产纤维素酶的筛选

二.试验目的
目前，酸性纤维素酶主要用于纤维素的水解糖化， 而碱性纤维素酶则广泛用于洗涤工业。不过，至 今所研发的纤维素酶仍存在酶活力不足等问题， 有必要挖掘新的酶资源。
三. 技术路线
产纤维素酶菌株的初筛
产纤维素酶菌株的复筛
诱变育种 测其透明圈及酶活力
优化产酶菌株的培养条件
制备酶液
产高活性纤维素酶菌株的鉴定
(5).菌株生化鉴定:采用Biolog 微生物鉴定系统进行。操作按仪 器的说明书进行。
(6).诱变育种：
●制备孢子悬液：取试管斜面，用无菌水洗下孢子，装入带 玻璃珠的三角瓶中，27℃振荡2-3h，用脱脂棉过滤后，以10倍 稀释法作一系列稀释，挑选一个稀释度，用移液管移l ml饱子 悬液到小塑料离心管中，待用。
(10).酶活力测定:以CMC钠盐为底物，测定CMC酶活力。 酶 反应体系 含粗酶液 0.5mL， CMC钠 盐 1%(g/ mL)， 0.1mol/L的Tris-HCL(pH值为8.0)缓冲液2.0 mL。50℃水 浴反应60 min，立刻用DNS法测定CMC水解所释放的葡 萄糖量。以作用CMC钠盐底物1min释放1 mg葡萄糖所 需的酶量定义为１个酶活力单位。
主讲人：何 园 学 号：2014103015 时 间：2014.11.13
1. 研究背景
讲 2. 试验目的
解 3. 技术路线
内 容
4. 试验方法 5. 预期效果
6. 参考文献
一.研究背景
纤维素作为地球上最丰富的可再生有机资源，其转化和 利用对解决能源危机、粮食短缺、环境污染等问题具有 十分重要的意义。纤维素酶是能够作用于纤维素底物β1,4葡萄糖苷键的一类生物酶的总称。由于开发利用木质 纤维资源对人类社会的今后发展具有重大意义，而纤维 素酶对纤维素资源的开发起到极为关键的作用，对其研 究一直是国内外的热点。纤维素代谢也是地球生物圈碳 素循环的重要组成部分，寻找和开发高产纤维素酶菌种 ，是充分利用纤维素资源的关键。
●紫外(UV)诱变方法：距离紫外灯30cm左右照射60s、70s、 80s、90s、100 s，并不断摇动。
● 硫 酸 二 乙 酯 (DES) 诱 变 方 法 : 分 别 吸 取 1ml 孢 子 悬 液 10ulDES(终浓度为1%)和30ul乙醇溶液于一小塑料离心管中， 于30℃水浴振荡45min、60min、75min，处理完毕后加入30ul 25%的硫代硫酸钠溶液终止反应。
(3).菌株的形态观察：LB培养基培养的菌体用革兰 氏染色，显微镜观察菌株形态。
(4). 分 子 鉴 定 ： 提 取 菌 体 DNA(CTAB 法 ) ， 以 该 基 因 组 DNA为模板，采用通用引物27F/1492R，PCR扩增菌株的 16SrRNA序列。PCR产物用琼脂糖凝胶电泳检测、分离， 然后用Agarose Gel DNA Purification Kit 试剂盒切胶回收， 用T4 ligase连接到Pmd-18T载体上。将带有目的片段的载 体通过转化E.coli DH 5α菌株扩增培养后，选择阳性克隆 提取质粒测序。将测序得到的16S rRNA序列用NCBI的 BLAST2.0进行同源分析，搜索Genebank核酸数据库，根 据比对结果对菌株进行分子鉴定。
(11).比较诱变菌株与原菌株的酶活力。
(12).绘制菌株生长曲线与产酶曲线图:以最适的pH, 温度 条件培养产酶菌株，每隔4 h 取一次发酵液，测定OD600 值与纤维素酶活力，绘制菌株生长曲线与产酶曲线图。
研源自文库进展：
该类酶上世纪40年代首次被发现。早期发现的纤维素 酶主要由丝状真菌的木霉、根霉等菌种产生，通常为酸 性 酶其最适作用pH值在3-5，在碱性条件下基本没有酶 活或活力很低。上世纪70年代，在嗜碱性的枯草芽孢杆 菌(Bacillus sp. N-4 和 Bacillus sp.1139 菌株)中发现了最 适作用pH在碱性范围的纤维素酶，即碱性纤维素酶。随 后发现芽孢杆菌属(Bacillus)和链霉菌属(Streptomyces) 的数十株嗜碱性菌株均能够产生碱性纤维素酶，此外， 动物源碱性纤维素酶开始被报道，并成为开发碱性纤维 素酶的重要方向。
测定酶活力
比较两种菌株酶活力 菌株形态观察 菌株分子鉴定 菌株生化鉴定
绘制菌株生长曲线和产酶曲线图 确定产纤维素酶菌株的属种
测定CMC酶的最适作用条件
四.试验方法
1. 材料和仪器
(1).用于菌株分离的样品采自畜禽堆肥。
(2).所用培养基：LB培养基、CMC-刚果红平板筛选培
养基、CMC液体发酵培养基、Bug培养基
● UV-硫酸二乙酯(DES)复合诱变
(7) .测定诱变后菌株的透明圈并将其菌株发酵测其酶活 力。
(8).菌株生长及产酶特性测定:活化菌株接种CMC发酵培 养基，接种量5％，30℃、200rpm下培养，定时取样测定 培养液的OD600和CMC酶活力，观察菌株生长和产纤维素 酶情况，绘制菌株生长曲线与产酶曲线图。优化菌株的 培养条件，对3-12的pH值条件以及25-37℃温度条件下菌 株生长也进行观察。
(9). 酶液制备:活化菌株接种CMC发酵培养基30℃、200 rpm培养48 h，取培养液，4℃，4000 rpm离心10 min，取 上清，55%(NH4)2SO4溶液沉淀粗蛋白,4℃，10000 rpm离 心10 min，收集沉淀，加入培养液同体积的pH值8.0，0.1 mol/L的Tris-HCL缓冲液溶解，４℃保存，用于测定酶的 活力，2 d内使用。
(3).仪器:菌种鉴定96孔板
2.方法
(1).菌株初筛：取样品1 g，加10 mL无菌蒸馏水，充分 振摇，静止30 min，取上清液稀释105倍，涂布接种 CMC-刚果红平板筛选培养基，30℃培养72 h至菌落长 出，挑取透明水解圈较大的菌落。
(2).菌株复筛：挑取透明水解圈较大的菌落，接种 CMC液体发酵培养基，37℃、200rpm摇瓶培养24 h， 测定培养液的碱性CMC酶活力，选取活力最高的培 养瓶，取菌液划线接种CMC-刚果红平板筛选培养基 培养，纯化菌种３次，最后得到产碱性纤维素酶的 高产菌株，命名，斜面和冷冻干燥保藏。