分解纤维素的微生物的分离

微生物的计数
产生标准菌落的细菌的最初数目和培养基分别是 （） A．一个细菌，液体培养基 B．许多细菌，液体培养基 C．一个细菌，固体培养基 D．许多细菌，固体培养基 【解析】菌落是一个或几个细菌的子细胞群体，在 固体培养基上，有一定的形态结构，肉眼可见，菌 落可作为菌种鉴别的重要依据，而多种细菌形成的 菌落，就不可能有比较标准的形态。 【答案】C
①鉴别培养基 的特点? ②如何鉴别?
挑选什 么样的 菌落?
取样?
根据：微生物 目的：增加纤维素 刚果红染色法
对生存环境的 要求，到相应 环境中去找；
分解菌的浓度，以 确保能够从样品中 分离到所需要的微 生物；
课堂总结
分解 纤维 素的 微生 物的 分离
纤维素酶 种类、作用、催化活力
筛选原理 刚果红染色
纤维素生物燃料： 最有希望替代石油能源
科学家正致力于研究，怎样将 农业废弃物、木材及生长更为迅 速的草本植物，转化为种类繁多 的生物燃料（甚至是航空燃油）。
课题3 分解纤维素的微生物的分离
（一）纤维素与纤维素酶
纤维素：一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，
广泛地存在于植物的根、茎、叶等器官中。
纤维素酶：由微生物分泌的一种复合酶，包括C1酶、Cx
微生物与病毒的关系
关于病毒增殖的叙述中，正确的是（ ） A．病毒侵入宿主细胞后，合成一种蛋白质 B．病毒的繁殖只在宿主的活细胞中进行 C．病毒的繁殖以核衣壳为单位 D．在普通的培养基上能培养病毒
【解析】解答此题需从以下几方面入手分析：首先，病毒是 营寄生方式生活，必须生活在活的细胞内，不能独立生活， 所以在普通的培养基上不能生活。第二，繁殖时，病毒的核 酸进入宿主细胞，利用宿主的成分合成子代个体，除了核衣 壳，还应包括该病毒的其他结构。合成的蛋白质不只是一种， 应该是多种，包括多种结构蛋白质及物质合成时所需的多种 酶。 【答案】B
提示： 自变量为培养基的种类，即完全培养基和选择培养基。 可用完全培养基做对照,或将纤维素改为葡萄糖。
说明：分析“纤维素分解菌的选择
培养基配方”可知，该配方中的酵母膏也 能够提供少量的碳源，因此其他微生物也 能在该培养基中生长繁殖。但因酵母膏的 含量极少，因此，只有以纤维素为碳源的 微生物才能大量繁殖。
为什么选择培养能够“浓缩”所需微生物？
在选择培养的条件下，可以使那些 能够适应该营养条件的微生物得到迅速 繁殖，而那些不适应这种营养条件的微 生物的繁殖被抑制，因此可以起到“浓 缩”的作用。
3.梯度稀释
按照课题1的稀释操作方法，将选择培养后 的培养基进行等比稀释101～107倍。
101
102
103
思考：本实验课题2中的实验流程有哪些异同？
课题2将土样梯度稀释液直接涂布在以尿素为唯 一氮源的选择培养基上，分离并统计菌落。
本课题先选择培养，使纤维素分解菌得到增殖 后，再稀释涂布在鉴别培养基上，挑选菌落。
土壤 取样
选择 培养
梯度 稀释
将样品涂 布到鉴别 培养基
挑选 菌落
什么 样的 环境
① 培养的目的? ②选择培养基的 特点?
实验回顾
土壤 取样
选择 培养
梯度 稀释
将样品涂 布到鉴别 培养基
什么 样的 环境
① 培养的目的? ②选择培养基的 特点?
①鉴别培养基 特点? ②如何鉴别?
取样?
根据：微生物 增加纤维素分解菌 wenku.baidu.com固体
对生存环境的 要求，到相应 环境中去找；
浓度，确保能够从 样品中分离到纤维 素分解菌；
培养基
刚果红 染色法
②讨论:如果找不到合适的环境，可以将滤纸 埋在土壤中，将滤纸埋在土壤中有什么作用？ 你认为滤纸应该埋在土壤中多深？
将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对集中， 实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。一 般应将滤纸埋于深约10cm左右的土壤中。
2、选择培养 ①目的：
增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从 样品中分离所需要的微生物。
酶和葡萄糖苷酶，由于它们的协同作用，最终将纤维素分
解成葡萄糖。
纤维素
C1酶 Cx酶
纤维二糖
葡萄糖 苷酶
葡萄糖
实验：纤维素酶分解纤维素的实验
①取二支20mL的试管 ②各加入一张滤纸条 ③各加入10mL0.1mol/L的醋酸－
醋酸钠缓冲液 ④在甲试管中加入1mL蒸馏水，
乙试管加入1mL纤维素酶 ⑤将试管放在140r/min的摇床上振荡1甲h 乙
②制备选择培养基 ③操作： P29
培养基成分分析
培养基组成
提供主要的营养物质
纤维素粉 5g
碳源（能源）
NaNO3 1g
KCl
0.5g Na2HPO4·7H2O 1.2g
KH2PO4 0.9g MgSO4 ·7H2O
0.5g
酵母膏 0.5g
氮源、无机盐 无机盐
生长因子、碳源、氮源
水解酵素 0.5g
氮素、生长因子
一、实 验 设 计
请你根据实验流程图和提供的三个资料以及“操
作提示”，在思考有关问题的基础上，设计出一个
详细的实验方案。
土壤取样
* 选择培养
梯度稀释
将样品涂布在鉴别纤 维素分解菌的培养基上
筛选产生透 明圈的菌落
操作步骤
1、土壤取样：
①取样环境
富含纤维素的环境（树林中多年落叶形成 的腐殖土，多年积累的枯枝败叶等）
动物都是微生物。而一般多细胞的植物与动物
不属于微生物，如葫芦藓是苔藓植物，铁线蕨
是蕨类植物，都属于多细胞高等植物。
【答案】B
微生物营养物质
有关微生物营养物质的叙述中，正确的是（ ）
A．是碳源的物质不可能同时是氮源 B．凡碳源都提供能量 C．除水以外的无机物只提供无机盐 D．无机氮源也能提供能量
【解析】不同的微生物，所需营养物质有较大差别，要针对微 生物的具体情况具体分析。对于A、B选项，它的表述是不完 整的。有的碳源只能是碳源，如CO2；有的碳源可同时是氮源， 如NH4HCO3；有的碳源同时是能源，如葡萄糖；有的碳源同 时是氮源，还是能源，如蛋白胨。对于C选项，除水以外的无 机物种类繁多，功能也多样。如CO2可作自养型微生物的碳源； NaHCO3可作自养型微生物的碳源和无机盐；而NaCl则只能 提供无机盐。对于D选项，无机氮源提供能量的情况还是存在 的，如NH3可为硝化细菌提供能量和氮源。 【答案】D
碳源、氮源、生长因子
KH2PO4 土豆汁
0.25g 100mL
无机盐 碳源、生长因子
琼脂
15g
凝固剂
上述物质溶解后，加蒸 馏水定容至1000mL
氢元素、氧元素
5.刚果红染色法 挑选产生透明圈的菌落
即为分解纤维素的菌落。
方法一：先 培养微生物，再加入刚果红进 行颜色反应。
方法二：在 倒平板 时就加入刚果红。
培养基的种类
要从多种细菌中分离某种细菌，培养基要用（ ） A．加入青霉素的培养基 B．加入高浓度食盐的培养基 C．固体培养基 D．液体培养基 【解析】微生物的分离需使用固体培养基，由于某 种细菌的种类不明，所以难以使用选择培养基，如 加入青霉素的培养基可以分离到酵母菌和霉菌，加 入高浓度食盐的培养基可以分离到金黄色葡萄球菌。 【答案】C
溶解后，蒸馏水定容至1000mL
水
A、旁栏中的配方是液体培养基还是固体培养基？为什么？
是液体培养基，原因是配方中无凝固剂（琼脂）
B、这个培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有， 是如何进行选择的？
有选择作用，本配方中纤维素作为主要碳源，只有能 分解纤维素的微生物可以大量繁殖。
C、你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用
104
105
106
4.将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上
（1）制备鉴别培养基P29
（2）涂布平板： 将稀释度为104～106的菌悬液各取0.1ml
涂布到平板培养基上，30℃倒置培养。
鉴别纤维素分解菌的培养基
培养基组成 CMC-Na 5~10g
(水溶性羧甲基纤维素钠)
酵母膏 1g
提供的主要营养物质 碳源
液体培养基
挑选 菌落
挑选什 么样的 菌落?
挑选有 透明圈 的菌落
纯化培养
在产生明显的透明圈的菌落，挑 取并接种到纤维素分解菌的选择培 养基上，在300C－ 370C培养，可 获得纯化培养。
四、结果分析与评价
1.培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选 出菌落
对照的培养基在培养过程中没有菌落生长则说明 培养基制作合格。
纤维素：
棉花是自然 界中纤维素 含量最高的 天然产物；
纤维素是地球上含量最丰富的多糖类物质，植 物每年产生的纤维素超过70亿吨；分布植物的 根、茎、叶中；
1、在草食性动物等的消化道内，也共生有分解纤维素 的微生物，其原理也是产生纤维素酶而分解纤维素， 而人没有分解纤维素的能力。
2、农作物秸秆：米秸、麦秸、稻草、草、木屑 等富 含大量的纤维素，被利用的机会很少、效率低；
⑥结果：乙试管的滤纸条消失 讨论： 乙试管的滤纸条为什么会消失？甲试管的作用是什么？
（二）纤维素分解菌的筛选
刚果红染色法
刚果红能与像纤维素的多糖形成红色复合物， 而不与水解后的纤维二糖和葡萄糖发生该反应。
用加入刚果红的纤维素培养基去培养微生物 时，如果培养基中出现以菌落为中心的透明圈时， 可说明该菌落是纤维素分解菌，因为它已将被刚 果红 染成红色的纤维素分解了。
这两种方法各有哪些优点与不足？
染色法
优点
缺点
有透明圈的基 操作繁琐 方法一 本是能分解纤 刚果红会使菌落之间发生
维素的微生物 混杂
方法二
操作简便不 存在菌落混
杂问题
1.产生淀粉酶的微生物也 产生模糊透明圈 2.有些微生物能降解色素， 形成明显的透明圈。
思考：
方法一中NaCl溶液的作用？
漂洗作用，洗去与纤维素结合不牢的刚果红， 以免出现的透明圈不够清晰。用这方法可以判断酶 活力的大小，实际上刚果红是结合到培养基的多糖 底物，但分解纤维素的细菌可以产生纤维素酶，能 分解这个多糖底物成为单糖，这样刚果红就不能结 合上去了，氯化钠溶液就可以使结合不牢的刚果红 洗去，这样就留下大大小小的透明圈，大的透明圈 当然分解纤维素的能力就强！
前置染色法 后置染色法
实 土壤取样 验 选择培养 设 计 纯化培养
富含纤维素土壤 增大分解菌含量 染色鉴别
涂布培养 分离出分解菌
DNA重组技术
下列不属于微生物的是 ( )
A．蓝藻和蘑菇
B．葫芦藓和铁线蕨
C．噬菌体和黄曲霉 D．放线菌和变形虫
【解析】病毒、原核生物(例如细菌、放线菌、
支原体、蓝藻)、真核类的藻类和真菌及原生
如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得 了分解纤维素的微生物。
2.分离的结果是否一致 由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌
的数量，因此最容易分离得到的是细菌。但由于所取 土样的环境不同，不同同学也可能得到真菌和放线菌 等不同的分离结果。
五、课题延伸
为了确定分离得到的是纤维素分解菌， 还需要进行_发__酵__产__纤__维__素__酶实验，纤维素酶的 发酵方法有__液__体__ 发酵和__固__体__ 发酵。纤 维素酶测定方法是对纤维素酶分解滤纸等纤 维素所产生的__葡__萄__糖__ 含量进行定量测定。