等提供依据。
通常,纤维素酶的分离纯化多采用离子交换层析。
由于酶蛋白分子表面电荷的不均一性[1],对离子交换剂表现了不同的亲和力,且离子交换剂与酶蛋白分子之间的亲和力不仅取决于酶分子表面携带电荷数目多寡,而且与其分子内电荷排布有关;而在离子交换层析中,只有分布在蛋白质分子亲水表面的电荷才发挥作用,而存在于分子疏水核心中的电荷在离子交换中不起作用。
因而,一个简单的洗脱条件很难将多种酶蛋白分离开来,往往需要复杂的洗脱条件才能得到纯酶。
凝胶过滤层析是根据样品中各种物质分子量的不同,通过多孔凝胶床达到分离的目的[2]。
这种方法条件温和、简便、分离范围广、回收率高,对生化物质的分离十分适宜。
我们利用葡萄糖凝胶层析技术对海洋适冷菌MB1所产纤维素酶进行了分离纯化。
由于冷活性纤维素酶对热敏感,故纯化工作于4e 下进行。
1 材料和方法1.1 材料1.1.1 粗酶液取MB1菌种发酵液[3]于4e ,8000rpm,离心15分钟,收集上清液即为粗酶液。
1.1.2 纤维素酶分离纯化材料与介质透析超滤材料:10,000NMWL 透析袋,10,000NMWL 聚醚砜超滤膜。
分离纯化介质:Sephadex G -100;Sephadex G -75;Sephadex G-50;(AMERSHAM PHARMACIA BIOT EC H 公司)。
1.1.3 主要仪器杯式超滤器(Amico 公司),柱层析系统,DYY -2稳压稳流电泳仪(北京六一仪器厂);DYY-m24D 型电泳槽(北京六一仪器厂);层析柱50cm @2.6mm;8823A 紫外检测仪(北京新技术研究所);记录仪;分步收集器;高速冷冻离心机;全温震荡培养箱。
1.2 方法1.2.1 纤维素酶活力测定方法[4]1.2.2 蛋白质含量测定采用Folin-酚法[5]测定蛋白质含量,以牛血清白蛋白(B SA)做标准曲线。
1.2.3 纤维素酶的分离纯化方法1.2.3.1 粗酶液的制备:取发酵液于4e ,8000rpm,离心15分钟,收集上清夜即为粗酶液。
经测定,粗酶液中外切纤维素酶活为102L g/mL,蛋白质含量为14.7mg/ml 。
1.2.3.2 硫铵沉淀和透析:取粗酶液,加入硫酸铵至25%饱和度,4e ,10000rpm,离心10分钟,分别测沉淀物和上清液中的酶活,酶活集中于沉淀物中,收集沉淀物溶于少量0.05mol/L Ph6.0磷酸缓冲液中,透析除盐,得到经硫酸铵沉淀的纯化酶液,此为分子筛柱层析上样样品。
1.2.3.3 SDS-SPGE 采用垂直板式不连续系统电泳,分离胶浓度12%,浓缩胶浓度4%,用0.25%(W/V)考马斯亮2003年第6期 山东教育学院学报 总第100期蓝R-250酸性乙醇水染色。
1.2.3.4 葡聚糖凝胶层析 葡聚糖凝胶Sephadex G-100,Sephadex G-75和Sephadex G-50,充分溶胀,抽气,分别装柱(50cm @2.6mm),用0.05mol/L pH6.0磷酸缓冲液充分平衡后上样,上样量均为4.0mL,流速7mL/h,检验器灵敏度为0.2A,20分钟收集一管,(每管2.4mL),分别测定各管的CMC 酶活和微晶纤维素酶活。
以C MC 酶活代表内切酶活,微晶纤维素酶活代表外切酶活。
2.结果取上述样品各4mL,分别上Sephadex G -100,Sephadex G-75和Sephadex G-50凝胶层析柱,结果分别见图1、图2、图3。
图1 Sephadex G-100凝胶层析图谱Fig.1Gel filtration chromatogram of Sephadex G-100图2 Sephadex G-75凝胶层析图谱Fig.2Gel filtration chromatogram of Sephadex G-75图3 Sephadex G-50凝胶层析图谱Fig.3Gel filtration chromatogram of Sephadex G-50 (1)由图1层析图谱可以看出,样品经过Sephadex G-100柱析分离后只得到一个大而缓的峰,峰液中的C MC 酶活和微晶纤维素酶活得很高,没有得到纯酶。
(2)图2显示,样品经Sephadex G-75柱层析分离后,得到三个主要的峰。
分别称为峰Ñ、峰Ò和峰Ó。
分别测定各峰液中的外切酶活和内切酶活,结果表明,峰Ó只具有较高的外切酶活。
收集峰Ó酶液,浓缩后进行SDS-PAGE 电泳,电泳结果显示,仅为一条带,说明该组分已被提纯。
(3)图3层析图谱显示,样品Sephadex G -50柱层析后,出现两个主要的峰,经测定,峰Ñ内切酶活和外切酶活均较高;峰Ò主要是外切酶活,亦有少量内切酶活,没有分纯。
以上实验结果表明,利用不同交联度的葡聚糖凝胶Sephadex G-100、Sep hadex G-75、Sephadex G-50进行纤维素酶分离纯化,以Sephadex G -75分纯效果最好;经Sephadex G-75柱层析后,得到一个具有外切酶活的纯组分。
纯化结果见表1。
表1 Sephadex G-75分离纯化纤维素酶结果总活力(U)蛋白含量(mg/mL)比活力(U mg -1)纯化倍数(fold)酶活收率ss 粗酶液10200014.7 6.941100Sephadex G-7588402.2200.928.98.63 讨论(1)利用Sephadex G-100、Sephadex G-75和Sephadex G-50三种葡聚糖凝胶对纤维素酶进行分离纯化,以Sephadex G-75分离效果最佳,得到一个电泳纯的外切酶组分,比活力提高了28.9倍。
(2)凝胶过滤层析也称为大小排阻层析,与其他类型的层析技术不同,凝胶柱系由均匀装填的多孔凝胶微粒组成,蛋白质分子据通过微孔迁移能力的不同而被分离。
在理想的理论情况下,凝胶柱系不涉及蛋白质与填料之间的吸附的排斥作用,故蛋白质的迁移能力仅取决于其分子的大小,分子量大的物质先被洗脱出层析柱,而分子量小的物质后被洗脱下来,从而达到分离的目的;选用适宜的凝胶,并保证其均一性,是纯化成功与否的关键。
(3)该纤维素酶纯化的回收率较低,只有8%,可能与该适冷酶热稳定性较差有关,虽然操作在4e 下进行,但酶活丧失仍较高。
参考文献:[1] 何忠效等.现代生物技术概论[M ].北京:北京师范大学出版社,1999,168.[2] D.R.Marshak et al.Strategies for Protei n Purification and Character -i zati on:A Labroratory Course Manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press,1996.[3] 王玢,汪天虹等.产低温纤维素酶海洋适冷菌的筛选和研究[J].海洋科学,2003,27(5):42-45.[4] Hori koshi K,Nakao M,Kurono Y,et al.Cellulas e of an alkalophilic#89#总第100期 山东教育学院学报Bacillus strai n is olated from soil.Can J.Mic robiol,1984,30:774-779.[5] 李建武等.生物化学实验原理和方法[M ].北京:北京大学出版社,1994,168-170.Separation and Purification of Cellulase by ColumnChromatography of the Gel FiltrationWang Bin 1,Yuan Fangyao 2(1.Shandong educational college 250013;2.Shandong Academy o f Agricultural Sciences 250100)Abstract:The crude cellulase extraction from a mari ne bacterium MB1was separated and purified by the ammonium sulfate precipitation,dialysis and colu mn chromatography of SephadexG-100、SephadexG-75and SephadexG-50.The effect of the SephadexG-75was the best and one cellobiohydrolase(CB H)was purified to electrophoretic homogeneity by SephadexG-75colu mn chromatography.The specific activity of the enzyme was raised from 6.94U mg -1to 200.9U mg -1,which was 28.9times that of the culture supernatant with a yield of 8.9%.Key words:cellulase;cellobiohydrolase;gel fil tration;column chromatography;separation and purification(上接87页)Study and Application of Cell Variants in PlantYu Huimin,Shi Zhu(Department o f Biology ,Shandong Education College,Ji .nan 250013,China)Abstract:The expeted adversity-resistance of plant cell can be selected by the tissue culture in viro under certain stress factors.This pa -per mainly analysed and reviewed the selection and application of all kind s of directively selected cell variants reported i n recent years.Par -ticularly,the focus of this paper was put on the cell variants which resist certain stress such as salt,drought,low temperature and disease.The variants resistant to amino acids and their anlogues were also within this scope.Key words:variant;tissue culture;selection#90# 王玢等:凝胶过滤层析分离纯化纤维素酶的研究 2003年第6期。