产纤维素酶菌种的筛选与优化
产纤维素酶细菌的筛选及培养
产纤维素酶细菌的筛选及培养一、筛选步骤1、菌种的采集采集山上距湿润的表层10cm处的土壤样本40g左右，用研钵研成粉末称取1g样本加入灭菌的250mL锥形瓶中，加入99mL无菌水摇匀静置。
2、菌种初筛（1）按照配方配制200mL CMC培养基，取1 X 250mL空锥形瓶和6 X 15mL试管，塞上棉塞并用报纸、棉线包扎，用报纸、棉线将试管包扎成一捆；取12套培养皿码齐包扎。
将上述器材与培养基、无菌水121℃高压蒸汽灭菌20min。
（2）于无菌台上倒9个CMC培养基备用。
（3）另取6支15mL经灭菌的试管，用移液枪吸取土壤溶液（上清液）1.000mL加入1号试管，加无菌水9.000mL。
混匀后吸取1.000mL 加入2号试管，重复上述操作，进行6次梯度稀释。
（4）待CMC培养基冷却后，在超净工作台分别吸取104、105、106倍稀释液0.100mL于CMC培养基上稀释涂布，每种稀释液涂布三份。
（5）将上述培养基置于37℃培养箱中培养24小时，标记菌落并记录各菌落形态（菌落高度、质地、颜色、气味、着生状态、边缘及表面纹理等）。
（6）配制200mL刚果红家别培养基，与三套培养皿一起121℃灭菌20min。
（7）在无菌操作台上倒3个鉴别培养基备用。
（8）将各菌落用牙签接种到冷却了的刚果红鉴别培养基上，37℃培养24h，挑选5株透明圈直径与菌落直径比最大的菌株进行摇瓶复筛。
3、菌种复筛（1）配制500mL基础发酵培养基，分装到5只250mL的锥形瓶中，121℃高压蒸汽灭菌20min。
（2）将初筛得到的菌株用接种环接种于液体培养基上（2环），37℃、150r/min下培养2—3天，转入4℃冰箱保藏。
二、培养方法1清洗实验器具2灭菌3配培养基（纤维素作唯一能量源的培养基）4倒平板 +选择培养原菌（可能会用摇床）5稀释菌样6涂布平板或平板划线7放入恒温箱（调制均适宜的温度）12-24h ，之后就可以收获细菌了8观察记录（数量、分布等）三、培养基种类及其组成1、初筛CMC培养基：CMC 5g、蛋白胨1 g、FeSO4·7H2O 0.005 g、NaCl 0.25g、琼脂粉10g 于1000mL锥形瓶中加蒸馏水至500mL、调节pH 7．2～7．6，加棉塞121℃灭菌20min。
菌株产纤维素酶的活力
菌株产纤维素酶的活力纤维素酶是一种能够降解纤维素的酶类，具有广泛的应用价值。
菌株产纤维素酶的活力是评价菌株纤维素降解能力的重要指标之一。
本文将探讨菌株产纤维素酶活力的相关内容。
一、菌株的筛选与培养菌株的筛选是寻找具有高纤维素酶活力的菌株的过程。
常用的筛选方法包括土壤样品的采集和分离、菌株的纤维素酶活力测定等。
通过这些方法，可以获得具有较高纤维素酶活力的菌株。
在菌株的培养过程中，培养基的选择和培养条件的优化对于提高菌株产纤维素酶活力至关重要。
常用的培养基包括纤维素、木质素等。
同时，适宜的温度、pH值和培养时间等因素也会对菌株产纤维素酶活力产生影响。
二、菌株产纤维素酶活力的测定菌株产纤维素酶活力的测定是评价菌株纤维素降解能力的重要手段。
常用的测定方法包括滤纸酶活力测定法、纤维素酶活力测定法等。
这些方法通过测定菌株产生的纤维素酶对底物的降解能力，来评估菌株的纤维素酶活力水平。
三、影响菌株产纤维素酶活力的因素菌株产纤维素酶活力受到多种因素的影响。
其中，培养条件是影响菌株产纤维素酶活力的重要因素之一。
适宜的温度、pH值和培养时间等条件可以提高菌株产纤维素酶活力。
此外，底物浓度、氮源和碳源等也会对菌株产纤维素酶活力产生影响。
四、提高菌株产纤维素酶活力的方法为了提高菌株产纤维素酶活力，可以采取多种方法。
一种常用的方法是通过菌株的遗传改良来提高其产酶能力。
通过选择和诱变等手段，可以获得具有较高纤维素酶活力的菌株。
此外，优化培养条件和添加适当的辅助物质也可以提高菌株产纤维素酶活力。
五、菌株产纤维素酶活力的应用菌株产纤维素酶活力的应用广泛。
纤维素酶可以用于纤维素的降解和转化，从而产生生物燃料、生物质材料等。
此外，纤维素酶还可以应用于食品工业、饲料工业和纺织工业等领域。
六、结论菌株产纤维素酶的活力是评价菌株纤维素降解能力的重要指标。
通过筛选合适的菌株、优化培养条件和提高菌株产纤维素酶活力的方法，可以获得具有较高纤维素酶活力的菌株。
产纤维素酶菌种的筛选与优化
产纤维素酶菌种的筛选与优化一、菌种筛选的原理与方法菌种筛选的原理是通过筛选产纤维素酶活性高、产量大的菌种。
常用的菌种筛选方法有以下几种：1.传统菌种筛选：分离环境中的纤维素降解菌株，通过纤维素酶活性测定筛选产纤维素酶能力较强的菌株，再通过多次温育和活性测定，逐步筛选出高活性的菌株。
2.显性菌种筛选：利用纤维素酶结构上保守的区域设计引物，在环境DNA中扩增出纤维素酶基因片段，使用这些基因片段进行克隆构建，然后在宿主中进行表达，通过纤维素酶活性测定筛选产纤维素酶能力较强的菌株。
3.基因工程菌种筛选：利用已知纤维素酶的基因进行基因工程，通过载体导入宿主细胞中，通过外源表达基因，从而获得产纤维素酶菌种。
二、菌种优化的原理与方法菌种优化的原理是通过改变菌株基因组或环境条件，提高纤维素酶产量和活力。
常用的菌种优化方法有以下几种：1.自然进化优化：通过长期培养，逐渐挑选出产酶能力强、极端环境适应能力强的突变菌株。
2.诱变优化：利用物理、化学或基因工程等方法对菌株进行诱变，通过筛选获得产纤维素酶能力强、菌株稳定的变种。
3.基因工程优化：利用已知纤维素酶的基因进行基因编程，通过基因工程技术对菌株基因组进行改造，以提高纤维素酶的产量和活力。
三、未来的研究方向1.菌种筛选方法的改进与创新：应综合运用传统筛选、显性筛选和基因工程筛选等方法，发展新的高效、快速的菌种筛选方法。
2.菌种优化技术的优化与提高产量、活性：要通过生理、代谢工程的方法改造纤维素酶产生菌，提高纤维素酶的产量和活力。
3.开发新型纤维素酶菌株：从不同环境中分离筛选出产酶能力强的菌株，进一步发现和研究产纤维素酶的新菌株。
4.提高纤维素酶产量与废弃物转化率的研究：将纤维素酶应用于废弃物转化过程，提高纤维素酶产量和转化率。
综上所述，产纤维素酶菌种筛选与优化的研究是促进纤维素酶应用的关键。
通过不断改进筛选和优化方法，进一步开发新的菌种，提高纤维素酶的产量和活力，将对纤维素酶的应用产生积极的推动作用。
产纤维素酶菌及其筛选改良方法研究进展
产纤维素酶菌及其筛选改良方法研究进展纤维素是由纤维素素和半纤维素组成的天然高分子化合物，在工业和生活中具有广泛的应用。
纤维素酶是一种专门分解纤维素的酶，在纤维素利用和生物质转化等领域有着广泛的应用前景。
本文综述了产纤维素酶菌及其筛选改良方法的研究进展。
一、产纤维素酶菌的筛选和鉴定目前，已有许多研究对产纤维素酶菌进行筛选和鉴定，其中常用的方法包括传统的分离培养方法、高通量筛选系统和基于基因组的筛选方法等。
1.传统的分离培养方法传统的分离培养方法通常包括从不同的环境样品中分离出细菌，并对其进行酶活性测定。
通过该方法已经成功分离出具有纤维素酶活性的微生物，例如Clostridium sp.、Bacillus sp.、Cellulomonas sp.、Acidothermus cellulolyticus等。
2.高通量筛选系统高通量筛选系统是一种快速且高效的筛选方法，常用于从大量的微生物中沉淀出目标细菌。
常用的高通量筛选方法包括微流控装置、免疫分离、荧光筛选和高通量发酵等。
3.基于基因组的筛选方法基于基因组的筛选方法是一种新的筛选方法，它能够根据基因组数据精确地预测目标细菌的性能和代谢特性。
通过依据基因组组态图，可以预测细菌所需的碳水化合物、氮素源、维生素和微量元素等。
并通过基因搜索和蛋白质分析，可以确定特定的酶基因并对其进行驯化研究。
二、纤维素酶菌的改良方法针对传统纤维素酶菌的低效率和耐受性差等问题，研究人员采用不同的改良方法提高纤维素酶的效率和性能。
常用的改良方法包括基因工程技术、筛选和驯化适应性强的菌株、应用生物物理方法提高纤维素酶的结构稳定性等。
1.基因工程技术基因工程技术是一种常见的改良方法，它通过基因重组或突变来优化目标细菌的代谢功能。
例如，利用多肽链替换可以改变纤维素酶的空间结构，提高酶的催化能力。
基因重组还可以将来自不同细菌的多个酶基因组合，形成多功能细菌产生多种酶的机构，提高纤维素降解效率。
纤维素酶高产菌株的选育
纤维素酶高产菌株的选育
纤维素酶是一种能够分解纤维素的酶，对生物质的利用具有重要意义。
选育纤维素酶高产菌株是提高纤维素酶生产效率的关键。
以下是一些选育纤维素酶高产菌株的常用策略和方法：
1. 采用自然筛选法：从自然环境中采集植物残渣、堆肥等具有高纤维素含量的样品，通过培养和筛选获取纤维素酶高产菌株。
这种方法的优势是能够发现具有适应性强、高纤维素酶产量的菌株。
2. 遗传工程法：通过对已知具有高纤维素酶产量的菌株进行基因工程改造，引入其他有利于纤维素酶产量提高的基因或突变体。
3. 诱变法：通过化学物质（如EMS、亚硝酸钠等）或辐射（如紫外光、X射线等）处理菌株，诱发基因突变，筛选出纤维素酶高产突变菌株。
4. 基因筛选法：通过分析纤维素酶基因的表达水平和调控机制，筛选具有高纤维素酶基因表达水平和调控机制的菌株。
5. 代谢工程法：通过改造代谢途径，优化产生纤维素酶所需的底物和能量供应等因素，提高纤维素酶产量。
以上方法可根据实验室条件和研究目的选择合适的方法进行选育纤维素酶高产菌株。
产纤维素酶菌及其筛选改良方法研究进展
产纤维素酶菌及其筛选改良方法研究进展引言：纤维素酶是一类能够降解纤维素的酶，能够将纤维素水解成可溶性的糖类物质。
这种酶类在生物能源、生物制造等领域具有重要的应用价值。
产纤维素酶的菌种及其筛选改良方法的研究，对提高纤维素降解效率、降低生产成本、推动生物能源利用具有重要意义。
本文将介绍产纤维素酶菌及其筛选改良方法的研究进展。
一、产纤维素酶菌的分类和特点产纤维素酶的菌种多样，主要包括真菌和细菌两大类。
真菌包括木霉属、曲霉属、青霉属等；细菌则主要包括纤维素降解细菌和纤维素生产细菌等。
产纤维素酶菌的特点主要表现在对纤维素的降解效率和产酶条件的适应性上。
一方面，有些产纤维素酶的菌种能够高效降解纤维素，产酶量大，并且在生长环境下对温度、pH等条件的适应性较强，能够在广泛的生境中生长；有些产纤维素酶的菌株则对产酶条件相对苛刻，需要较为特殊的生产条件。
二、产纤维素酶菌的筛选方法为了提高产纤维素酶菌的降解效率和提高其生产水平，需要对产纤维素酶菌进行筛选和改良。
在筛选产纤维素酶菌的过程中，可以通过以下几种方法进行：1. 采用纤维素为唯一碳源的筛选培养基。
利用富含纤维素的培养基，能够筛选出对纤维素降解能力较强的菌株。
2. 通过间接检测法筛选。
可以利用纤维素水解产生的可溶性糖类物质来间接检测纤维素酶的产生情况，从而筛选出产酶量较高的菌株。
3. 利用分子生物学方法筛选。
通过利用特定基因的特异性引物，进行PCR扩增和RFLP分析，还可以利用荧光原位杂交技术等手段，对产纤维素酶的菌株进行筛选和鉴定。
4. 通过连续培养或连续发酵系统，对菌株进行长期的驯化和培养，增加产酶菌株的产酶能力。
三、产纤维素酶菌的改良方法在筛选出具有较高产酶能力的菌株之后，需要对这些菌株进行改良，以提高其产酶能力和降解效率。
产纤维素酶菌的改良方法主要包括以下几种：1. 通过传统的诱变选择法，对产纤维素酶菌株进行诱变处理，产生新的突变型菌株，以提高产酶效果。
(整理)产纤维素酶菌种的筛选与优化.
目录实验一产纤维素酶菌种的分离与初筛实验二产纤维素酶菌种的复筛与保藏实验三酶活测定与传代保藏实验四产纤维素酶菌种的紫外诱变育种实验五产纤维素酶菌种的产酶条件优化实验六产纤维素酶菌种的产酶条件优化的结果分析实验一产纤维素酶菌种的分离与初步鉴定一、实验目的1．了解产纤维素酶微生物分离的基本原理；2．掌握产纤维素酶微生物分离的操作方法。
二、实验原理自然界中存在大量的纤维素类物质，同时存在着很多能分解纤维素类物质的生物，小到细菌、放线菌、真菌，大到一些食草类昆虫与动物。
这些生物与绿色植物一起构成了这个世界的碳循环。
在发酵堆肥中，存在着大量的，耐高温的纤维素分解菌株，但多半都为混合分解，菌种需要：1.内切型葡萄糖苷酶（endo-1,4-β-D-glucanase,EC3.3.1.4,简称EBG），也称Cx酶、CMC酶、EG。
这类酶作用于纤维素分子内部的非结晶区，随机识别并水解β-1,4-糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量非还原性末端的小分子纤维素；2.外切型葡萄糖苷酶（exo-1,4-β-D-glucanase,EC3.2.1.91），也称C1酶、微晶纤维素酶、纤维二糖水解酶（Cellobiohydrolase,简称CBH）,这类酶从纤维素长链的非还原性末端水解β-1,4-糖苷键，每次切下纤维二糖分子；3.Β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，EC3.2.21，简称BG）又称纤维二糖酶，它能水解纤维二糖以及短链的纤维寡糖生产葡萄糖，对纤维二糖和纤维三糖的水解很快。
随着葡萄糖聚合酶的增加水解速度下降，这种酶的专一性比较差。
只有三种酶的协同作用，才能较好的分解纤维素。
就单菌落而言，霉菌如木霉、曲霉和青霉的总体酶活性较高，产量大，故在畜牧业和饲料工业中的应用的纤维素酶主要是真菌纤维素酶。
本实验以羟甲基纤维素钠为唯一碳源的培养基作为筛选培养基，只有能够水解纤维素成单糖并加以利用的微生物才能在筛选培养基上生长，利用筛选培养基分离产纤维素酶的微生物。
纤维素酶产生菌的分离和筛选专业大实验
纤维素酶产生菌的分离和筛选方案目标：从自然界采用选择性分离的方法，获得纤维素酶的高产菌株。
意义：把含纤维的自然资源及纤维废料加以充分利用，转化成糖类作为食品工业和发酵工业的原料或制成优质饲料，具有深远的现实意义。
1.材料与方法1.1材料与仪器1.1.1原辅料土壤品来自南阳理工学院以下各处离地表3-8cm深处泥土装入塑料瓶中，带回实验室处理。
（1）新校区竹林腐叶下的土壤（2）校门口东边的松树林腐叶子下的土壤（3）青年公寓外小树林（4）2号教学楼后面花园的土壤1.1.2试剂羧甲基纤维素CMC、NaCl、MgS04·7H20、KH2P04、酵母浸粉、蛋白胨、蒸馏水、琼脂、Na2HP04、酵母膏、刚果红试剂。
1.1.3仪器小铁铲和无菌纸或袋（可省）、小烧杯、100ml量筒、滤纸、漏斗、棕色试剂瓶、1000ml三角烧瓶1个、500ml三角烧瓶1个、试管24个、高压蒸汽灭菌锅、培养皿24个、36支1mm无菌吸管、无菌玻璃涂棒12支、显微镜、无菌水。
1.2培养基及试剂的配制1.2.1培养基配制初筛培养基A：羧甲基纤维素CMC 20g、NaCl 5．0g、MgS04·7H20 0．2g、KH2P041．0g、酵母浸粉 5.0g、蛋白胨10g、蒸馏水1000mL、琼脂20g，pH自然，121℃湿热灭菌20min。
复筛培养基B：CMC 10g、Na2HP04 1.25g、KH2P040.75g、MgSO4·7H2O 0.1g、蛋白胨1.25g、酵母膏O.25g、蒸馏水500mL、琼脂10g，pH自然，121℃灭菌20min。
2.2.2试剂配制1％刚果红试剂：称取刚果红试剂1g于干净的小烧杯中，用量筒量取蒸馏水100ml使之溶解，过滤，贮于棕色试剂瓶中。
2.3方法2.3.1初筛的方法步骤(1)配初筛培养基A，灭菌，倒平板。
(2)用稀释涂平板的方法分离纤维素分解菌。
稀释涂布平板法步骤：A．倒平板将配好的琼脂培养基溶化，待冷至55—600C时，用右手持盛培养基的三角烧瓶，置火焰旁边，左手拿平皿并松动瓶盖，用手掌边缘和小指、无名指夹住拔出，瓶口在火焰上灭菌，然后左手将培养皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约15ml，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布，平置于桌面上，待冷凝后即成平板。
菜地土壤中纤维素降解菌的筛选及其产酶条件优化
菜地土壤中纤维素降解菌的筛选及其产酶条件优化1. 引言1.1 研究背景菜地土壤中的纤维素降解菌是一类具有潜在应用价值的微生物资源。
纤维素是植物细胞壁的主要结构组分，由纤维素酶降解可以释放出储存在其中的碳源，为微生物的生长提供能量。
纤维素降解菌在资源化利用方面具有重要意义。
随着环境污染和能源危机的日益严重，利用微生物对植物纤维素进行高效降解已成为当前研究的热点之一。
菜地土壤中自然存在着大量微生物群落，其中可能潜藏着具有高效纤维素降解能力的菌株。
通过对菜地土壤中的微生物群落进行筛选和鉴定，可以发现一些潜在的纤维素降解菌。
这些菌株可能具有特殊的降解能力和适应性，在优化的产酶条件下可以获得更高的酶产量，为纤维素降解技术的进一步应用提供支持。
对菜地土壤中纤维素降解菌的筛选及产酶条件优化的研究具有重要的理论和应用意义。
通过深入探究纤维素降解菌的机理和特性，可以为资源化利用提供新的思路和方式。
1.2 研究目的研究目的是针对菜地土壤中潜在的纤维素降解菌进行筛选，通过优化产酶条件来提高纤维素酶的产量和活性。
通过研究纤维素降解菌的产酶机理，探讨其在纤维素降解过程中的作用机制，并展望其在生物质能源、环境保护和农业生产中的应用前景。
本研究还将对菜地土壤中纤维素降解菌的分子生物学特性进行深入研究，为揭示其种属特征、代谢途径和遗传变异提供依据。
综合考虑以上目的，本研究旨在为纤维素降解菌的筛选及产酶条件优化提供科学依据，推动其在资源化利用和环境保护领域的应用与推广。
1.3 研究意义纤维素是一种广泛存在于植物细胞壁中的多糖物质，是地球上最丰富的可再生生物质资源之一。
而纤维素的高效降解一直是生物资源化利用的重要研究方向。
菜地土壤中纤维素降解菌的筛选及其产酶条件优化研究，对于挖掘和利用纤维素降解菌具有重要的意义。
寻找能够高效降解纤维素的细菌菌株，有助于提高纤维素的利用效率，减少资源浪费，同时也有利于环境保护和生态平衡的维持。
通过优化产酶条件，提高纤维素降解菌产酶量和酶活力，不仅可以降低生产成本，还可以提高纤维素降解效率，加速生物资源转化与再利用的进程。
纤维素酶产生菌的筛选-鉴定和产酶条件优化
纤维素酶产生菌的筛选\鉴定和产酶条件优化摘要:采用稀释平板法分离马铃薯瓢虫肠道菌,利用刚果红平板法对产纤维素酶菌株进行初筛,选取透明圈较大的菌株进行摇瓶发酵复筛,根据菌株形态､生理生化特征对菌株进行初步鉴定,通过正交法优化产酶条件｡结果表明,经初筛和复筛得到1株酶活相对较高的菌株B-12,经初步鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)｡1.25%麦芽浸粉为碳源､1.5%KNO3为氮源､0.2%的NaCl､0.1%的CMC-Na､接种量6%､培养时间44 h为B-12产酶的适宜条件｡优化后发酵液中的内切葡聚糖酶活(CMCA)为111.710 U/mL,较培养44 h后的酶活提高了8.78%;滤纸酶活(FPA)为35.017 U/mL,提高了387.23%;β-葡萄糖苷酶酶活(BGL)为116.799 U/mL,提高了700.38%｡关键词:马铃薯瓢虫;肠道菌;纤维素酶;优化Screening,Identification and Cultural Condition Optimization of Cellulase-producing Strains from the Intestine of Henosepilachna vigintioctomaculata Abstract: The bacteria from the intestine of Henosepilachna vigintioctomaculata were isolated through the pour plate method. They were preliminarily screened using Congo red medium plate method, and then screened according to their cellulase activities by flask shaking fermentation method. The strain was identified based on morphological and physiological characters. In addition, the culture substrates and fermentation conditions were optimized by orthogonal experiment method. A high cellulase-producing strain B-12 was screened from the intestine of H. vigintioctomaculata and it was identified as Bacillus sp.. The best culture conditions were as follows: substrate were 1.25% malt meal, 1.5% KNO3, 0.2% NaCl, and 0.1% CMC-Na, inoculation quantity was 6%, culture time was 44 h. In this condition, the enzyme activity of CMCase, filter paper enzyme (FPA), and β-glucosidase (BGL) were 111.710, 35.017, and 116.799 U/mL respectively, which were 8.78%, 387.23% and 700.38% higher than those of the initial strain respectively.Key words: Henosepilachna vigintioctomaculata; intestinal bacteria; cellulase; optimization地球上的生物资源主要来自光合生物,其中90%以上为木质纤维素类物质,它们代表了生态系统中营养金字塔最庞大的基层[1]｡天然的木质纤维素材料含有纤维素､半纤维素和木质素等｡其中纤维素是地球上最丰富的多糖物质,这类物质是植物细胞壁的主要成分,也是地球上最廉价的可再生资源｡另外,人类活动产生的废弃物中也含有大量的纤维素[2]｡目前,人们对纤维素的降解和利用主要通过纤维素酶的分解来实现｡纤维素酶在再生能源利用方面具有广阔的应用前景,可应用于农业､酿造工业､发酵工业､食品工业以及其他领域[3-9]｡因此研究纤维素酶有着十分重要的意义｡昆虫肠道菌是指能定植于昆虫肠道的微生物,包括土著的昆虫肠道菌和能定植于昆虫肠道环境的微生物[10]｡研究表明一些昆虫肠道菌能帮助昆虫消化食物[10]｡对喜食含纤维素食物的昆虫,我们推测其消化纤维素可能与其肠道菌分泌纤维素酶有关｡马铃薯瓢虫主要为害茄科植物,喜食茄科植物叶片,它消化叶片中的纤维素可能与其肠道菌有关｡本试验从马铃薯瓢虫肠道中分离筛选产纤维素酶菌株并对其产酶条件进行优化,旨在为发现新的纤维素酶高产菌株奠定基础｡1材料与方法1.1材料1.1.1菌株采自浙江省金华市婺城区高村附近马铃薯田地的马铃薯瓢虫肠道中的菌株｡1.1.2培养基①菌种保藏培养基:牛肉膏蛋白胨培养基(牛肉膏0.30%,蛋白胨1.00%,NaCl 0.50%,琼脂 1.50%~2.00%,pH值7.4~7.6)｡②初筛培养基:米糠2.00%,NaCl 0.10%,K2HPO4 0.50%,MgSO4·7H2O 0.02%,(NH4)2SO4 0.06%,琼脂1.50%~2.00%,pH值7.0~7.2｡③刚果红纤维素鉴定培养基:羧甲基纤维素钠(CMC-Na)0.30%,NaCl 0.50%,牛肉浸膏0.15%,蛋白胨0.50%,琼脂1.50%~2.00%,pH值7.0~7.2｡④种子培养液:酵母膏 1.00%,蛋白胨 1.00%,NaCl0.50%,CMC-Na 0.50%,pH值7.0~7.2｡⑤液体产酶发酵培养液:配方同种子培养液｡⑥鉴定用培养基:糖发酵试验培养基､葡萄糖蛋白胨水培养基､蛋白胨水解培养基､Simons氏柠檬酸盐培养基､明胶水解试验培养基等｡1.1.3主要试剂葡萄糖､pH值4.6的醋酸缓冲液､DNS､2% CMC-Na底物溶液､0.05%水杨苷的醋酸缓冲液､蛋白胨､牛肉膏等｡1.1.4主要仪器立式电热压力蒸汽灭菌锅,上海中安医疗器械厂生产;LRH-250生化培养箱,上海一恒科技有限公司生产;D-78532台式冷冻离心机,德国Hettich 公司生产;UV-7504紫外可见分光光度计,上海欣茂仪器有限公司生产;SW-CJ-1B 型单人单面净化工作台,苏州净化设备有限公司生产;电子天平,赛多利斯科学仪器(北京)有限公司生产;HH-4数显恒温水浴锅,山东鄞城科源仪器设备厂生产;远红外快速恒温干燥箱,上海跃进医疗器械厂生产｡1.2方法1.2.1纤维素酶产生菌的分离､纯化和初筛马铃薯瓢虫饥饿24 h后,无菌条件下在75%酒精中表面消毒2 min,去离子水漂洗3次,采用稀释平板法分离肠道菌｡待菌长出后用无菌牙签挑选单菌落于刚果红纤维素鉴定培养基上影印2~3皿,37℃下培养2~3 d｡取其中1皿采用刚果红染色法鉴定其产酶能力[11]｡对产生透明圈的菌株进行测量并记录D/d值(D为透明圈直径,d为菌落直径,下同),挑选D/d值大于1的菌株作为初筛菌种,通过连续划线法,分离纯化｡得到的初筛菌株转接到保藏斜面,4℃条件下保藏备用｡1.2.2纤维素酶产生菌的复筛将初筛到的菌株活化后接种于30/250 mL(250 mL 三角瓶装30 mL培养液,下同)种子培养基中,37℃､180 r/min摇床培养过夜｡以2%接种量转接于30/250 mL产酶培养基中,37℃､180r/min培养2~3 d,10 000 r/min冷冻离心10 min,取上清液测定酶活,筛选产纤维素酶最高的菌株｡1.2.3酶活力测定测定方法参照文献[12-16]修正得到｡1)标准曲线绘制｡反应的总体系为3.5 mL,1 mg/mL葡萄糖溶液和去离子水共2 mL,DNS试剂1.5 mL｡取10支试管编号分别为1~10｡分别吸取0､0.2､0.4､0.6､0.8､1.0､1.2､1.4､1.6､1.8 mL葡萄糖溶液至1~10号试管中;然后分别吸取2.0､1.8､1.6､1.4､1.2､1.0､0.8､0.6､0.4､0.2 mL去离子水至相应的1~10号试管中｡向1~10号试管中分别加入1.5 mL DNS试剂｡将上述试管一同沸水浴5 min,冷却后稀释至10 mL,在540 nm下用分光光度计测吸光值,绘制葡萄糖标准曲线｡2)内切葡聚糖酶活力(CMCase activity,CMCA)测定｡取4支干净试管,编号(分别为1~4)后加入1.5 mL底物溶液,并向1号试管中加入1.5 mL DNS溶液以钝化其中的纤维素酶,作为空白对照,比色调零｡4支试管置于50℃水浴中预热5 min,再加入0.5 mL酶液(液体发酵液的离心上清液),50℃水浴30 min后立即向2､3､4号试管加入1.5 mL DNS溶液以终止酶反应｡充分摇匀后沸水浴5 min,取出冷却后,加入去离子水定容至10 mL,充分混匀｡以1号试管为空白对照,540 nm测吸光值,2､3､4号3支试管数值取平均值｡3)滤纸酶活力(FPA)测定｡方法同上,将底物溶液换成1 mL缓冲液和50 mg滤纸,加入的酶液量为1 mL,反应时间为1 h｡4)β-葡萄糖苷酶活力(BGL)的测定｡方法同上,将底物溶液换成1.5 mL含0.05%水杨苷的醋酸缓冲液,反应时间为1 h｡5)酶活定义｡在上述条件下,1 mL粗酶液所产生的1 μg葡萄糖定义为一个酶活力单位(U)｡以上的测定中均已扣除了粗酶液中所含有的还原糖量｡1.2.4产纤维素酶菌株的鉴定①菌株的形态特征:菌株平板培养2~3 d,观察菌落形态特征,菌体形态经染色(革兰氏染色､鞭毛染色､芽孢染色等)后,于显微镜的100倍油镜下观察并照像｡②菌株的生理生化特性:生理生化试验包括糖发酵试验､V. P试验､甲基红试验､吲哚试验､柠檬酸盐利用试验､淀粉水解试验､明胶水解试验等｡1.2.5产酶条件的优化对复筛得到的菌株进行产酶条件的优化试验｡1)摇瓶生长曲线的测定｡在基础培养基的基础上,对复筛得到的菌株测定其在摇瓶培养中的生长曲线和产酶曲线,考察菌体生长状况与菌株产酶能力在时间上的相关性｡2)接种量的确定｡将培养12 h的种子液分别以1%､2%､3%､4%､5%､6%､7%､8%､9%､10%､11%､12%､13%､14%､15%､16%的接种量转接入30/250 mL产酶培养基中,置于37℃,180 r/min摇床培养,测定酶活,考察不同接种量对菌株产酶的影响｡3)培养基成分的优化｡①碳源种类对菌株产酶的影响:分别以1%的CMC-Na､葡萄糖､蔗糖､乳糖､酵母膏､牛肉膏､酵母粉､麦芽浸粉､秸秆汁､米糠作为碳源,摇瓶培养后测定酶活,考察碳源种类对菌株产酶的影响｡②氮源种类对菌株产酶的影响:分别以1%的(NH4)2SO4､NH4NO3､KNO3､蛋白胨､尿素､酵母膏､酪蛋白胨作为氮源,以1%葡萄糖作为碳源,摇瓶培养后测定酶活,考察氮源种类对菌株产酶的影响｡③NaCl浓度水平对菌株产酶的影响:在原始液体产酶培养基的基础上分别加入0.1%､0.2%､0.3%､0.4%､0.5%､0.6%､0.7%､0.8%､0.9%､1.0%的NaCl,摇瓶培养后测定酶活,考察NaCl浓度水平对菌株产酶的影响｡④底物(CMC-Na)浓度水平对菌株产酶的影响:在原始液体产酶培养基的基础上分别加入0.1%､0.2%､0.3%､0.4%､0.5%､0.6%､0.7%､0.8%､0.9%､1.0%的CMC-Na,摇瓶培养后测定酶活,考察底物浓度水平对菌株产酶的影响｡⑤根据上述试验得到的最适培养基组成,选取L9(34)型正交表设计正交试验,试验因素和水平见表1,以上清液酶活大小为指标,选择最优培养基组成｡2结果与分析2.1纤维素酶产生菌的初筛采用刚果红染色法从瓢虫肠道中分离纯化得到16株透明圈较大的细菌,细菌编号及其D/d值分别为:B-1,6.167;B-35,5.667;B-11,5.000;B-19,4.750;B-9,4.000;B-26,3.750;B-37,3.000;B -27,1.833;B-53,3.000;B-47,2.714;B-36,2.667;B-42,2.571;B-32,2.500;B-46,2.429;B-1 2,2.083;B-10,1.420｡2.2纤维素酶产生菌的复筛对初筛得到的16株菌株进行摇瓶复筛,以CMCA为指标,筛选出B-12､B-10､B-53､B-11等4株产纤维素酶活力较高的菌株,CMCA(3次测定的平均值)分别为76.85､68.85､53.94､71.27 U/mL｡菌株B-12的CMCA最高,该菌株用以后续的试验｡2.3DNS法葡萄糖标准曲线葡萄糖标准曲线如图1所示,得到方程y=0.916 9x-0.110 4,r2=0.991 4｡2.4菌株B-12的初步鉴定2.4.1形态特征菌株B-12在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上菌落较大､圆形､边缘整齐､不透明､乳白色､微隆起､湿润､生长较快｡显微镜观察细胞呈杆状,两头稍平;周生鞭毛,革兰氏染色呈阳性;芽孢椭圆形或柱状,中生或偏端生,芽孢囊不膨大｡2.4.2生理生化特征V.P反应为阴性,吲哚反应､甲基红反应为阳性｡该菌株可利用葡萄糖产酸,能水解淀粉,分解明胶,不能利用柠檬酸盐｡结合形态特征和生理生化特征,参考《伯杰细菌鉴定手册》第八版,将菌株B-12鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)｡2.5产酶条件的优化2.5.1摇瓶生长曲线的确定在原始培养基基础上从发酵开始至72 h,连续取样,在600 nm下测定生物量,离心后取上清液测定酶活,得到与时间相关的该菌株的生长曲线以及产酶曲线(图2､图3)｡由图2､图3可知,在3 h左右菌株进入对数生长期,16 h左右菌株生长开始进入稳定期,44 h以后开始进入衰亡期｡CMCA､FPA､BGL开始时增长较为缓慢,CMCA､BGL在44 h时达到最大值,FPA在47 h时达到最大,综合考虑将最佳培养时间定为44 h｡总体趋势表明菌株B-12的产酶能力与菌体生长状况有耦连相关性｡在44 h时CMCA为102.694 U/mL,FPA为7.187 U/mL,BGL为14.593 U/mL｡2.5.2不同接种量对菌株酶活力的影响不同接种量对菌株酶活力的影响结果见图4｡综合考虑,在接种量为6%时3个酶活指标均较高,CMCA为73.901 U/mL,FPA 为8.232 U/mL,BGL为7.140 U/mL｡因此最佳接种量选择6%｡2.5.3不同碳源对菌株B-12酶活力的影响碳源对微生物生长代谢的作用主要是提供细胞碳架､细胞生命活动所需的能量以及合成产物的碳架｡根据微生物所能产生的酶系不同,不同的微生物可利用的碳源不同｡在产酶培养基的基础上改变不同的碳源检测菌株B-12的产酶情况｡由图5可知,不同种类的碳源对菌株产纤维素酶影响不同,其中麦芽浸粉作为碳源时3个酶活指标均较高,CMCA为74.592 U/mL,FPA为6.778 U/mL,BGL为7.667 U/mL｡因此确定麦芽浸粉作为菌株B-12的产酶培养基的适宜碳源｡2.5.4不同氮源对菌株酶活力的影响氮源是合成菌体蛋白质､核酸及其他含氮化合物的重要组成成分｡不同种类的氮源对菌株的产酶影响结果见图6｡当KNO3作为氮源时,3个酶活指标均较高,CMCA为230.080 U/mL,FPA为101.636 U/mL,BGL 为93.009 U/mL｡因此确定该菌株的产酶培养基的适宜氮源为KNO3(图6)｡2.5.5NaCl浓度对菌株酶活力的影响试验设置了0.1%､0.2%､0.3%､0.4%､0.5%､0.6%､0.7%､0.8%､0.9%､1.0%等10个NaCl浓度梯度,在不同NaCl浓度下测定纤维素酶的3个酶活指标｡由图7可知,当NaCl浓度为0.2%时,CMCA活性最高,为75.137 U/mL,FPA和BGL活性相对较高,分别为5.533 U/mL和7.485 U/mL｡因此,NaCl浓度为0.2%时菌株B-12的酶活较大｡2.5.6底物(CMC-Na)含量对菌株酶活力的影响试验测定CMC-Na不同添加量(0.1%､0.2%､0.3%､0.4%､0.5%､0.6%､0.7%､0.8%､0.9%､1.0%)时菌株B-12的产酶水平｡由图8可知,当CMC-Na浓度达到0.2%时,CMCA活性最高,为90.043 U/mL,FPA和BGL活性相对较高,分别为7.287 U/mL和7.213 U/mL;表明菌株B-12适宜底物(CMC-Na)浓度为0.2%｡2.5.7最适培养基组成确定选取L9(34)型正交表设计正交试验,以上清液酶活大小为指标,选择最优培养基组成｡对正交试验结果进行极差分析(表2)可以发现对于CMCA酶活而言,主要因素的影响顺序为:麦芽浸粉>NaCl>KNO3>CMC-Na,最佳组合为:1.25%麦芽浸粉､1.0% KNO3､0.1% NaCl､0.2% CMC-Na｡对于FPA酶活,主要因素的影响顺序为:CMC-Na>NaCl>KNO3>麦芽浸粉,最佳组合为:1.25%麦芽浸粉､1.5% KNO3､0.2% NaCl､0.1% CMC-Na｡对于BGL酶活,主要因素的影响顺序为:KNO3>CMC-Na>麦芽浸粉>NaCl,最佳组合为:1.25%麦芽浸粉､1.5% KNO3､0.2% NaCl､0.1% CMC-Na｡综合考虑,最终确定最佳培养基配方为:1.25%麦芽浸粉,1.5%KNO3,0.2%NaCl,0.1% CMC-Na｡此时,CMCA､FPA和BGL分别为111.710 U/mL､35.017 U/mL和116.799 U/mL,较菌株培养44 h时的酶活分别提高了8.78%､387.23%和700.38%｡3讨论利用刚果红平板法初筛得到的透明圈比值大的菌株,其酶活并不一定高｡试验中我们发现菌株B-1的透明圈比值高达 6.167,而菌株B-12的透明圈比值仅为2.083,但从摇瓶发酵复筛结果看,菌株B-12的酶活要高于B-1的｡因此,在筛选纤维素酶高产菌株时,摇瓶发酵复筛是必要的｡我们首次从马铃薯瓢虫肠道中分离得到多株产纤维素酶肠道菌并筛选到1株酶活性较高的菌株B-12,产酶条件经优化后,其CMCA为111.710 U/mL,FPA为35.017 U/mL,BGL为116.799 U/mL｡而采用同样的酶活测试方法,林祥木等[17]从土壤中分离得到的最好的菌株其CMCA为36 U/mL,FPA为31 U/mL,BGL不足41 U/mL｡昆虫是地球生物圈中已知种类最多的一群生物[18,19],昆虫种类､数量及分布范围的多样性意味着昆虫肠道菌的多样性[20]｡研究表明昆虫肠道菌是微生物新种的潜在资源[21,22]｡因此,昆虫肠道菌可能是新高产纤维素酶的广泛来源,而从昆虫肠道菌分离产纤维素酶菌还鲜有报道,亟待研究开发｡参考文献:[1] TOMME P, WARREN R A J, GILKES N R. Cellulose hydrolysis by bacteria and fungi[J]. Advances in microbial physiology, 1995,37(1):1-81.[2] 李燕红,赵辅昆. 纤维素酶的研究进展[J]. 生命科学,2005, 17(4):392-397.[3] 张大羽,诸永,程家安. 黄胸散白蚁和台湾白蚁不同品级虫体内纤维素酶的活性[J]. 浙江大学学报(农业与生命科学版),2001,27(1):1-4.[4] 邱雁临. 纤维素酶的研究和应用前景[J]. 粮食与饲料工业,2001(8): 30-31.[5] 乞永立,耿月霞,任章启. 纤维素酶的生产及应用[J]. 适用技术市场,2000(6):20-21.[6] 刘英昊,崔文华. 纤维素酶及其生产工艺简介[J]. 饲料博览,1997(6):26.[7] 张加春,王权飞,余尊祥. 里氏木霉的纤维素酶产生条件研究[J]. 食品与发酵工业,2000,26(3):1-23.[8] 邬敏辰,李江华, 邻显章. 黑曲霉固态培养生产纤维素酶的研究[J]. 酿酒,1997(6):5-9.[9] 施安辉,刘尔敬. 纤维素酶固体生产和应用中的有关问题[J]. 中国调味品, 1997(10): 6-10.[10] DILLON R J, DILLON V M. The gut bacteria of insects: Nonpathogenic interactions[J]. Annual Review of Entomology, 2004,49: 71-92.[11] CANTWELL B A, McCONNELL D J. Molecular cloning and expression of a Bacillus subtilis 13-glucanase gene in Escherichia coli[J]. Gene,1983,23(2):211-219.[12] GAO J, WENG H, ZHU D, et al. Production and characterization of cellulolytic enzymes from the thermoacidophilic fungal Aspergillus terreus M11 under solid-state cultivation of corn stover[J]. Bioresource Technology, 2008,99(16):7623-7629.[13] 刘韫滔,榻淑霞,龙传南,等. 纤维素降解菌L-06的筛选､鉴定及其产酶条件的分析[J]. 生物工程学报, 2008,24(6):1112-1116.[14] 周刚.白蚁内生菌的分离及其纤维素酶､木质素酶高产菌株的鉴定[D].哈尔滨: 黑龙江大学,2006.[15] 李方. 一株白蚁内生放线菌次级代谢产物及纤维素酶的研究[D]. 南京: 南京大学,2008.[16] 张树政. 酶工业制剂(下册)[M]. 北京:科学出版社,1998. 606-608.[17] 林祥木,童金秀,陈汉清,等. 产纤维素酶菌株的筛选及产酶条件的选择[J]. 福建农林大学学报(自然科学版),2003,32(4):510-513.[18] 雷朝亮,荣秀兰. 普通昆虫学[M]. 北京:中国农业出版社,2003.[19] 彩万志,庞雄飞,花保祯,等. 普通昆虫学[M]. 北京:中国农业出版社,2001.[20] 张应烙. 昆虫肠道真菌的新活性物质研究[D]. 南京:南京大学,2008.[21] HAWKSWORTH D L. Fungal diversity and its implications for genetic resource collections[J]. Studies in Mycology,2004,50:9-18.[22] WHITE M M,LICHTWADT R W. Fungal symbionts (Harpellales) in Norwegian aquatic insect larvae[J]. Mycologia,2004,96(4):891-910.。
一株低温产纤维素酶细菌的筛选及其发酵产酶条件的优化
Ａｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ：Ａ ｌ ｏ ｗ ｔ ｅ ｍｐ ｅ ｒ ａ ｔ ｕ ｒ ｅ ｓ ｔ ｒ ａ ｉ ｎ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ａ ｐ ｒ ｏ ｄ ｕ ｃ ｉ ｎ ｇ ｃ ｅ ｌ ｌ ｕ ｌ ｏ ｓ ｅ ｗａ ｓ ｉ ｓ ｏ ｌ ａ ｔ ｅ ｄ ｆ ｒ ｏ ｍ ｖ ａ ｉ ｒ ｅ ｔ ｙ ｏ ｆ ｓ ｏ ｉ ｌ ｓ ａ ｍｐ ｌ ｅ ｓ ，ａ ｎ ｄ ｔ ｈ ｅ ｌ ｉ ｑ ｕ ｉ ｄ ｆ ｅ ｒ ｍｅ ｎ ｔ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｃ ｏ ｎ ｄ ｉ ｔ ｉ ｏ ｎ ｓ ｗ ｅ ｒ ｅ ｏ ｐ ｔ ｉ ｍｉ ｚ ｅ ｄ ．Ｔ ｈ ｅ ｒ ｅ ｓ ｕ ｌ ｔ ｓ ｏ ｆ ｅ ｘ ｐ ｅ ｉｅ ｆ ｎ ｔ ｓ ｓ ｈ ｏ ｗ ｅ ｄ ｔ ｈ ａ ｔ ｔ ｈ ｅ ｐ ｒ ｉ ｍｕ ｍ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ｅ ｍｅ ｄ ｉ ｕ ｍ
Ｃｏ ｌ ｄ－ａΒιβλιοθήκη ｄ ａ ｐｔ ｅ ｄ Ｃｅ ｌ ｌ ｕ ｌ ａ ｓ ｅ —ｐｒ ０ ｄｕ ｃ ｉ ｎｇ Ｂａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ａ
Ｌ Ｉ Ｕ Ｊ ｉ ａ ｎ － ｇ ｕ ｏ，ＨＡＮ Ｍｅ ｉ
（ Ｓ ｈ ｅ ｎ ｙ ａ ｎ ｇ Ａ ｇ ｒ ｉ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ａ ｌ Ｕ ｉ ｎ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ Ｉ ｎ ｓ ｔ ｉ ｔ ｕ ｔ ｅ ｏ ｆ Ｌ ａ ｎ ｄ ａ ｎ ｄ Ｅ ｎ ｖ ｉ ｒ ｏ ｎ ｍ ｅ ｎ ｔ ， Ｓ ｈ ｅ ｎ ｇ ｙ ａ ｎ ｇ Ｌ ｉ ａ ｏ ｎ ｉ ｎ ｇ １ １ ０ ８ ６ ６ ， Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ）
培 养 奢件 为 ： 培养基 ｐ Ｈ为６ ． ０ ， 发 酵时间为 ４ ｄ ， 发酵温度 为 ２ ０ ℃， 接 种量为 ４ ％， 摇床转速 为 １ ８ ０ ｒ ／ ｍｉ ｎ ： 发 酵 条 件 优 化
产纤维素酶菌株的筛选及其酶活的测定
本科开放项目题目：产纤维素酶菌株的筛选及其酶活的测定学生姓名：指导教师：学院：专业班级：2016年3月产纤维素酶菌株的筛选及其酶活的测定摘要纤维素作为植物光合作用的主要多糖类产物，是高等植物细胞壁的主要成分，是公认的自然界数量最丰富、最廉价的可再生有机物质资源。
据估计，纤维素生成量每年高达1000亿吨。
我国每年农作物秸秆总产量为7亿吨左右，仅农业生产中形成的农作物残渣（如稻草、玉米秸、麦秸等），每年就有5亿吨之多。
纤维素的降解是自然界碳素循环的中心环节。
但由于纤维素的结构特点，对纤维素的利用仍然非常有限。
目前仅有20%的纤维素物质被开发利用，大量的纤维素物质因无法分解利用而废弃，不仅造成资源浪费，而且污染环境。
随着人口数量的不断增长和人民生活水平的不断提高，能源危机、食物短缺、环境污染等问题日益严重，寻找利用可再生资源、节省粮食、减少环境污染的有效途径显得日趋重要。
采用微生物技术处理秸秆是当前研究最多的一种秸秆处理方法,纤维素酶能将天然纤维素降解,生成纤维素分子链、纤维二糖和葡萄糖,然而目前制约纤维素材料转化为乙醇并实现产业化的关键因素之一是纤维素酶效率低下,从而造成生产成本过高。
因此,筛选具有高活性纤维素酶的秸秆降解微生物菌株以及相关研究是当前研究的热点和难点。
关键词：纤维素降解高活性纤维素酶微生物菌株目录第1章绪论 (1)1.1 实验原理 (1)1.2 实验仪器及试剂 (2)1.2.1 实验材料 (2)1.2.2 实验仪器 (2)1.2.3 培养基 (2)第2章实验步骤 (3)2.1 采样培养 (3)2.2 初筛 (4)2.3 复筛 (4)2.4 酶活的测定 (4)2.4.1原理 (4)2.4.2溶液配制 (4)2.4.3实验步骤 (5)第3章实验结果 (7)3.1 标准曲线的绘制 (7)3.2 菌株复筛结果 (8)3.3 测定纤维素酶活力结果 (9)结束语 (10)参考文献 (11)第1章绪论1.1 实验原理自然界中存在大量的纤维素类物质，同时存在着很多能分解纤维素类物质的生物，小到细菌、放线菌、真菌，大到一些食草类昆虫与动物。
高产纤维素酶菌株的筛选及产酶条件研究
高产纤维素酶菌株的筛选及产酶条件研究研究目标本研究旨在筛选高产纤维素酶的菌株，并优化其产酶条件，以提高纤维素降解效率和产酶量。
方法1. 菌种收集与筛选1.收集土壤、水源等环境样品，分离出潜在的纤维素酶产生菌株。
2.通过平板培养和传代培养，筛选出具有纤维素酶活性的菌株。
2. 纤维素酶活性测定1.利用Congo Red染色法测定菌株的纤维素酶活性。
2.选择具有较高纤维素酶活性的菌株作为后续研究对象。
3. 优化产酶条件1.确定最适pH：在不同初始pH值下培养菌株，测定产酶量和纤维素酶活性。
2.确定最适温度：在不同培养温度下培养菌株，测定产酶量和纤维素酶活性。
3.确定最适碳源：使用不同碳源（如纤维素、木质素等）培养菌株，测定产酶量和纤维素酶活性。
4.确定最适氮源：使用不同氮源（如蛋白质、尿素等）培养菌株，测定产酶量和纤维素酶活性。
4. 鉴定菌株1.利用生化和分子生物学方法对优选出的菌株进行鉴定，确定其属于哪个科、属、种。
2.利用16S rRNA基因序列分析确定菌株的系统发育关系。
5. 产酶机制研究1.利用电镜观察菌株在不同培养条件下的形态结构变化。
2.利用基因组学方法分析纤维素酶基因在不同条件下的表达情况。
发现1.从环境样品中筛选出了多个具有纤维素酶活性的菌株，其中某一菌株表现出较高的纤维素酶活性。
2.最适pH为7.0，最适温度为50℃，最适碳源为纤维素，最适氮源为蛋白质。
3.经鉴定，该菌株属于纤维素酶产生菌属，并命名为XX菌株。
4.电镜观察发现，在最适产酶条件下，XX菌株的纤维素酶形态结构清晰可见。
5.通过基因组学方法分析，发现XX菌株在最适产酶条件下纤维素酶基因的表达水平较高。
结论1.通过本研究筛选出了一株高产纤维素酶的菌株XX。
2.最适产酶条件为pH 7.0、温度50℃、碳源为纤维素、氮源为蛋白质。
3.该菌株具有潜力应用于纤维素降解和生物质转化领域。
4.通过深入研究其产酶机制，可以进一步优化该菌株的产酶性能和应用前景。
产纤维素酶菌种的筛选与优化
产纤维素酶菌种的筛选与优化目记录实验1分离和初筛实验2复筛和保存实验3酶活测定和继代保存实验实验4紫外诱变育种实验5产纤维素酶菌株产酶条件优化实验6产酶条件优化结果实验1了解产纤维素酶微生物分离的基本原理；2.掌握产纤维素酶微生物分离的操作方法2，实验原理自然界中有大量的纤维素物质，同时也有许多能分解纤维素物质的生物，从细菌、放线菌、真菌到一些食草昆虫和动物。
这些生物和绿色植物一起构成了世界的碳循环。
在发酵堆肥中，有大量耐高温纤维素分解菌，但大多数是混合分解菌。
菌株需要1。
内切葡萄糖苷酶(endo-1，4-β-d-葡聚糖酶，简称EC 3.3.1.4，EBG)，也称为Cx酶，CMC酶，例如这种酶作用于纤维素分子内的非晶区，随机识别并水解β-1，4-糖苷键，截短长链纤维素分子，并产生大量末端不还原的纤维素小分子。
2.胞外-1，4-β-D-葡聚糖酶(酶代码3.2.1.91)，也称为C1酶、微晶纤维素酶和纤维二糖水解酶(CBH)，它从纤维素长链的非还原端水解β-1，4-糖苷键，一次切割纤维二糖分子；3β-葡萄糖苷酶(β-葡萄糖苷酶，EC3.2.21，缩写为BG)，也称为纤维二糖酶，可水解纤维二糖酶糖和短链纤维低聚糖生成葡萄糖，并快速水解纤维二糖和纤维三糖。
随着葡萄糖聚合酶的增加和水解率的降低，这种酶的特异性相对较差。
只有三种酶协同作用，才能很好地分解纤维素。
就单个菌落而言，木霉、曲霉和青霉等霉菌具有较高的总体酶活和较大的产量，因此用于畜牧业和饲料工业的纤维素酶主要是真菌纤维素酶。
在本实验中，以羟甲基纤维素钠为唯一碳源的培养基作为筛选培养基。
只有能将纤维素水解成单糖并加以利用的微生物才能在筛选培养基上生长。
从筛选培养基中分离产生纤维素酶的微生物。
使用羧甲基纤维素钠(CMC-Na)作为唯一碳源，并使用CMC-Na通过微生物分解来分离能够产生纤维素酶的菌株。
刚果红是一种酸性染料，可与纤维素反应形成红色络合物。
高产纤维素酶生产菌的筛选及诱变育种
14
1.1.3 试剂 1mg/mL 葡萄糖标准液: 葡萄糖置于 110℃烘箱
中烘 2h 至恒重，称取 0.1g 烘好的葡萄糖，溶解并定 容至 100mL。
0.01M 乙酸-乙酸钠缓冲溶液 (pH4.8):A 液：冰 醋酸 6mL，蒸馏水定容至 1000mL，配制成 0.1M 醋酸 溶 液 ；B 液 ： 称 取 8.2g 醋 酸 钠 ， 蒸 馏 水 定 容 至 1000mL，配制成 0.1M 醋酸钠溶液；以 A：B=4：6 的比 例混合，低温冷藏备用。
5g 固 体 曲 湿 料 加 50mL 去 离 子 水 ，30℃ 浸 提 6min，纱 布 过 滤 ，3000r/min 15min，上 清 液 即 为 用 于 测定的固体曲酶液。 1.2.4.2 DNS 法测定波长的确定
取 0.5mL 葡萄糖标准液及 0.5mL 蒸馏水分别置 于 25mL 试 管 中 ，再 各 加 2mL DNS 试 剂 ，沸 水 浴 加 热 5min，流水冷却，蒸馏水定容至 25mL。 将 DNS 试 剂-水(空白)、葡萄糖显色液-DNS 试剂(空白)分别在 波长 400nm～600nm 范围内进行扫描。 1.2.4.3 葡萄糖标准曲线的绘制
第 46 卷（总第 155 期）
Food and Fermentation Technology
第 46 卷（第 1 期） Vol.46，No.1
高产纤维素酶生产菌的筛选及诱变育种
方尚玲，杨丹丹，钱志伟，李小强，陈茂彬*
（发酵工程省部共建教育部重点实验室，湖北工业大学生物工程学院，湖北武汉 430068）
取 8 支洗净烘干的 25mL 比色管，编号后按表 1 加入标准葡萄糖溶液和蒸馏水， 配制成一系列不同 浓度的葡萄糖溶液。 充分摇匀后， 向各试管中加入 2mLDNS 溶液,沸水浴 5min，取出冷却后用蒸馏水定 容至 25mL，充分混匀。 在选定波长下，以 1 号试管溶 液作为空白对照， 测定其它各管溶液的 OD 值并记 录结果。 以葡萄糖含量（mg）为横坐标，以对应的 OD 值为纵坐标，绘制出葡萄糖标准曲线。 1.2.4.4 内切纤维素酶活[8](Cx，CMC 酶活)
生产纤维素酶的菌种选育方案
选育 纯化 鉴定
优化培养 大量繁殖 添加饲料
1、选育
取三角瓶加入适量蛋白胨、无机离子、水 及稻草粉，配制成液体培养基，并从土壤 中取得混合的菌种。将菌种加入上述液体 培养基中，将三角瓶放入摇床中进行培养 2~3天。取出菌液，再放入稻草粉含量高 的液体培养基中，并在摇床中培养2~3天， 取出菌液。
观察菌落
挑取菌种，进行镜检
进一步利用RNA鉴定
4、优化培养
逐步地、小幅度地改变菌种培养的环境温 度及培养基的pH值和光照条件使优化后的 菌种能够适应动物胃肠环境。
5、大量繁殖 添加饲料
大量培养纯化、优化后的菌种，培养一定 时间后，将长有大量菌种的培养基研碎后 添加到动物的饲料中。
工 业 化 培 养 得 菌 种
添加入饲料
稻 草
粉碎
稻 草 粉
蛋白胨、无机离子、水
含有稻草粉的液体培养基
2、纯化
利用稀释涂布平板法将上述菌液接种到含 有纤维素的培养基上，将其放在培养箱中 培养24~48小时，使其长出菌落。
将选育出的菌种通过稀 释涂布平板法接种到培 4~48h
3、鉴定
首先观察菌落形态，通过理论判定哪种是 所需菌种形成的菌落，然后在该菌落上挑 取菌种进行镜检，并利用该菌种的生理、 生化指标进行鉴定，最后，利用RNA鉴定 后RNA分子杂交确定所选出的菌种是我们 所需的能生产纤维素酶的菌种。
纤维素酶产生菌的筛选及产酶条件优化
’
作者 简 介 ： 曾￣ （９ ５ ， ， 南新 化 人 ， 士研 究 生 ， 究 方 向 ： 物化 工 ； 讯 作 者 ： 群 良 ， 士 ， １ ８ 一） 男 湖 硕 研 生 通 李 博 副教 授 ，－ ｉ ｑ ｎｉ ｇｉ Ｅ ｍａ ：ｕ ｌ ｎ ｌ ｌ ａ ＠
ｙ ｈ ｏ ｃ ｒ． ｎ ａ ｏ ．ｏ ｃ 。 ｎ
１ ７ 酶 活 力 的 测 定 ．
图 ２ 培 养 温 度对 酶 活 力 的影 响
Ｆｉ．２ Ｔｈｅｅ ｆｃ ｆｃ ｔ ｒ ｅ ｐ ｒ ｔ ｅｏ ｅ ｙ ｅａ ｔｖｔ ｇ ｆｅ ｔｏ ｕｌｕ ｅ ｔｍ ｅ ａｕｒ ｎ ｎｚ ｍ ｃ ｉｉｙ
移 取 ０ ５ｍＬ含有 １ Ｃ ． ＭＣ Ｎａ — 的液 体发酵 培养 基于试 管 中， 入 ０ ５ｍＬ粗 酶 液 ， ５ 加 ． 于 ５℃水 浴 保温 １ ｎ后 ， ０ｍｉ 加入 ２ ０ｍＬ ３ ５二 硝基水 杨 酸终止 反应 ， ． ，一 煮沸 １ ｎ 取 １ｍＬ溶 液 稀释 ｌ ０ｍｉ， ０倍 ， ７ ２型 分光 用 ２ 光度计 于 ５ ０Ｄ 波长 下 比色 ， 照 葡萄 糖 标 准 曲线 ４ ｍ 对 换算成 葡萄糖质 量 。 酶 活力单位 （ 定义 ： Ｕ） 在上 述条件 下 ， 每毫升 粗酶 液反应 １ｍｉ 生 成 １ ｇ葡 萄糖 的酶 量 为一 个 酶 活力 ｎ 单位 。
液体 发酵培养 基 （ ＭＣ Ｎａ培养 基 ） Ｃ — ０ Ｃ — ： ＭＣ Ｎａ１
ｇ （ ， ＮＨ４ ２ Ｏ４ ４ ｇ， ） Ｓ ＫＨ２ Ｏ４ ． Ｍ ｇ Ｏ４・ ７ Ｐ ０ ｇ， ２ Ｓ Ｈ２ Ｏ
０ ５ｇ 蛋 白胨 １ ， １ ０ ， Ｈ 值 自然 。 ． ， ０ｇ 水 ０ ０ｍＬ ｐ
由图 １可知 ， 随着培 养 时间 的延 长 ， 活力 增 大 ， 酶
产纤维素酶菌群的筛选及其酶学特性研究的开题报告
产纤维素酶菌群的筛选及其酶学特性研究的开题报告
一、研究背景
纤维素是一种常见的多聚糖，存在于大部分植物细胞壁中，因此广泛存在于土壤和水体中。
由于其难以降解的特点，造成了许多环境问题。
而纤维素酶是一种针对纤维素的特殊酶类，可以将纤维素降解为低分子糖类，具有重要的应用价值。
目前，纤维素酶的产生主要是通过微生物发酵。
因此，对于纤维素酶的酶学特性的研究是非常重要的，并且对于优选高产纤维素酶的微生物菌株也是极为重要的。
二、研究内容与目的
本研究旨在筛选出高效纤维素酶产生菌株，并研究其生长条件和酶学特性，以提高纤维素酶的产量和酶效力。
具体研究内容如下：
1. 筛选能够高效产生纤维素酶的细菌菌株，并对其进行酶学特性的分析。
2. 探究生长条件对纤维素酶活性的影响，优化最适生长条件。
3. 研究纤维素酶酶学特性，包括温度、pH值、抑制剂等对其酶活性的影响。
4. 探讨纤维素酶的应用前景。
三、研究方法
1. 微生物筛选：从环境中采集样品，进行微生物分离和纯化，通过生化和分子生物学方法进行细菌分类并筛选高效纤维素酶产生菌株。
2. 菌株的生长和纤维素酶酶学特性测定：对筛选出的微生物菌株，采用罗斯曼培养基进行培养并测定其生长曲线和纤维素酶活性的变化情况；同时，对纤维素酶进行酶学特性研究。
3. 数据处理与分析：利用统计学方法对实验结果进行数据处理和分析。
四、预期结果
本研究将筛选到优良的纤维素酶产生菌株，并探究其生长条件和酶学特性，从而为产纤维素酶菌株的优选和酶效力的提高提供理论和实践依据。
同时，本研究还将为纤维素酶的高效应用和产业化提供思路和技术支持。
纤维素酶产生菌的筛选、鉴定及发酵产酶条件优化
纤维素酶产生菌的筛选、鉴定及发酵产酶条件优化李争明;张娟;邓中洋;卢凡;秦文胜【摘要】To isolate efficient cellulase-producing bacteria, 180 bacterial isolated from rotten wood, humus, and other soil samples, and 44 were screened from them and confirmed as cellulase-producing bacteria by Gram's iodine solution staining. In the subsequent secondary screening tests, those 44 isolates were cultured in fermentation media and their total cellulase activities(FPase)were measured and compared. The strain J1-3-1, with the highest FPase activity, was identified as Sphingobacterium sp. by 16S rRNA sequence analysis. The optimal fermentation conditions for enzymes production of J1-3-1 were determined. Under the optimal conditions, its activities of FPase, CMCase, and β-glucosidase reached 8.76,28.04和7.02 U/mL, respectively. The results demonstrated that J1-3-1 wasa promising candidate for potential industrial production of cellulase.%以腐烂木材、腐殖土等材料作为菌源,从中分离出180个菌株,以期得到具有纤维素酶活性的菌株.采用革兰氏碘液染色法进行定性初筛,获得了44个纤维素酶产生菌株.将此44个菌株发酵培养后,使用滤纸酶活性测定法进行定量复筛,滤纸酶活性最高的是菌株J1-3-1.通过对J1-3-1菌株的16S rRNA的序列测定分析,将J1-3-1鉴定为鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium sp.).经对J1-3-1进行产酶发酵条件优化,分别确立了产生最高滤纸酶(FPase)活性、内切葡聚糖酶(CMCase)活性和β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)活性的发酵条件.在最优发酵产酶条件下,菌株J1-3-1的滤纸酶、内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的最高酶活性分别为8.76、28.04和7.02 U/mL.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2015(031)005【总页数】7页(P146-152)【关键词】纤维素酶产生菌;筛选;鉴定;发酵;鞘氨醇杆菌【作者】李争明;张娟;邓中洋;卢凡;秦文胜【作者单位】湖北工业大学资源与环境工程学院微藻实验室工业发酵湖北省协同创新中心河湖生态修复及藻类利用湖北省重点实验室,武汉 430068;湖北工业大学资源与环境工程学院微藻实验室工业发酵湖北省协同创新中心河湖生态修复及藻类利用湖北省重点实验室,武汉 430068;湖北工业大学资源与环境工程学院微藻实验室工业发酵湖北省协同创新中心河湖生态修复及藻类利用湖北省重点实验室,武汉 430068;湖北工业大学资源与环境工程学院微藻实验室工业发酵湖北省协同创新中心河湖生态修复及藻类利用湖北省重点实验室,武汉 430068;Department of Biology,Lakehead University,Ontario,P7B 5E1,Canada【正文语种】中文随着人口的膨胀和经济的迅猛发展，全球对能源的需求量大幅提升，其中化石燃料占能源消耗的85%以上［1，2］。
纤维素酶产生菌的筛选、分离
纤维素酶产生菌的筛选、分离一、实验原理由于刚果红可以跟大分子多糖牢固结合，产生红色复合物，而纤维素是大分子多糖，因此跟刚果红可以牢固地结合；纤维素酶产生酶可以分泌的纤维素酶，可以使平板中的纤维素降解成小分子糖，那么刚果红就无法与小分子糖结合，就被洗脱下来，呈现透明圈，由此来判别是否有纤维素产生菌，并对其筛选，纯化，分离，保存。
二、仪器与试剂1、仪器：烧杯、称量纸、药勺、锥形瓶、玻璃棒、电光分析天平、酒精灯、培养皿、恒温箱、高压蒸汽灭菌锅、1ml和10ml移液管、吸耳球、试管、ph试纸或PH计、纱布、棉花、绳子、标签、涂布棒、摇床培养箱、报纸。
2、试剂：无菌水、0.9%生理盐水、氢氧化钠溶液、盐酸溶液、CMC-Na筛选培养基：（CMC-Na 0.5g、蛋白胨0.5g、磷酸二氢钾0.1g 、七水硫酸镁0.05g、酵母粉0.05g、琼脂1.5g、水100ml、PH调节为7.0），滤纸条培养基：（滤纸条 0.5g、蛋白胨0.5g、磷酸二氢钾0.1g 、七水硫酸镁0.05g、酵母粉0.05g、琼脂1.5g、水100ml、PH调节为7.0）CMC-Na刚果红鉴定培养基：（CMC-Na2.0g/l 、硫酸铵2 g/l 、七水硫酸镁0.5、磷酸氢二钾1 g/l、氯化钠0.5 g/l、刚果红0.2 g/l、琼脂0.2 g、PH7.0）。
三、实验步骤1、土样的采集为获得纤维素酶产生菌，土样的采集要在富含纤维素的环境中进行，这是因为在纤维素含量丰富的环境中，通常会聚集较多的分解纤维素的微生物，应采集学校树木下用于堆肥的树叶腐烂泥样及表层泥土为样品,因此样品含纤维素酶产生菌，取样时，由于细菌绝大多数分布在距地表约3~8cm的土壤层，要先除去表层土，再用瓶子对土壤进行采样，土壤保存时间不宜超过12小时。
2、培养基的配制、分装灭菌及其他材料的准备CMC-Na分离培养基和滤纸条培养基的配制：根据培养基配方，准确称取各组分于烧杯中，加入适量蒸馏水，并对其加热、搅拌、溶解，最后加蒸馏水至100ml刻度线，调节ph至7.0；分装、制作斜面培养基：将制备好的两种培养基分装到试管中（1/5），每种培养基装两个试管，加上棉花塞，包扎，灭菌，摆斜面；贴上标签（组别，姓名，培养基名称）；将剩余的培养基分别装到两个三角瓶中，包扎，灭菌：3、土壤菌悬液的配制、移取及培养称取5g土壤样品，按无菌操作，将样品放入装有45ml无菌生理盐水的烧杯中，振荡10min左右，制成的土壤菌悬液；并将菌悬液用无菌移液管各移取5ml至CMC-Na和滤纸条培养基中，于28度摇床培养一周。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
实验一产纤维素酶菌种的分离与初筛实验二产纤维素酶菌种的复筛与保藏实验三酶活测定与传代保藏实验四产纤维素酶菌种的紫外诱变育种实验五产纤维素酶菌种的产酶条件优化实验六产纤维素酶菌种的产酶条件优化的结果分析实验一产纤维素酶菌种的分离与初步鉴定一、实验目的1．了解产纤维素酶微生物分离的基本原理；2．掌握产纤维素酶微生物分离的操作方法。
二、实验原理自然界中存在大量的纤维素类物质，同时存在着很多能分解纤维素类物质的生物，小到细菌、放线菌、真菌，大到一些食草类昆虫与动物。
这些生物与绿色植物一起构成了这个世界的碳循环。
在发酵堆肥中，存在着大量的，耐高温的纤维素分解菌株，但多半都为混合分解，菌种需要：1. 内切型葡萄糖苷酶（endo-1,4- ^D-glucanase,EC3.3.1.4,简称EBG）,也称Cx 酶、CMC酶、EG。
这类酶作用于纤维素分子内部的非结晶区，随机识别并水解3-1,4-糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量非还原性末端的小分子纤维素；2. 外切型葡萄糖苷酶（exo-1,4- 3D-glucanase,EC3.2.1.91 ）,也称C1酶、微晶纤维素酶、纤维二糖水解酶（Cellobiohydrolase, 简称CBH）,这类酶从纤维素长链的非还原性末端水解3-1,4-糖苷键，每次切下纤维二糖分子；3. B-葡萄糖苷酶（^glucosidase, EC3.2.21，简称BG）又称纤维二糖酶，它能水解纤维二糖以及短链的纤维寡糖生产葡萄糖，对纤维二糖和纤维三糖的水解很快。
随着葡萄糖聚合酶的增加水解速度下降,这种酶的专一性比较差。
只有三种酶的协同作用,才能较好的分解纤维素。
就单菌落而言,霉菌如木霉、曲霉和青霉的总体酶活性较高,产量大,故在畜牧业和饲料工业中的应用的纤维素酶主要是真菌纤维素酶。
本实验以羟甲基纤维素钠为唯一碳源的培养基作为筛选培养基, 只有能够水解纤维素成单糖并加以利用的微生物才能在筛选培养基上生长, 利用筛选培养基分离产纤维素酶的微生物。
以羧甲基纤维素钠（CMC-Na ）为唯一碳源,通过微生物分解利用CMC-Na ,分离出能产纤维素酶的菌种；刚果红是一种酸性染料,可与纤维素反应形成红色复合物。
三、实验仪器及试剂1. 材料土样取自学校校门口小树林5—20cm深处；2 ．仪器试管、烧杯、移液管、平板、锥形瓶、玻璃珠、电磁炉、电子称、量筒、培养皿、酒精灯、移液枪、接种环、高压灭菌锅等；3 .培养基（1）筛选培养基（500ml）CMC-Na 10g 、（NH4）2SO4 1.4 g 、MgSO4 0.3gKH 2PO4 2g 、MnSO4 1.6mg 、FeSO4 5mgZnSO 4 2.5mg 、CoCl2 2.0mg琼脂20g PH7.0（2）保藏培养基（500ml）CMC-Na 15g 、MgSO4 0.5g 、K2HPO4 1.5g 、酵母粉10gNaCl 5g 、蛋白胨15g、琼脂20g、刚果红PH7.0四、实验步骤1. 土样采集取自学校校门口小树林5—20cm深处;2. 实验器材灭菌：平板、移液管的包扎及灭菌；3. 无菌水的制备：量取99ml 自来水于250ml 锥形瓶中，并放入适量颗玻璃窗珠，塞上棉塞，用牛皮纸包扎，于121?C 条件下灭菌20min 备用。
量取9ml 自来水于试管中，用试管塞塞好，用牛皮纸包扎，于121?C 条件下灭菌20min 备用。
4．筛选培养基配制及倒平板：准确按筛选培养基配方称取各物质溶于1000ml 蒸馏水中，调节pH7.0 。
在高压来菌锅中于121?C高温灭菌20min，取出于无菌环境旧倒平板备用。
5．保藏培养基配制及摆斜面：准确按筛选培养基配方称取各物质溶于1000ml 蒸馏水中，调节pH7.0 。
分装试管中，在高压来菌锅中于121?C高温灭菌20min，取出摆斜面备用。
6. 土样预处理及梯度稀释（ 1 ）样品菌悬液的制备先取1g 样品，加入到99ml 含有玻璃珠的无菌水中，震荡几分钟形成悬液。
（ 2 ）梯度稀释：在无菌条件下，用灭好菌的移液管取1ml 到装有9ml 无菌水的试管中，依次稀释10 -3 、10-4、10-5 、10-6 的梯度备用7. 倒平板涂布分别取10-4、10-5 、10-6 三个浓度的菌悬液接种到倒好了的平板中，并涂布均匀8. 培养、观察、记录实验二产纤维素酶菌种的筛选与保藏一、实验目的1．掌握平板接斜面的操作；2．掌握筛选原则与选择方法。
二、实验原理刚果红能和纤维素结合，纤维素酶能水解纤维素，从而使刚果红在产纤维素酶菌株周围结合到纤维素而形成透明圈，从而选择目标菌落。
微生物繁衍具有容易变异的特性，同时微生物的生长一般离不开生长所需的营养、水分、氧气及环境温度等，在营养缺乏、干燥、隔绝空气、温度低等条件下均可使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态而便于保存微生物的特性。
利用微生物的纯培养以确定分离所得的最佳产酶微生物，并进行保存与进一步研究。
通过酶活测定确定初筛菌株的产酶性能；通过培养条件的控制而菌种休眠实现保藏。
三、实验仪器及试剂1．菌种借用实验室的菌种；2．仪器试管、烧杯、电磁炉、电子称、量筒、培养皿、酒精灯、移液枪、接种环、旋转式摇床等；3．培养基摇瓶培养基CMC-Na10g 、（NH4）2SO<Og、MgSO7f00.5g、K2HPO 1.5g、牛肉膏2g、蛋白胨4g （PH自然定容到1L）四、实验步骤1. 在分离产植酸酶黑曲霉的平板上，选择透明圈明显、透明圈直径与菌落直径比值较大的，分离效果最好的单菌落，并做好标记；2. 左手拿平板，右手拿接种环，先将金属环烧灼灭菌，再将接种环在空白培养基处冷却，挑取菌落，在火焰旁稍等片刻。
3. 左手将平板放下，拿起斜面培养基。
在火焰旁用右手小指和手掌边缘拔下棉塞并夹紧，迅速将接种环伸入空白斜面，在斜面培养基上轻轻划线，将菌体接于其上。
划线时由底部向上划一直线，一直划到斜面的顶部。
4. 灼烧试管口，在火焰旁将棉塞塞上，接种完毕，接种环上的余菌必须灼烧灭菌后才能放下。
5. 培养：倒置于28至30oC恒温箱中，培养3-7d观察结果。
实验三酶活测定与传代保藏一、实验目的1•了解纤维素酶总酶活测定原理；2. 掌握纤维素酶活力检测方法；3 •学习传代保藏的操作方法。
二、实验原理纤维素酶在合适的条件下可以分解纤维素，产生葡萄糖等还原糖，与3,5-二硝基水杨酸显色剂(DNS作用，可生成橙黄色络物。
使用终止反应法，是在恒温反应体系中，每隔一定时间，取出一定体积的反应液，用强酸或强碱或SDS以及加热等使反应立即停止，然后用化学方法放射性化学法或酶偶联法分析产物的形成或底物的消耗量。
这是最经典的的酶活力测定方法，几乎所有的酶都可以根据这一原理设计出具体的测定方法。
本实验使用强碱终止分解反应，通过DNS法进行吸光度的测定。
根据相应的标准曲线，运用比色法可以推算出反应液中葡萄糖的生成量，进而推算出酶的活力。
酶活的定义：在37o C PH5.5的条件下60min水浴，每分钟释放出lumol的单糖为一个酶活单位。
三、实验仪器及试剂1. 筛选到的菌种2 •仪器：试管、烧杯、电磁炉、电子称、量筒、培养皿、酒精灯、移液枪、接种环、旋转式摇床、分光光度计、恒温水槽、滤纸等；3 .试剂：柠檬酸、柠檬酸钠、柠檬酸缓冲液、葡萄糖、DNS等四、实验步骤将筛选到的菌种接入摇瓶，37 C、200转/分下培养3d,制成种子液，取1ml的接种量接入第二次摇瓶培养基中7 C、200转/分下培养。
纤维素酶原酶液的制备方法：取培养液3ml8000r/min离心10min，上清液即为粗酶液。
取1ml粗酶液，加9LPH5.0柠檬酸缓冲液，即为稀释10倍原酶液。
1. 纤维素酶的测定还原糖的测定为DNS试剂法，540nm处有紫外光大光吸收峰，在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度比例关系，利用比色法测定其还原糖生成量就可测定纤维素酶的活力。
标准序号标准溶液/ml蒸馏水/ml DNS/ml OD540nm0.1 0.2 0.3 0.42.00.8 2.0 0.7 2.0 0.6 2.0(1)纤维素酶活德尔测定A •按下表比例稀释成不同葡萄糖浓度溶液。
50.50.5 2.060.60.4 2.070.70.3 2.080.80.2 2.0B .显色反应：在上述试管中分别加入DNS试剂2.0ml，于沸水浴中加热5min进行显色，取出后用流动水迅速冷却，各加入蒸馏水9.0ml，摇匀，在540nm波长处测定吸光值。
以葡萄糖含量（mg/ml ）为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。
（2）滤纸酶活性（FPA测定取干净的10ml刻度试管若干，各加入0.5ml稀释10倍的粗酶液和0.5ml0.05mol/L ,PH5.0的柠檬酸缓冲液，向对照管中加入0.5mlDNS溶液终止反应。
将试管先在50C水浴中预热10min,在各加入滤纸条50mg, 50C水浴中保温60min后取出，立即向上述试管中分别加入DNS试剂2.0ml，于沸水浴中加热5min进行显色，取出后用流动水迅速冷却，各加入蒸馏水9.0ml，摇匀，在540nm波长处测定吸光值。
以上酶活测定时间均扣除发酵液中的还原糖后计算，采用国际单位即在上述条件下1min产生lumol葡萄糖为一个活力单位（IU/ml ）。
2. 菌种传代保藏0.9 2.0将菌种接种到在适宜的固体斜面培养基上，待菌充分生长后，棉塞部分用油纸包扎好，移至2-8 C的冰箱保藏。
保藏时间依微生物的种类而有不同，霉菌、放线菌及有芽孢的细菌保存2-4个月，移种一次。
此法为实验室和工厂军追踪室常用的保藏方法，优点是操作简便，使用方便，不需特殊设备，能随时检查所保藏的菌株是否死亡、变异与污染杂菌等。
缺点是容易变异，因为培养基的物理。
化学特性不是严格恒定的，屡次传代会使微生物的代谢改变，而影响微生物的性状，污染杂菌的机会也会较多。
实验四产纤维素酶菌种的紫外诱变育种一、实验目的1•了解紫外诱变育种的原理；2 .掌握紫外诱变育种的操作方法。
二、实验原理诱变育种是指用物理。
化学因素诱导动植物的遗传特性发生变异，再从变异群体中选择符合人们某种要求的单株/个体，进而培育成新的品种或种质的育种方法。
它是继选择育种和杂交育种之后发展起来的一项现代育种技术。
常规杂交育种基本上是染色体的重新组合，这种技术一般并不引起染色体发生变异，更难以触及到基因。
当通过辐射将能量传递到生物体内时，生物体内各种分子便产生电离和激发，接着产生许多化学性质十分活跃的自由原子或自由基团。
它们继续相互反应，并与其周围物质特别是大分子核酸和蛋白质反应，引起分子结构的改变。
由此又影响到细胞内的一些生化过程，如DNA合成的终止、各种酶活性的改变等，使个部分结构进一步深刻变化，其中尤其重要的是染色体损伤。