分解纤维素的微生物的分离 公开课

碳源、氮源、生长因子 无机盐 碳源、生长因子
酵母膏 KH2PO4 土豆汁
1g 0.25g 100mL Nhomakorabea琼脂
15g
凝固剂
氢元素、氧元素
上述物质溶解后，加蒸 馏水定容至1000mL
5.刚果红染色法 挑选产生透明圈的菌落，一般即为分 解纤维素的菌落。 方法一：先 培养微生物，再加入刚果红进 行颜色反应。（后置染色法） 方法二：在 倒平板 时就加入刚果红。 （前置染色法）
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1
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3
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105
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4.将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养 基上 （1）制备鉴别培养基: （2）涂布平板： 将稀释度为104～106的菌悬液各取0.1ml 涂布到平板培养基上，30℃倒臵培养。
鉴别纤维素分解菌的培养基
培养基组成 CMC-Na 5~10g
(水溶性羧甲基纤维素钠)
提供的主要营养物质 碳源
二、实 验 设 计
请你根据实验流程图和提供的三个资料以及“操作 提示”，在思考有关问题的基础上，设计出一个详细的 实验方案。
土壤取样
选择培养
梯度稀释
将样品涂布在鉴别纤 维素分解菌的培养基上
筛选产生透 明圈的菌落
操作步骤
1、土壤取样：
①分布环境 富含纤维素的环境中 ②原因 生物与环境的互相依存关系，在富含纤维素 的环境中纤维素分解菌的含量相对提高，因此从 这种土壤中获得目的微生物的几率要高于普通环 境。
2.纤维素酶
纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少 包括三种组分，即C1酶(外切酶)、CX酶(内切酶) 和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维 二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。
纤维素
C1酶、Cx酶
纤维二糖
葡萄糖苷酶
葡萄糖
CX酶：内切酶，使纤维素断裂成片断。 C1酶：外切酶，从糖链末端开始切掉两个葡萄糖 分子，产生纤维二糖 葡萄糖苷酶：将纤维二糖分解成葡萄糖。
五、课题延伸
为了确定分离得到的是纤维素分解菌，
还需要进行__________ ___实验，纤维素酶 发酵产纤维素酶 的发酵方法有______ 液体 发酵和______ 固体 发酵。
纤维素酶测定方法是对纤维素酶分解滤纸等
纤维素所产生的________ 葡萄糖 含量进行定量测定。
课堂总结
分解 纤维 素的 微生 物的 分离 纤维素酶
分解尿素的细菌
纤维素分解菌
原 鉴理 定 培 养 现 观察菌落周围是否有着色的 观察菌落周围是否出现 基 象 环带出现来鉴定尿素分解菌 透明圈来筛选纤维素分解菌 方 法 脲酶检测法
刚果红染色法
在细菌分解尿素的化学反应 中，细菌合成的脲酶将尿素 分解成了氨，氨会使培养基 的碱性增强，pH升高。在培 养基中加入酚红指示剂，如 果pH升高指示剂会变红
③实例：树林中多年落叶形成的腐殖土，多年 积累的枯枝败叶等。
④讨论:如果找不到合适的环境，可以将滤纸埋 在土壤中，将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认 为滤纸应该埋在土壤中多深？ 将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对 集中，实际上是人工设臵纤维素分解菌生存的 适宜环境。一般应将滤纸埋于深约10cm左右的 土壤中。
酵母膏
水解酵素
0.5g
0.5g
生长因子、碳源、氮源
氮素、生长因子 水
溶解后，蒸馏水定容至 1000mL
A、旁栏中的配方是液体培养基还是固体培养基？为什么？ 是液体培养基，原因是配方中无凝固剂（琼脂） B、这个培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有， 是如何进行选择的？ 有选择作用，本配方中纤维素作为主要碳源，只有能 分解纤维素的微生物可以大量繁殖。 C、你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用 提示：自变量为培养基的种类，即普通培养基和选择 培养基。可用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照,或者将纤 维素改为葡萄糖。
筛选原理 实 验 设 计
种类、作用、催化活力 前置染色法 刚果红染色 后置染色法
富含纤维素土壤 增大分解菌含量 染色鉴别
土壤取样 选择培养 纯化培养
涂布培养
分离出分解菌
分解纤维素的微生物 的分离
JLSSY BYH
一、基础知识
㈠纤维素与纤维素酶
1.纤维素
纤维素是一种由葡萄糖首尾相连而成的高 分子化合物，是含量最丰富的多糖类物质。
植物的根、茎、叶等器官都含有大量的纤 维素。其中棉花是自然界中纤维素含量最高 的天然产物。
土壤中某些微生物能够产生纤维素酶,把 纤维素分解为葡萄糖，后再利用。
6、纯化培养 在产生明显的透明圈的菌落，挑取 并接种到纤维素分解菌的选择培养基上， 在300C－ 370C培养，可获得纯化培养。
四、结果分析与评价
1.培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选 出菌落
对照的培养基在培养过程中没有菌落生长则说明 培养基制作合格。 如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得 了分解纤维素的微生物。 2.分离的结果是否一致 由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌 的数量，因此最容易分离得到的是细菌。但由于所取 土样的环境不同，不同同学也可能得到真菌和放线菌 等不同的分离结果。
实验：纤维素酶分解纤维素的实验 滤纸崩溃法
①取二支20mL的试管
②各加入一张滤纸条
③各加入pH4.8，物质量为0.1mol/L 的醋酸－醋酸钠缓冲液11ml和10ml ④在乙试管中加入1mL纤维素酶 ⑤两支试管固定在锥形瓶中，放在 140r/min的摇床上振荡1h ⑥结果：乙试管的滤纸条消失
甲
乙
讨论：乙试管的滤纸条为什么会消失？甲试管的作用是 什么？
说明：分析“纤维素分解菌的选择培养基
配方”可知，该配方中的酵母膏也能够提供少 量的碳源，因此其他微生物也能在该培养基中 生长繁殖。只不过，由于酵母膏的含量极少，
因此，只有以纤维素为碳源的微生物才能大量
繁殖。
为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生 物？
在选择培养的条件下，可以使那些能够适
应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那
思考：本实验的流程与课题2中的实验流程有哪些 异同？ 本实验流程与课题2的流程的区别如下。课 题2是将土样制成的菌悬液直接涂布在以尿素为 唯一氮源的选择性培养基上，直接分离得到菌 落。本课题通过选择培养，使纤维素分解菌得 到增殖后，再将菌液涂布在选择培养基上。其 他步骤基本一致。
3.梯度稀释
按照课题1的稀释操作方法，将选择培养后 的培养基进行等比稀释101～107倍。
这两种方法各有哪些优点与不足？
染色法 优点 缺点
颜色反应基本 操作繁琐 方法一 上是纤维素分 刚果红会使菌落之间发生 解菌的作用 混杂 1.产生淀粉酶的微生物也 操作简便， 产生模糊透明圈 不存在菌落 2.有些微生物能降解色素， 混杂问题 形成明显的透明圈。
方法二
比较 项目
选 择 培 养 原理 培养基类 型 目的
2、选择培养 ①目的：
增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从 样品中分离所需要的微生物。
②制备选择培养基：
③操作：
将土样加入装有30ml选择培养基的锥形瓶 中，将锥形瓶固定在摇床上，在一定温度下震 荡培养1～2天，直至培养液变浑浊。也可重复 选择培养。
培养基成分分析
培养基组成 纤维素粉 NaNO3 1g KCl 0.5g Na2HPO4· 7H2O KH2PO4 0.9g MgSO4 · 7H2O 1.2g 0.5g 5g 提供主要的营养物质 碳源（能源） 氮源、无机盐 无机盐
些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制， 因此可以起到“浓缩”的作用。
比较项目 分解尿素的细菌 选 原理 择 培 养 培养基 基 类型 目的 鉴 原理 定 现象 培 养 方法 基
纤维素分解菌
将细菌涂布在只有 将细菌涂布在只有 尿素做氮源的选择 纤维素粉做碳源的 培养基上 选择培养基上 固体培养基 筛选菌株 液体培养基 选择培养
实验分析：P27的小实验是如何构成对照 的？
提示： 本实验的自变量是纤维素酶的有无，自变 量的操纵方法是：在一支试管中添加适量（1mL） 的纤维素酶溶液，在另一支试管不添加纤维素 酶，但需加入等量的缓冲液，不能加入蒸馏水， 否则会影响溶液的pH。
（二）纤维素分解菌的筛选
——刚果红染色法 刚果红能与纤维素形成红色复合物，而不与 水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。 当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红 时，刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复 合物。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红-纤 维素的复合物就无法形成，培养基中就会出现 以纤维素分解菌为中心的透明圈，这样我们就 可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。
刚果红可以与纤维素形成 红色复合物，当纤维素被 纤维素酶催化分解后红色 复合物无法形成，培养基 上就会出现以纤维素分解 菌为中心的透明圈
思考：
方法一中NaCl溶液的作用？
漂洗作用，洗去与纤维素结合不牢的刚果红， 以免出现的透明圈不够清晰。用这方法可以判断酶 活力的大小，实际上刚果红是结合到培养基的多糖 底物，但分解纤维素的细菌可以产生纤维素酶，能 分解这个多糖底物成为单糖，这样刚果红就不能结 合上去了，氯化钠溶液就可以使结合不牢的刚果红 洗去，这样就留下大大小小的透明圈，大的透明圈 当然分解纤维素的能就强！
纤维素是地球上含量最丰富的多糖类物质， 植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中40%60%能被土壤中能产生纤维素酶的微生物所利用， 不会大量积累。 在草食性动物等的消化道内，也共生有 分解纤维素的微生物，其原理也是产生纤维 素酶而分解纤维素，而人没有分解纤维素的 能力。
人类可应用分解纤维素的微生物将秸秆 等废弃物转变成酒精，用纤维素酶处理服装 面料等。