产纤维素酶的筛选汇总.
高产纤维素酶菌的筛选Doc1
纤维素酶高产菌株选育研究进展指导老师：梁智群学生：郭法谋班级: 08级发酵工程学号: 0813303002纤维素酶高产菌株选育研究进展郭法谋（广西大学生命科学与技术学院，广西南宁 530005）摘要：纤维素酶在经济上的可行性主要是受到纤维素酶成本的限制,因此筛选出产高活性纤维素酶的菌株是开发利用纤维素资源的前提和关键。
本文总结了纤维素酶高产菌选育的国内外研究进展，以及诱变育种、原生质体融合技术育种、纤维素酶基因克隆的国内外研究现状，对今后纤维素酶高产菌的选育研究发展趋势做了全面的分析和综述。
关键词：纤维素酶；诱变育种；原生质体融合；基因克隆Mutation Breeding of Cellulase HighProducing StrainGUO Famou(College of Life Science and Technology Guangxi University Nanning530005 China)Abstract:The cost of the cellulase is the mainly restrictions if it is viability in the economic, Therefore, screening high activity cellulase producing strain is a prerequisite and key resources for development and utilization of cellulose.This paper summarizes the bacteria breeding high-yield cellulase research at home and abroad, as well as mutation breeding, protoplast fusion breeding, gene cloning cellulase research at home and abroad In the current,for future high-yield cellulase Breeding Research and Development has done a comprehensive analysis of trends and synthesis. Keywords:cellulase；breeding; Protoplast fusion; Cloning纤维素酶在饲料、酿造、粮食加工、果汁与蔬菜加工、纺织等各个方面都具有重要的用途。
产纤维素酶细菌的筛选鉴定及产酶条件研究
产纤维素酶细菌的筛选鉴定及产酶条件研究⼴西轻⼯业GUANGXI JOURNAL OF LIGHT INDUSTRY2009年7⽉第7期（总第128期）⾷品与⽣物纤维素是地球上分布最⼴，含量最丰富的碳源物质，对⼈类⽽⾔，它⼜是⾃然界中数量最⼤的可再⽣资源，是永不枯竭的⽣物资源。
纤维素可被纤维素酶降解⽣成葡萄糖，因此纤维素酶研究开发和应⽤是植物质资源再利⽤的主要途径。
微⽣物是纤维素酶的主要来源，据不完全统计，迄今为⽌，国内外共记录了产纤维素酶的菌株⼤约53个属的⼏千个菌株[1]，其中主要有细菌、放线菌和真菌，⽬前研究的最清楚的是霉菌中的⾥⽒⽊霉T.reesei 。
细菌产纤维素酶的产量较少，主要是葡聚糖内切酶，⼤多数对结晶纤维素⽆降解活性，且所产⽣的酶多是胞内酶或吸附在细胞壁上，不分泌到培养液中，增加了提取纯化的难度[1]，因此对细菌的研究较少。
但由细菌产⽣的纤维素酶⼀般为中性或碱性，近⼗年来随着中性纤维素酶和碱性纤维素酶在洗涤、纺织等⽅⾯应⽤前景⼴阔，细菌纤维素酶制剂已显⽰出良好的应⽤性能和巨⼤的经济价值[2]。
我们从青藏⾼原牦⽜粪中分离到⼀株⾰兰⽒阴性菌Ti-bet-YD4600-2，经16S rDNA 序列⽐对分析，Ti-bet-YD4600-2为鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas sp.)菌株。
鞘氨醇单胞菌属是Yabuuchi （1990）[3]等通过研究16S rDNA核苷酸序列，胞内脂质中出现的特殊鞘糖脂和辅酶Q 的主要类型，确定的⼀个新属，该属细菌具有着极强的⽣命⼒，分布⼴泛，对除草剂、偶氮染料、多环芳烃等具有较好的降解作⽤，近年来受到⼴泛重视和研究[4]。
１材料和⽅法1.1材料来源通天河（34°49.753N,92°56.142E ）海拔4604m 处取牦⽜粪样品。
1.2培养基[5]分离平板培养基，复筛培养基，滤纸崩解实验培养基，液体摇瓶培养基。
1.3初筛取样品1g 置于装有100mL ⽆菌⽔的三⾓瓶中，摇匀，从三⾓瓶中取1mL 转移到另⼀盛有100mL ⽆菌⽔的三⾓瓶，在25℃和150r /min 下振荡培养2h ，取0.1mL 振荡培养液涂布筛选到以CMC 为唯⼀碳源的培养基平板，倒置恒温25℃培养3~4d ，注意观察菌的⽣长情况，挑取单菌落⽤斜⾯保存。
纤维素酶的筛选
纤维素酶高产菌株的分离筛选基地一班王木兰 201630123017一、研究意义21世纪，人类面临的最主要的挑战就是资源与环境问题，生物资源是可再生性资源，地球上每年光合作用产物达1.5x1011 ~2.0x1011t，是人类赖以生存的基本物质来源，其中纤维素是地球上最丰富的物质之一，然而这部分资源尚未得到充分开发利用，目前主要用于燃料、畜牧饲料与积肥，利用率低，对环境污染严重。
纤维素酶的研究为纤维素更有效利用开辟了一条新途径，纤维素酶是一组能够降解纤维素生成葡萄糖的酶的总称，根据其作用方式可分为外切β-1，4-葡聚糖苷酶、内切β-1，4-葡聚糖苷酶和β-1，4-葡萄糖苷酶3类，在这三种酶协同下，纤维素最终被完全降解为葡萄糖。
研究表明纤维素酶在食品、饲料、医药、纺织和造纸等领域有广阔的应用前景。
利用纤维素酶降解天然纤维素，对于解决世界环境污染以及能源危机等问题具有十分重要的意义。
但目前纤维素酶的生产存在着酶活力低，生产周期长等问题，还未能真正应用于大规模工业生产，因此选育具有高酶活的纤维素分解菌株成为关键之一。
二、国内外研究动态目前获得纤维素酶高产菌株主要是通过自然界选育、诱变育种以及利用基因工程技术改造菌株。
其中，研究较多的是通过对已知纤维素产生菌进行诱变，以增加产酶微生物菌种，提高酶活力。
迄今为止，产纤维素酶能力最强的是里氏木霉，它是产纤维素酶和半纤维素酶最主要的工业生产菌种，国内外已有很多这方面的报道，1971年，Mandels等通过绿色木霉QW60获得了产酶活力提高一倍的QW9123；上海植生所纤维素酶组采用野生木霉As3.3002和拟康氏木霉，经物理、化学诱变，获得了高活力的菌株Ea3-967和N2-78。
纤维素酶基因克隆的研究始于20世纪70年代末，自1982年Whittle等人首次报道Cellulomonas fimi的纤维素酶基因被克隆以来，人们不断从细菌和真菌中发现分离纤维素酶系，迄今为止，据报道已经有近100多纤维素酶及木聚糖酶基因都可在大肠杆菌中克隆表达。
产纤维素酶霉菌的筛选及初步鉴定
种类繁多 ， 来源也很广 。大多数纤维 素酶 主要来 自 微 生物 体 心 。 目前 ， 们 对 各 种 微 生 物 （ 括 真 菌 ］ 人 包 和细菌 ） 的纤 维 素 酶 的关 注 较 多 ， 其 是 源 于 真 菌 尤 的纤维素酶 。所有能分解微 晶纤维素 的真菌 ， 能 均 或 多或 少地 分泌 纤 维 素 酶 ， 以纤 维 素酶 的真 菌 源 所
本 研究 使用 羧 甲基 纤维 素 液体 培养 基 富集 培 养 环境 样 品 ， 分离 得到 ３ 产 纤维 素酶 的霉菌 。使 用 ４株 刚果 红染 色 初筛 和 Ｄ Ｓ法 复筛 ， 到 ２株纤 维 素 酶 Ｎ 得 活较 高 的霉 菌菌 株 ｗ０ ０ 、 ｘ０ ５ 同时还 使 用 苏 ｘ５ ３ ｗ ｌ０ 。
℃培养 ４ —５ ｄ进 行 活 化 ， 后 接 种 到 ３ Ｌ（ ５ 之 ０ｍ ２ ０
ｍＬ三角瓶 ） Ｄ Ｐ Ａ液体 培养 基 中 ， ２ ℃ 、８ ／ ｉ 于 ８ １０ｒｒｎ ａ 下 摇床 发酵 ， ３ｄ后 取 样 测 定 上 清 发 酵 液 中 的 Ｃ ＭＣ
酶 活力 。
１ ５ ＤＮ ． Ｓ法测 Ｃ ＭＣ酶 活
—
ｆ ｕ ｅｈｌｓ ｏ ｒｃ ｌ ａ ｅ—ｐ ｏ ｕ ｉ ｇ ｆ ｎ ｉｓ ａｎ ｒ ｓ ｌ ｔｄ ｔ ｒ ｕ ｈ ｅ ｒ ｈ ｎ ｕ ｔ ｒｎ ｙ ＣＭＣ —Ｎａ ｌ ｕ ｄ ｍｅ ｉ ｍ． ｒ ｄ ｃ ｎ ｇ ｔ ｉ ｓｗｅ ｅ ｉｏａ ｅ ｈ ｏ ｇ ｎ ｃ ｍｅ ｔｃ ｌ ｉ ｇ ｂ ｕ ｒ ｉ ｕ ｉ ｉ ｄ ｕ ｑ
Ｄ Ｉ１．９９ｊ ｉ ｎ １０ － ８ ．０ １０ ．０ Ｏ ： ３６／．ｓ ．０ ９ ８ １２ １．３０２ ０ ｓ ４
产纤维素酶真菌的分离和鉴定
产纤维素酶真菌的分离、筛选与鉴定一、采样地点：深圳大学杜鹃山深圳大学文科楼荔枝园深圳大学文山湖树丛用具：灭菌信封小铁铲小刀分离培养基手套采样的方法：取采样地点的表层土或地面15cm下的土样约10g，装入信封，立刻到实验室分离纯化二、培养基：（1）马丁氏培养基：KH2PO4 1g、MgSO4·7H2O 0.5g、蛋白胨5g、葡萄糖10g、琼脂20.0 g、水1000ml，pH 自然。
（2）PDA培养基：PDA培养基：用于里氏木霉的固体培养，含20 %土豆浸出液，1 %葡萄糖，2 % Agar。
20 %土豆浸出液作法如下：将土豆去皮切碎，每20 g土豆加水100 ml，置电炉上煮20分钟，用纱布过滤，定容。
（均需要加入抗生素100μg/ml）产酶筛选培养基（CMC培养基）：羧甲基纤维素钠（CMC）20.0 g、蛋白胨5.0 g、酵母抽提物2.0 g、NaCl 5.0g、KH2PO4 1.0g、MgSO4·7H2O 0.2g、琼脂20g、蒸馏水1 000ml。
1%CMCNa底物溶液：1克CMCNa加热溶化于100ml pH值4.8，0.1mol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中。
0.lmol/L的柠檬酸一柠檬酸钠缓0.1mol/L柠檬酸: 含柠檬酸·H2O 21.01克/1000毫升。
0.1mol/L的柠檬酸三钠: 含柠檬酸三钠·2H2O 29.4克/1000毫升。
0.1mol/L的柠檬酸40ml与0.1mol/L的柠檬酸三钠60.6ml混合即可。
刚果红染液：2% 刚果红溶液。
NaCl脱色液：2%氯化钠溶液。
三、实验方法3.1 真菌菌株的分离取土样方法如前所述。
取1.0 g所采集的土样加入到装有9 ml无菌水的试管中，充分振荡混匀后，吸取上清液作一系列梯度稀释，10-1，10-2，10-3，将稀释液涂布在分离培养基（可选择查氏、马丁氏或PDA培养基的任两种，倒平板前加入100 μg/ml头孢菌素或链霉素等抗生素），于28℃下培养，待菌落成熟，形成孢子后（约需5-7 d）将单菌落上的少量孢子点种至纤维素酶产生菌筛选培养基（CMC平板）平板上( 用前加入适量抗生素来抑制细菌生长) , 28℃倒置恒温培养。
从土壤里筛选产纤维素酶细菌的步骤
从土壤中分离产几丁质酶的真菌作者：王春学号:11101680摘要：几丁质是自然界中储量仅次于纤维素的生物多聚体,它广泛存在于真菌、硅藻、节肢动物和原生动物等生物体中,是绝大多数真菌细胞壁的结构物质,同时还是昆虫中肠围食膜的主要成分[1].几丁质酶(Chitinase,EC3.4.1.14)[2]可催化水解几丁质的β21,4糖苷键生成N2乙酰2D2氨基葡萄糖(NAG),它在植物病虫害,尤其是对真菌病的防治方面,以及在几丁质废物的转化和利用等方面都具有重要作用,其研究受到人们的广泛重视.通过几丁质作为碳源,从土壤中筛选产几丁质酶菌株.1 材料与方法1.1 培养基1.1.1 平板培养基 (1)细菌几丁质培养基(分离用):蛋白胨10g,K2HPO40.7g,MgSO40.5g,KH2PO40.3g,胶体几丁质5.0g,琼脂15～20g,蒸馏水1L,pH值为7.2.(2)纯几丁质培养基:胶体几丁质 5.0g,KNO31.0g,NaCl0.5g,K2HPO40.5g,MgSO40.5g,FeSO40.01g,琼脂20g,蒸馏水1L,pH值为7.2.1.1.2 摇瓶培养基 (1)种子培养基(LB培养基):蛋白胨10g,酵母膏5g,NaCl10g,蒸馏水1L,pH值为7.0.(2)发酵培养基:用细菌几丁质培养基(分离用),但不加琼脂1.2 菌株的分离1.2.1 菌株初步分离从生产几丁质的工厂排污沟附近土壤采集土样,经过烘干及风化干燥,置于60目分样筛过筛,备用.称取1g土样放入加有9mL无菌水的离心管,分别稀释制成10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6不同稀释倍数的土壤溶液.从10-3,10-4,10-5,10-6不同稀度倍数的4管土壤稀释液中各吸取0.1mL,接种在纯几丁质培养基和细菌几丁质培养基的平板上,用涂布棒涂布均匀,在30℃下培养72h.1.2.2 菌种的二次筛选从第1次稀释涂布的平板中挑取可以产生透明圈的菌落,再一次通过稀释涂布的方法,将其接种于纯几丁质平板和细菌几丁质平板上,培养72h,以取得纯菌落平板.从第2次筛选的纯菌平板上选取水解圈直径与菌落直径比最大的菌种,将其接种于50mL的LB种子培养基上,12h后以2%的接种量接于100mL的细菌几丁质发酵培养基中,在30℃下进行扩大培养.1.3 菌种的鉴定1.3.1 细菌染色体DNA提取从新培养产几个质酶活性高的革兰氏阴性细菌平板上,挑取一环菌落至加有500μLTE缓冲液的1.5mL微量离心管中,混匀后沸水浴1.5min,迅速低温离心(12000r・min-1)10min,取上层清液分装后,置4℃下保存备用.1.3.2 16SrDNA引物根据16SrDNA的结构,应用B2/B3做引物,该引物扩增片段包含V8和V9两个高变区,扩增产物大小为1050bp(basepair,碱基对)左右.这两个引物序列为B2:5’2ACGGGCGGTGTGTAC23’;B3:5’2CCTACGGGAGGCAGCAG23’.1.3.3 聚合酶链反应(PCR)检测 PCR反应体系为20μL,二次蒸馏水12.6μL,10倍扩增缓冲液2.0μL,25mmol・L-1Mg2+1.6μL,各2.5mmol・L-1的脱氧核苷三磷酸(dNTP)0.4μL,20μmol・L-1引物各1.0μL,DNA模板1.0μL,5GU・L-1Taq酶0.4μL.PCR循环:94℃预变性5min,94℃变性60s,50℃退火60s,72℃延伸90s,循环30次,并在72℃后延伸15min.1.3.4 扩增产物的电泳分析用1倍的TAE缓冲液配制质量分数为1%琼脂糖凝胶.取PCR 扩增产物10μL,加2μL溴酚蓝指示剂,混匀后加样,于100V下电泳1.5h,紫外灯下观察电泳结果.1.3.5 序列测定与分析将观察到的PCR产物切胶,用胶回收试剂盒回收后,连接到pMD182T上,送北京奥科生物公司进行测序.然后,将测序结果通过GeneBank进行BLAST序列比对,得出结果参考文献[1] BROGLIEKE.Chitinaseandplantprotection[J].RevPlantPathol,1993,2:4112421.[2] 李力,黄胜元,关雄.产几丁质酶的苏云金杆菌菌株筛选及酶合成条件研究[J].中国病毒学,2000,15(51):94297.[3] CHANGYu2cheng,YANGChiyea,LIChin,etal.IdentificationofBacillussp,Escherichiacoli,Salmonellasp,StaphylococcusspandVibriospwith16SribosomalDNA2basedoligonucleotidearrayhybridization[J].Internation2 alJournalofFoodMicrobiology,2006,107:1312137.[4] 张龙翔,张庭芳,李令媛.生化实验技术[M].北京:高教出版社,1997:1112116.[5] MOOREER,KRUGERAS,HAUBENL,etal.16SrRNAgenesequenceanalysesandinter2andintragenericre2lationshipsofXanthomonasspeciesandStenotrophomonasmaltophilia[J].FEMSMicrobiolLett,1997,151(2):1452 153.[6] MIYAJIT,OTTAY,SHIBATAT,etal.PurificationandcharacterizationofextracellularalkalineserineproteasefromStenotrophomonasmaltophiliastrainS21[J].LettApplMicrobiol,2005,41(3):2532257.[7] MADHA VAPNK,BAIJUTV,SANDHYAC,etal.ProcessoptimizationforantifungalchitinaseproductionbyTrichodermaharzianum[J].ProcessBiochem,2004,39:158321590.[8] NAWANINN,KAPADNISBP.Optimizationofchitinaseproductionusingstatisticsbasedexperimentaldesigns[J].ProcessBiochem,2005,40:6512660。
产纤维素酶菌及其筛选改良方法研究进展
产纤维素酶菌及其筛选改良方法研究进展【摘要】本文主要介绍了产纤维素酶菌及其筛选改良方法的研究进展。
首先解释了纤维素酶的作用与应用，然后介绍了不同种类产纤维素酶菌的特点以及筛选方法。
接着讨论了如何改良产纤维素酶菌的培养条件和优化生产工艺。
最后分析了研究的重要性，探讨了未来研究方向，并进行总结。
通过本文的介绍，读者可以了解到产纤维素酶菌及其改良方法在生物工程领域的重要性和潜在应用，为相关领域的研究提供了启示和指导。
【关键词】产纤维素酶菌、筛选、改良、纤维素酶、菌种、特点、培养条件、生产工艺、研究进展、重要性、未来方向、总结。
1. 引言1.1 产纤维素酶菌及其筛选改良方法研究进展产纤维素酶是一类能够降解纤维素的酶，能够将纤维素分解成可利用的小分子糖类，具有重要的应用价值。
随着生物技术的发展，人们对产纤维素酶菌及其筛选改良方法进行了深入研究，取得了一系列进展。
产纤维素酶菌是产生纤维素酶的微生物，包括细菌、真菌和放线菌等。
不同种类的产纤维素酶菌具有不同的特点，如生长速度、纤维素酶产量和适应环境等。
筛选出高效的产纤维素酶菌对于提高纤维素降解效率至关重要。
在筛选产纤维素酶菌的过程中，常采用的方法包括传统的筛选培养基、色谱技术、PCR技术等。
通过这些方法，可以快速有效地筛选出具有高产酶能力的菌株，为纤维素降解的研究和应用提供了有效的渠道。
改良产纤维素酶菌的培养条件也是提高纤维素酶产量的重要途径。
调节温度、pH值、碳源和氮源等因素，可以显著提高产酶菌株的酶活力和产酶量。
在优化产纤维素酶的生产工艺方面，通过对发酵过程中各项参数的精细调控，可以大幅提升纤维素酶的产量和活力，实现经济效益和环境友好的纤维素降解过程。
产纤维素酶菌及其筛选改良方法的研究对于开发和利用纤维素资源具有重要意义。
未来的研究方向应该围绕提高产纤维素酶菌的酶活力、稳定性和产酶量展开，以满足不断增长的纤维素降解需求。
通过不懈的努力和创新，相信产纤维素酶菌及其筛选改良方法的研究将迎来更加美好的发展前景。
(整理)产纤维素酶菌种的筛选与优化.
目录实验一产纤维素酶菌种的分离与初筛实验二产纤维素酶菌种的复筛与保藏实验三酶活测定与传代保藏实验四产纤维素酶菌种的紫外诱变育种实验五产纤维素酶菌种的产酶条件优化实验六产纤维素酶菌种的产酶条件优化的结果分析实验一产纤维素酶菌种的分离与初步鉴定一、实验目的1．了解产纤维素酶微生物分离的基本原理；2．掌握产纤维素酶微生物分离的操作方法。
二、实验原理自然界中存在大量的纤维素类物质，同时存在着很多能分解纤维素类物质的生物，小到细菌、放线菌、真菌，大到一些食草类昆虫与动物。
这些生物与绿色植物一起构成了这个世界的碳循环。
在发酵堆肥中，存在着大量的，耐高温的纤维素分解菌株，但多半都为混合分解，菌种需要：1.内切型葡萄糖苷酶（endo-1,4-β-D-glucanase,EC3.3.1.4,简称EBG），也称Cx酶、CMC酶、EG。
这类酶作用于纤维素分子内部的非结晶区，随机识别并水解β-1,4-糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量非还原性末端的小分子纤维素；2.外切型葡萄糖苷酶（exo-1,4-β-D-glucanase,EC3.2.1.91），也称C1酶、微晶纤维素酶、纤维二糖水解酶（Cellobiohydrolase,简称CBH）,这类酶从纤维素长链的非还原性末端水解β-1,4-糖苷键，每次切下纤维二糖分子；3.Β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，EC3.2.21，简称BG）又称纤维二糖酶，它能水解纤维二糖以及短链的纤维寡糖生产葡萄糖，对纤维二糖和纤维三糖的水解很快。
随着葡萄糖聚合酶的增加水解速度下降，这种酶的专一性比较差。
只有三种酶的协同作用，才能较好的分解纤维素。
就单菌落而言，霉菌如木霉、曲霉和青霉的总体酶活性较高，产量大，故在畜牧业和饲料工业中的应用的纤维素酶主要是真菌纤维素酶。
本实验以羟甲基纤维素钠为唯一碳源的培养基作为筛选培养基，只有能够水解纤维素成单糖并加以利用的微生物才能在筛选培养基上生长，利用筛选培养基分离产纤维素酶的微生物。
纤维素酶产生菌的筛选-鉴定和产酶条件优化
纤维素酶产生菌的筛选\鉴定和产酶条件优化摘要:采用稀释平板法分离马铃薯瓢虫肠道菌,利用刚果红平板法对产纤维素酶菌株进行初筛,选取透明圈较大的菌株进行摇瓶发酵复筛,根据菌株形态､生理生化特征对菌株进行初步鉴定,通过正交法优化产酶条件｡结果表明,经初筛和复筛得到1株酶活相对较高的菌株B-12,经初步鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)｡1.25%麦芽浸粉为碳源､1.5%KNO3为氮源､0.2%的NaCl､0.1%的CMC-Na､接种量6%､培养时间44 h为B-12产酶的适宜条件｡优化后发酵液中的内切葡聚糖酶活(CMCA)为111.710 U/mL,较培养44 h后的酶活提高了8.78%;滤纸酶活(FPA)为35.017 U/mL,提高了387.23%;β-葡萄糖苷酶酶活(BGL)为116.799 U/mL,提高了700.38%｡关键词:马铃薯瓢虫;肠道菌;纤维素酶;优化Screening,Identification and Cultural Condition Optimization of Cellulase-producing Strains from the Intestine of Henosepilachna vigintioctomaculata Abstract: The bacteria from the intestine of Henosepilachna vigintioctomaculata were isolated through the pour plate method. They were preliminarily screened using Congo red medium plate method, and then screened according to their cellulase activities by flask shaking fermentation method. The strain was identified based on morphological and physiological characters. In addition, the culture substrates and fermentation conditions were optimized by orthogonal experiment method. A high cellulase-producing strain B-12 was screened from the intestine of H. vigintioctomaculata and it was identified as Bacillus sp.. The best culture conditions were as follows: substrate were 1.25% malt meal, 1.5% KNO3, 0.2% NaCl, and 0.1% CMC-Na, inoculation quantity was 6%, culture time was 44 h. In this condition, the enzyme activity of CMCase, filter paper enzyme (FPA), and β-glucosidase (BGL) were 111.710, 35.017, and 116.799 U/mL respectively, which were 8.78%, 387.23% and 700.38% higher than those of the initial strain respectively.Key words: Henosepilachna vigintioctomaculata; intestinal bacteria; cellulase; optimization地球上的生物资源主要来自光合生物,其中90%以上为木质纤维素类物质,它们代表了生态系统中营养金字塔最庞大的基层[1]｡天然的木质纤维素材料含有纤维素､半纤维素和木质素等｡其中纤维素是地球上最丰富的多糖物质,这类物质是植物细胞壁的主要成分,也是地球上最廉价的可再生资源｡另外,人类活动产生的废弃物中也含有大量的纤维素[2]｡目前,人们对纤维素的降解和利用主要通过纤维素酶的分解来实现｡纤维素酶在再生能源利用方面具有广阔的应用前景,可应用于农业､酿造工业､发酵工业､食品工业以及其他领域[3-9]｡因此研究纤维素酶有着十分重要的意义｡昆虫肠道菌是指能定植于昆虫肠道的微生物,包括土著的昆虫肠道菌和能定植于昆虫肠道环境的微生物[10]｡研究表明一些昆虫肠道菌能帮助昆虫消化食物[10]｡对喜食含纤维素食物的昆虫,我们推测其消化纤维素可能与其肠道菌分泌纤维素酶有关｡马铃薯瓢虫主要为害茄科植物,喜食茄科植物叶片,它消化叶片中的纤维素可能与其肠道菌有关｡本试验从马铃薯瓢虫肠道中分离筛选产纤维素酶菌株并对其产酶条件进行优化,旨在为发现新的纤维素酶高产菌株奠定基础｡1材料与方法1.1材料1.1.1菌株采自浙江省金华市婺城区高村附近马铃薯田地的马铃薯瓢虫肠道中的菌株｡1.1.2培养基①菌种保藏培养基:牛肉膏蛋白胨培养基(牛肉膏0.30%,蛋白胨1.00%,NaCl 0.50%,琼脂 1.50%~2.00%,pH值7.4~7.6)｡②初筛培养基:米糠2.00%,NaCl 0.10%,K2HPO4 0.50%,MgSO4·7H2O 0.02%,(NH4)2SO4 0.06%,琼脂1.50%~2.00%,pH值7.0~7.2｡③刚果红纤维素鉴定培养基:羧甲基纤维素钠(CMC-Na)0.30%,NaCl 0.50%,牛肉浸膏0.15%,蛋白胨0.50%,琼脂1.50%~2.00%,pH值7.0~7.2｡④种子培养液:酵母膏 1.00%,蛋白胨 1.00%,NaCl0.50%,CMC-Na 0.50%,pH值7.0~7.2｡⑤液体产酶发酵培养液:配方同种子培养液｡⑥鉴定用培养基:糖发酵试验培养基､葡萄糖蛋白胨水培养基､蛋白胨水解培养基､Simons氏柠檬酸盐培养基､明胶水解试验培养基等｡1.1.3主要试剂葡萄糖､pH值4.6的醋酸缓冲液､DNS､2% CMC-Na底物溶液､0.05%水杨苷的醋酸缓冲液､蛋白胨､牛肉膏等｡1.1.4主要仪器立式电热压力蒸汽灭菌锅,上海中安医疗器械厂生产;LRH-250生化培养箱,上海一恒科技有限公司生产;D-78532台式冷冻离心机,德国Hettich 公司生产;UV-7504紫外可见分光光度计,上海欣茂仪器有限公司生产;SW-CJ-1B 型单人单面净化工作台,苏州净化设备有限公司生产;电子天平,赛多利斯科学仪器(北京)有限公司生产;HH-4数显恒温水浴锅,山东鄞城科源仪器设备厂生产;远红外快速恒温干燥箱,上海跃进医疗器械厂生产｡1.2方法1.2.1纤维素酶产生菌的分离､纯化和初筛马铃薯瓢虫饥饿24 h后,无菌条件下在75%酒精中表面消毒2 min,去离子水漂洗3次,采用稀释平板法分离肠道菌｡待菌长出后用无菌牙签挑选单菌落于刚果红纤维素鉴定培养基上影印2~3皿,37℃下培养2~3 d｡取其中1皿采用刚果红染色法鉴定其产酶能力[11]｡对产生透明圈的菌株进行测量并记录D/d值(D为透明圈直径,d为菌落直径,下同),挑选D/d值大于1的菌株作为初筛菌种,通过连续划线法,分离纯化｡得到的初筛菌株转接到保藏斜面,4℃条件下保藏备用｡1.2.2纤维素酶产生菌的复筛将初筛到的菌株活化后接种于30/250 mL(250 mL 三角瓶装30 mL培养液,下同)种子培养基中,37℃､180 r/min摇床培养过夜｡以2%接种量转接于30/250 mL产酶培养基中,37℃､180r/min培养2~3 d,10 000 r/min冷冻离心10 min,取上清液测定酶活,筛选产纤维素酶最高的菌株｡1.2.3酶活力测定测定方法参照文献[12-16]修正得到｡1)标准曲线绘制｡反应的总体系为3.5 mL,1 mg/mL葡萄糖溶液和去离子水共2 mL,DNS试剂1.5 mL｡取10支试管编号分别为1~10｡分别吸取0､0.2､0.4､0.6､0.8､1.0､1.2､1.4､1.6､1.8 mL葡萄糖溶液至1~10号试管中;然后分别吸取2.0､1.8､1.6､1.4､1.2､1.0､0.8､0.6､0.4､0.2 mL去离子水至相应的1~10号试管中｡向1~10号试管中分别加入1.5 mL DNS试剂｡将上述试管一同沸水浴5 min,冷却后稀释至10 mL,在540 nm下用分光光度计测吸光值,绘制葡萄糖标准曲线｡2)内切葡聚糖酶活力(CMCase activity,CMCA)测定｡取4支干净试管,编号(分别为1~4)后加入1.5 mL底物溶液,并向1号试管中加入1.5 mL DNS溶液以钝化其中的纤维素酶,作为空白对照,比色调零｡4支试管置于50℃水浴中预热5 min,再加入0.5 mL酶液(液体发酵液的离心上清液),50℃水浴30 min后立即向2､3､4号试管加入1.5 mL DNS溶液以终止酶反应｡充分摇匀后沸水浴5 min,取出冷却后,加入去离子水定容至10 mL,充分混匀｡以1号试管为空白对照,540 nm测吸光值,2､3､4号3支试管数值取平均值｡3)滤纸酶活力(FPA)测定｡方法同上,将底物溶液换成1 mL缓冲液和50 mg滤纸,加入的酶液量为1 mL,反应时间为1 h｡4)β-葡萄糖苷酶活力(BGL)的测定｡方法同上,将底物溶液换成1.5 mL含0.05%水杨苷的醋酸缓冲液,反应时间为1 h｡5)酶活定义｡在上述条件下,1 mL粗酶液所产生的1 μg葡萄糖定义为一个酶活力单位(U)｡以上的测定中均已扣除了粗酶液中所含有的还原糖量｡1.2.4产纤维素酶菌株的鉴定①菌株的形态特征:菌株平板培养2~3 d,观察菌落形态特征,菌体形态经染色(革兰氏染色､鞭毛染色､芽孢染色等)后,于显微镜的100倍油镜下观察并照像｡②菌株的生理生化特性:生理生化试验包括糖发酵试验､V. P试验､甲基红试验､吲哚试验､柠檬酸盐利用试验､淀粉水解试验､明胶水解试验等｡1.2.5产酶条件的优化对复筛得到的菌株进行产酶条件的优化试验｡1)摇瓶生长曲线的测定｡在基础培养基的基础上,对复筛得到的菌株测定其在摇瓶培养中的生长曲线和产酶曲线,考察菌体生长状况与菌株产酶能力在时间上的相关性｡2)接种量的确定｡将培养12 h的种子液分别以1%､2%､3%､4%､5%､6%､7%､8%､9%､10%､11%､12%､13%､14%､15%､16%的接种量转接入30/250 mL产酶培养基中,置于37℃,180 r/min摇床培养,测定酶活,考察不同接种量对菌株产酶的影响｡3)培养基成分的优化｡①碳源种类对菌株产酶的影响:分别以1%的CMC-Na､葡萄糖､蔗糖､乳糖､酵母膏､牛肉膏､酵母粉､麦芽浸粉､秸秆汁､米糠作为碳源,摇瓶培养后测定酶活,考察碳源种类对菌株产酶的影响｡②氮源种类对菌株产酶的影响:分别以1%的(NH4)2SO4､NH4NO3､KNO3､蛋白胨､尿素､酵母膏､酪蛋白胨作为氮源,以1%葡萄糖作为碳源,摇瓶培养后测定酶活,考察氮源种类对菌株产酶的影响｡③NaCl浓度水平对菌株产酶的影响:在原始液体产酶培养基的基础上分别加入0.1%､0.2%､0.3%､0.4%､0.5%､0.6%､0.7%､0.8%､0.9%､1.0%的NaCl,摇瓶培养后测定酶活,考察NaCl浓度水平对菌株产酶的影响｡④底物(CMC-Na)浓度水平对菌株产酶的影响:在原始液体产酶培养基的基础上分别加入0.1%､0.2%､0.3%､0.4%､0.5%､0.6%､0.7%､0.8%､0.9%､1.0%的CMC-Na,摇瓶培养后测定酶活,考察底物浓度水平对菌株产酶的影响｡⑤根据上述试验得到的最适培养基组成,选取L9(34)型正交表设计正交试验,试验因素和水平见表1,以上清液酶活大小为指标,选择最优培养基组成｡2结果与分析2.1纤维素酶产生菌的初筛采用刚果红染色法从瓢虫肠道中分离纯化得到16株透明圈较大的细菌,细菌编号及其D/d值分别为:B-1,6.167;B-35,5.667;B-11,5.000;B-19,4.750;B-9,4.000;B-26,3.750;B-37,3.000;B -27,1.833;B-53,3.000;B-47,2.714;B-36,2.667;B-42,2.571;B-32,2.500;B-46,2.429;B-1 2,2.083;B-10,1.420｡2.2纤维素酶产生菌的复筛对初筛得到的16株菌株进行摇瓶复筛,以CMCA为指标,筛选出B-12､B-10､B-53､B-11等4株产纤维素酶活力较高的菌株,CMCA(3次测定的平均值)分别为76.85､68.85､53.94､71.27 U/mL｡菌株B-12的CMCA最高,该菌株用以后续的试验｡2.3DNS法葡萄糖标准曲线葡萄糖标准曲线如图1所示,得到方程y=0.916 9x-0.110 4,r2=0.991 4｡2.4菌株B-12的初步鉴定2.4.1形态特征菌株B-12在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上菌落较大､圆形､边缘整齐､不透明､乳白色､微隆起､湿润､生长较快｡显微镜观察细胞呈杆状,两头稍平;周生鞭毛,革兰氏染色呈阳性;芽孢椭圆形或柱状,中生或偏端生,芽孢囊不膨大｡2.4.2生理生化特征V.P反应为阴性,吲哚反应､甲基红反应为阳性｡该菌株可利用葡萄糖产酸,能水解淀粉,分解明胶,不能利用柠檬酸盐｡结合形态特征和生理生化特征,参考《伯杰细菌鉴定手册》第八版,将菌株B-12鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)｡2.5产酶条件的优化2.5.1摇瓶生长曲线的确定在原始培养基基础上从发酵开始至72 h,连续取样,在600 nm下测定生物量,离心后取上清液测定酶活,得到与时间相关的该菌株的生长曲线以及产酶曲线(图2､图3)｡由图2､图3可知,在3 h左右菌株进入对数生长期,16 h左右菌株生长开始进入稳定期,44 h以后开始进入衰亡期｡CMCA､FPA､BGL开始时增长较为缓慢,CMCA､BGL在44 h时达到最大值,FPA在47 h时达到最大,综合考虑将最佳培养时间定为44 h｡总体趋势表明菌株B-12的产酶能力与菌体生长状况有耦连相关性｡在44 h时CMCA为102.694 U/mL,FPA为7.187 U/mL,BGL为14.593 U/mL｡2.5.2不同接种量对菌株酶活力的影响不同接种量对菌株酶活力的影响结果见图4｡综合考虑,在接种量为6%时3个酶活指标均较高,CMCA为73.901 U/mL,FPA 为8.232 U/mL,BGL为7.140 U/mL｡因此最佳接种量选择6%｡2.5.3不同碳源对菌株B-12酶活力的影响碳源对微生物生长代谢的作用主要是提供细胞碳架､细胞生命活动所需的能量以及合成产物的碳架｡根据微生物所能产生的酶系不同,不同的微生物可利用的碳源不同｡在产酶培养基的基础上改变不同的碳源检测菌株B-12的产酶情况｡由图5可知,不同种类的碳源对菌株产纤维素酶影响不同,其中麦芽浸粉作为碳源时3个酶活指标均较高,CMCA为74.592 U/mL,FPA为6.778 U/mL,BGL为7.667 U/mL｡因此确定麦芽浸粉作为菌株B-12的产酶培养基的适宜碳源｡2.5.4不同氮源对菌株酶活力的影响氮源是合成菌体蛋白质､核酸及其他含氮化合物的重要组成成分｡不同种类的氮源对菌株的产酶影响结果见图6｡当KNO3作为氮源时,3个酶活指标均较高,CMCA为230.080 U/mL,FPA为101.636 U/mL,BGL 为93.009 U/mL｡因此确定该菌株的产酶培养基的适宜氮源为KNO3(图6)｡2.5.5NaCl浓度对菌株酶活力的影响试验设置了0.1%､0.2%､0.3%､0.4%､0.5%､0.6%､0.7%､0.8%､0.9%､1.0%等10个NaCl浓度梯度,在不同NaCl浓度下测定纤维素酶的3个酶活指标｡由图7可知,当NaCl浓度为0.2%时,CMCA活性最高,为75.137 U/mL,FPA和BGL活性相对较高,分别为5.533 U/mL和7.485 U/mL｡因此,NaCl浓度为0.2%时菌株B-12的酶活较大｡2.5.6底物(CMC-Na)含量对菌株酶活力的影响试验测定CMC-Na不同添加量(0.1%､0.2%､0.3%､0.4%､0.5%､0.6%､0.7%､0.8%､0.9%､1.0%)时菌株B-12的产酶水平｡由图8可知,当CMC-Na浓度达到0.2%时,CMCA活性最高,为90.043 U/mL,FPA和BGL活性相对较高,分别为7.287 U/mL和7.213 U/mL;表明菌株B-12适宜底物(CMC-Na)浓度为0.2%｡2.5.7最适培养基组成确定选取L9(34)型正交表设计正交试验,以上清液酶活大小为指标,选择最优培养基组成｡对正交试验结果进行极差分析(表2)可以发现对于CMCA酶活而言,主要因素的影响顺序为:麦芽浸粉>NaCl>KNO3>CMC-Na,最佳组合为:1.25%麦芽浸粉､1.0% KNO3､0.1% NaCl､0.2% CMC-Na｡对于FPA酶活,主要因素的影响顺序为:CMC-Na>NaCl>KNO3>麦芽浸粉,最佳组合为:1.25%麦芽浸粉､1.5% KNO3､0.2% NaCl､0.1% CMC-Na｡对于BGL酶活,主要因素的影响顺序为:KNO3>CMC-Na>麦芽浸粉>NaCl,最佳组合为:1.25%麦芽浸粉､1.5% KNO3､0.2% NaCl､0.1% CMC-Na｡综合考虑,最终确定最佳培养基配方为:1.25%麦芽浸粉,1.5%KNO3,0.2%NaCl,0.1% CMC-Na｡此时,CMCA､FPA和BGL分别为111.710 U/mL､35.017 U/mL和116.799 U/mL,较菌株培养44 h时的酶活分别提高了8.78%､387.23%和700.38%｡3讨论利用刚果红平板法初筛得到的透明圈比值大的菌株,其酶活并不一定高｡试验中我们发现菌株B-1的透明圈比值高达 6.167,而菌株B-12的透明圈比值仅为2.083,但从摇瓶发酵复筛结果看,菌株B-12的酶活要高于B-1的｡因此,在筛选纤维素酶高产菌株时,摇瓶发酵复筛是必要的｡我们首次从马铃薯瓢虫肠道中分离得到多株产纤维素酶肠道菌并筛选到1株酶活性较高的菌株B-12,产酶条件经优化后,其CMCA为111.710 U/mL,FPA为35.017 U/mL,BGL为116.799 U/mL｡而采用同样的酶活测试方法,林祥木等[17]从土壤中分离得到的最好的菌株其CMCA为36 U/mL,FPA为31 U/mL,BGL不足41 U/mL｡昆虫是地球生物圈中已知种类最多的一群生物[18,19],昆虫种类､数量及分布范围的多样性意味着昆虫肠道菌的多样性[20]｡研究表明昆虫肠道菌是微生物新种的潜在资源[21,22]｡因此,昆虫肠道菌可能是新高产纤维素酶的广泛来源,而从昆虫肠道菌分离产纤维素酶菌还鲜有报道,亟待研究开发｡参考文献:[1] TOMME P, WARREN R A J, GILKES N R. 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产纤维素酶菌株的筛选及其酶活的测定
本科开放项目题目：产纤维素酶菌株的筛选及其酶活的测定学生姓名：指导教师：学院：专业班级：2016年3月产纤维素酶菌株的筛选及其酶活的测定摘要纤维素作为植物光合作用的主要多糖类产物，是高等植物细胞壁的主要成分，是公认的自然界数量最丰富、最廉价的可再生有机物质资源。
据估计，纤维素生成量每年高达1000亿吨。
我国每年农作物秸秆总产量为7亿吨左右，仅农业生产中形成的农作物残渣（如稻草、玉米秸、麦秸等），每年就有5亿吨之多。
纤维素的降解是自然界碳素循环的中心环节。
但由于纤维素的结构特点，对纤维素的利用仍然非常有限。
目前仅有20%的纤维素物质被开发利用，大量的纤维素物质因无法分解利用而废弃，不仅造成资源浪费，而且污染环境。
随着人口数量的不断增长和人民生活水平的不断提高，能源危机、食物短缺、环境污染等问题日益严重，寻找利用可再生资源、节省粮食、减少环境污染的有效途径显得日趋重要。
采用微生物技术处理秸秆是当前研究最多的一种秸秆处理方法,纤维素酶能将天然纤维素降解,生成纤维素分子链、纤维二糖和葡萄糖,然而目前制约纤维素材料转化为乙醇并实现产业化的关键因素之一是纤维素酶效率低下,从而造成生产成本过高。
因此,筛选具有高活性纤维素酶的秸秆降解微生物菌株以及相关研究是当前研究的热点和难点。
关键词：纤维素降解高活性纤维素酶微生物菌株目录第1章绪论 (1)1.1 实验原理 (1)1.2 实验仪器及试剂 (2)1.2.1 实验材料 (2)1.2.2 实验仪器 (2)1.2.3 培养基 (2)第2章实验步骤 (3)2.1 采样培养 (3)2.2 初筛 (4)2.3 复筛 (4)2.4 酶活的测定 (4)2.4.1原理 (4)2.4.2溶液配制 (4)2.4.3实验步骤 (5)第3章实验结果 (7)3.1 标准曲线的绘制 (7)3.2 菌株复筛结果 (8)3.3 测定纤维素酶活力结果 (9)结束语 (10)参考文献 (11)第1章绪论1.1 实验原理自然界中存在大量的纤维素类物质，同时存在着很多能分解纤维素类物质的生物，小到细菌、放线菌、真菌，大到一些食草类昆虫与动物。
纤维素酶产生菌的筛选
纤维素酶产生菌的筛选实验原理纤维素酶是指能水解纤维素β-1，4葡萄糖苷键，使纤维素变成纤维素二糖和葡萄糖的一组酶的总称，它不是单一酶，而是起协同作用的多组分酶系，纤维素酶主要是由：C1酶（外切β-1，4葡聚糖酶）、Cx（内切β-1，4葡聚糖酶）和BG（β-1，4葡萄糖苷酶）组成[11]。
不同微生物合成纤维素酶在组成上有显著的差异，对纤维素的酶能力也大不相同。
对纤维素能进行有效降解的生物包括细菌、丝状真菌、放线菌、软体动物等. 森林土有相当多枯枝落叶和腐烂的木头等，富含纤维素，适合利用纤维素作碳源的纤维素酶产生菌生长. 实验步骤1.样品的采集在学校森林富含有机质的土壤中用取样铲，将表层5cm左右的浮土除去，取5～25cm处的土样10～25g，装入事先准备好的塑料袋内扎好.2.富集培养在培养基中加入纤维素作为唯一的碳源，那些能分解利用的菌株因能得到充分的养分而迅速增殖，而其他微生物由于不能分解利用这些物质，生长受到抑制。
培养基的制备：磷酸二氯钠0.1%,硫酸镁0.05%，硫酸铵1.5%，纤维素粉4%，PH值5.8~5.9，按比例制配培养基。
在250mL锥形瓶中装入30mL培养基，用8层纱布做成瓶塞，将瓶口塞紧，再在瓶塞外包裹两层包装纸（或报纸），用线绳扎紧，在121℃下高压蒸汽灭菌20m in。
富集培养的操作：称取土样20g，在无菌条件下加入装有30mL培养基的摇瓶中。
将摇瓶置于摇床上，在30℃下振荡培养1～2d，至培养基变混浊。
3.菌种的分离制备菌悬液：富集培养后，吸取上述培养基0.1mL稀释至10-4，10-5，10-6 。
维素-刚果红培养基的制备：硫酸铵2g，硫酸镁0.5g,磷酸氢鉀，氯化钠0.5g纤维素粉2g,刚果红0.4g琼脂22g水100ml。
在500mL三角瓶中装入200mL培养基，在121℃下高压蒸汽灭菌20min。
倒平板操作：将灭菌后的固体培养基熔化，按无菌操作的要求，在无菌的培养皿中倒入15～20mL培养基，凝固后待用。
纤维素酶产生菌的鉴定与筛选
纤维素是高等植物细胞壁的主要成分, 也是地 球上最丰富的资源。纤维素酶是一组分解植物纤维 素的酶 , 主要有 1, 4 葡聚糖水解酶( Cx ) 酶和 1, 4 葡聚糖纤维二糖水解酶 ( C 1) 酶。 它们能将植物纤 维分解为葡萄糖, 能破坏植物细胞壁, 使其释放蛋白 体、 淀粉等营养成分, 能消除饲料中非淀粉多糖的抗 营养作用, 提高饲料利用率和畜禽生产性能。饲用纤 维素酶主要由霉菌产生, 因此, 筛选出高活性纤维素 酶的菌株是开发利用纤维素资源和提高饲料营养价 值的前提和关键。故进行了本试验, 以期为生产高活 性饲用纤维素酶奠定基础 , 现报告如下。 1 材料与方法 1 1 待检样品的采集和处理 从自然界中采集朽木、 土壤、 粪堆土、 草底土、 发霉秸秆和霉变玉米等样品, 分别放入三角瓶中, 加入适量的生理盐水 , 室温浸泡 6h( 每 2h 振荡一 次 ) , 作为待检样品。 1 2 1 3 培养基 PDA 和 CCM , 按常规方法配制。 霉菌的分离培养与鉴定 用接种环将待检样品分别划线接种于 PDA 和 CCM 平坂上, 另外将数个 PDA 和 CCM 平板敞口 于试验室内 2h, 进行空气接种 ; 将接种的平板置 28 恒温箱中培养 3~ 7 天。然后 , 采用挑取典型单 个菌落法或稀释后涂抹平板法进行纯培养。分纯后 的菌株接种于试管斜面保存菌种, 接种于平板观察 培养性状及孢子和菌丝形态特征。 1 4 纤维素粗酶液的制备 称取稻草粉 3g, 麦麸 2g , 于 250m L 三角瓶中, 加入 1% 硫酸铵溶液 ( 以自来水为溶剂配制) 10mL , 混匀后 121 3 灭菌 30min, 接种斜面霉菌孢子一 环 , 充分摇匀后于 28 培养 72h 成曲 ( 脂 ( P DA) 板和察氏培养基 ( CCM ) , 从自然界和饲料中分 离出 6 种 8 株霉菌 , 分别是产黄青霉 1 株 ( 9908) , 米根霉 1 株 ( 9917) , 米曲霉 1 株 ( 9935) , 高大毛霉 1 株 ( 9939) , 黑曲霉 2 株 ( 9930、 9934) , 绿色木霉 2 株( 9916、 9942) 。 经 滤纸崩溃法、 CMC 糖化力、 棉花糖化力测定, 证明 8 株菌能产生纤维素酶。 其中产 Cx 酶 高的菌株是 9930、 9934, 产 C1 高的菌株是 9930、 9934、 9942。 关键词 霉菌 ; 纤维素酶 ; 鉴定; 筛选 一次 ) , 加蒸馏水 100m L , 40 恒温水浴 培养 1h( 每 15m in 摇动一次 ) , 用脱脂 棉过滤, 滤液为粗酶液, 另设一瓶不接 种的培养基滤液, 为对照溶液。 1 5 纤维素酶活力的测定 1 5 1 滤纸崩溃法( C 1 酶 ) 在 200mL 三 角瓶中 加 8m L 粗酶 液, 2mL 0 2m ol/ L 、pH 4 6 醋酸缓冲 液, 2 张 1 1cm 大小的新化滤纸 , 45 保温 , 反复振荡 ( 100 次 / 分) , 观察滤纸 刘 崩溃程度 , 记录滤纸完全消失所需要的 时间。 用对照溶液代替粗酶液作为对照 颖 组, 其余同试验。 1 5 2 羧甲基纤维素钠盐 ( CM C) 糖 化力 ( Cx 酶) 取 0 5mL 适当稀释的粗酶液 , 加 入 2mL 1% CM C 溶液 , 50 水浴中反 邵 红
产纤维素酶菌株的筛选及酶学性质研究
产纤维素酶菌株的筛选及酶学性质研究自然界中的纤维素资源极为丰富,如果能对这些纤维素资源加以利用,不仅保护了环境,又可实现资源回收利用,因此国内外对于纤维素酶的研究一直是个研究热点。
本研究从腐植土里筛选出具有降解纤维素酶能力的放线菌一株,通过单因素及正交试验确定其最适的产酶发酵培养基;用生理生化及分子生物学方法鉴定该放线菌;对该纤维素酶进行酶学研究;最后通过分离纯化以获得较高纯度的内切酶。
研究为放线菌所产纤维素酶的特性提供理论依据,对高纯度纤维素酶的获取及开发利用具有指导意义。
1.试验通过对腐植土中具降解纤维素能力的菌进行筛选,最终确定筛得放线菌一株,并编号NO.11,其在CMC-Na液体培养基中,内切型-β-葡聚糖酶酶活为30.06U·mL-1,外切型-β-葡聚糖酶酶活为10.40U·mL-1,β-葡萄糖苷酶酶活为8.05U·mL-1,FPA酶酶活为 13.88U·mL-1。
2.通过对菌株NO.11进行生理生化及分子生物学鉴定,最终确定该菌为暗灰链霉菌。
3.通过正交实验,得出菌株NO.11最适的产酶培养基配方为:0.2%的牛肉膏,2%的稻草粉,初始pH7.5,0.3%的KH2PO4,接种量为6%,发酵温度为32℃,发酵时间为5 d。
在此条件下菌株NO.11的CMC酶活力为55.28 U·mL-1,其产酶能力明显提高。
4.为获得更高纯度的纤维素酶,试验通过硫酸铵分级盐析、透析、葡聚糖凝胶G-100柱层析分离纯化纤维素酶。
试验结果显示,最终纯化得到的酶液酶活为53.09U·mL-1,比活力为211.22 U·mg-1,纯化倍数为1.90倍。
通过SDS-PAGE可知,该放线菌所产CMC酶的分子量在65kDa左右,经硫酸铵盐析、透析、Sephadex G-100柱层析后,电泳检测其可达到电泳纯。
5.在菌株NO.11所产内切酶、外切酶、β-葡萄糖苷酶的酶促反应中,其最适pH值为4.5;滤纸酶、外切酶及β-葡萄糖苷酶的最适反应温度均为50℃;内切酶的最适反应温度为55℃;内切酶在pH值4.0-6.5间其相对酶活在70%以上;在30-60℃的反应温度下,其相对酶活在70%以上;金属离子Mg2+,Ca2+,Mn2+对各酶均有激活作用。
产纤维素酶菌种的筛选与优化
产纤维素酶菌种的筛选与优化目记录实验1分离和初筛实验2复筛和保存实验3酶活测定和继代保存实验实验4紫外诱变育种实验5产纤维素酶菌株产酶条件优化实验6产酶条件优化结果实验1了解产纤维素酶微生物分离的基本原理；2.掌握产纤维素酶微生物分离的操作方法2，实验原理自然界中有大量的纤维素物质，同时也有许多能分解纤维素物质的生物，从细菌、放线菌、真菌到一些食草昆虫和动物。
这些生物和绿色植物一起构成了世界的碳循环。
在发酵堆肥中，有大量耐高温纤维素分解菌，但大多数是混合分解菌。
菌株需要1。
内切葡萄糖苷酶(endo-1，4-β-d-葡聚糖酶，简称EC 3.3.1.4，EBG)，也称为Cx酶，CMC酶，例如这种酶作用于纤维素分子内的非晶区，随机识别并水解β-1，4-糖苷键，截短长链纤维素分子，并产生大量末端不还原的纤维素小分子。
2.胞外-1，4-β-D-葡聚糖酶(酶代码3.2.1.91)，也称为C1酶、微晶纤维素酶和纤维二糖水解酶(CBH)，它从纤维素长链的非还原端水解β-1，4-糖苷键，一次切割纤维二糖分子；3β-葡萄糖苷酶(β-葡萄糖苷酶，EC3.2.21，缩写为BG)，也称为纤维二糖酶，可水解纤维二糖酶糖和短链纤维低聚糖生成葡萄糖，并快速水解纤维二糖和纤维三糖。
随着葡萄糖聚合酶的增加和水解率的降低，这种酶的特异性相对较差。
只有三种酶协同作用，才能很好地分解纤维素。
就单个菌落而言，木霉、曲霉和青霉等霉菌具有较高的总体酶活和较大的产量，因此用于畜牧业和饲料工业的纤维素酶主要是真菌纤维素酶。
在本实验中，以羟甲基纤维素钠为唯一碳源的培养基作为筛选培养基。
只有能将纤维素水解成单糖并加以利用的微生物才能在筛选培养基上生长。
从筛选培养基中分离产生纤维素酶的微生物。
使用羧甲基纤维素钠(CMC-Na)作为唯一碳源，并使用CMC-Na通过微生物分解来分离能够产生纤维素酶的菌株。
刚果红是一种酸性染料，可与纤维素反应形成红色络合物。
高产纤维素酶生产菌的筛选及诱变育种
14
1.1.3 试剂 1mg/mL 葡萄糖标准液: 葡萄糖置于 110℃烘箱
中烘 2h 至恒重，称取 0.1g 烘好的葡萄糖，溶解并定 容至 100mL。
0.01M 乙酸-乙酸钠缓冲溶液 (pH4.8):A 液：冰 醋酸 6mL，蒸馏水定容至 1000mL，配制成 0.1M 醋酸 溶 液 ；B 液 ： 称 取 8.2g 醋 酸 钠 ， 蒸 馏 水 定 容 至 1000mL，配制成 0.1M 醋酸钠溶液；以 A：B=4：6 的比 例混合，低温冷藏备用。
5g 固 体 曲 湿 料 加 50mL 去 离 子 水 ，30℃ 浸 提 6min，纱 布 过 滤 ，3000r/min 15min，上 清 液 即 为 用 于 测定的固体曲酶液。 1.2.4.2 DNS 法测定波长的确定
取 0.5mL 葡萄糖标准液及 0.5mL 蒸馏水分别置 于 25mL 试 管 中 ，再 各 加 2mL DNS 试 剂 ，沸 水 浴 加 热 5min，流水冷却，蒸馏水定容至 25mL。 将 DNS 试 剂-水(空白)、葡萄糖显色液-DNS 试剂(空白)分别在 波长 400nm～600nm 范围内进行扫描。 1.2.4.3 葡萄糖标准曲线的绘制
第 46 卷（总第 155 期）
Food and Fermentation Technology
第 46 卷（第 1 期） Vol.46，No.1
高产纤维素酶生产菌的筛选及诱变育种
方尚玲，杨丹丹，钱志伟，李小强，陈茂彬*
（发酵工程省部共建教育部重点实验室，湖北工业大学生物工程学院，湖北武汉 430068）
取 8 支洗净烘干的 25mL 比色管，编号后按表 1 加入标准葡萄糖溶液和蒸馏水， 配制成一系列不同 浓度的葡萄糖溶液。 充分摇匀后， 向各试管中加入 2mLDNS 溶液,沸水浴 5min，取出冷却后用蒸馏水定 容至 25mL，充分混匀。 在选定波长下，以 1 号试管溶 液作为空白对照， 测定其它各管溶液的 OD 值并记 录结果。 以葡萄糖含量（mg）为横坐标，以对应的 OD 值为纵坐标，绘制出葡萄糖标准曲线。 1.2.4.4 内切纤维素酶活[8](Cx，CMC 酶活)
开题报告-产纤维素酶细菌的筛选
山东科技大学
本科毕业设计（论文）开题报告题目产纤维素酶细菌的分离和筛选
学院名称化学与环境工程学院
专业班级生物工程06-2
学生姓名董超
学号 0601111003
指导教师韩秋霞
填表时间： 2010年4月4日
填表说明
1.开题报告作为毕业设计（论文）答辩委员会对学生答辩资格审查的依据材料之一。
2.此报告应在指导教师指导下，由学生在毕业设计（论文）工作前期完成，经指导教师签署意见、相关系主任审查后生效。
3.学生应按照学校统一设计的电子文档标准格式，用A4纸打印。
4.参考文献不少于8篇，其中应有适当的外文资料（一般不少于2篇）。
5.开题报告作为毕业设计（论文）资料，与毕业设计（论文）一同存档。
产纤维素酶菌及其筛选改良方法研究进展
产纤维素酶菌及其筛选改良方法研究进展1. 引言1.1 研究背景产纤维素酶是一类能够分解纤维素的酶，可以将废弃的植物纤维素有效地转化为生物能源或化学品。
由于纤维素在自然界中广泛存在且易获得，产纤维素酶逐渐成为生物质能源领域的研究热点。
目前市面上的产纤维素酶酶活性较低、稳定性差，限制了其在工业生产中的应用。
对产纤维素酶菌的筛选和改良方法进行深入研究具有重要意义。
产纤维素酶菌在自然界中具有多样性，因而研究如何高效筛选出具有优良酶活性的产纤维素酶菌成为亟须解决的问题。
通过改良产纤维素酶菌的菌种，提高其在酶活性、抗性和稳定性等方面的表现，也为产纤维素酶的应用提供了可能。
在未来的研究中，将进一步探索产纤维素酶菌的特点及筛选方法，加强对产纤维素酶菌的改良研究，不断提高产纤维素酶的性能，拓展其在生物质能源领域的应用前景。
随着技术的不断发展，产纤维素酶菌的研究将迎来更多挑战，但也将有更多的发展机遇。
愿未来产纤维素酶菌及其筛选改良方法研究取得新的突破，为生物质能源的开发和利用做出更大贡献。
1.2 研究目的本研究的目的是探索产纤维素酶菌及其筛选改良方法的研究进展，为提高纤维素降解效率和提高生物质资源利用率提供理论基础和实践参考。
具体目标包括：1.分析产纤维素酶菌的特点，揭示其在纤维素降解中的作用机制；2.探讨产纤维素酶菌的筛选方法，寻求高效、快速和经济的筛选途径；3.研究产纤维素酶菌的改良方法，提高其纤维素降解能力和稳定性；4.探讨产纤维素酶菌在生物质资源利用中的应用前景，拓展其产业化应用领域；5.分析产纤维素酶菌研究面临的挑战，并展望未来发展方向。
通过本研究，旨在推动纤维素降解技术的创新和进步，实现生物质资源的高效转化和利用。
1.3 研究意义产纤维素酶菌是一类具有生物降解纤维素能力的微生物，在生物能源开发和环境保护领域具有重要作用。
研究产纤维素酶菌及其筛选改良方法的意义在于探索更高效、更稳定的纤维素酶产生菌株，为工业生产提供更好的菌种资源。
产纤维素酶真菌的分离、筛选及酶活测定
产纤维素酶真菌的分离、筛选及酶活测定摘要产酶纤维素微生物在纤维素资源的再生转化，提高牲畜饲料利用率，堆肥的使用以及环境污染等方面具有很高的应用价值。
而分离高效纤维素降解菌是这一内容的前提与基础。
本研究利用选择培养基CMC培养基，从学校周围的土壤中分离得到6株降解纤维素的真菌。
它们都具有较强的纤维素降解能力，尤其以编号为纸绿和江白活性最高。
随后对这6种菌株进行酶活测定，从中得到一株高酶活的菌株,其在CMC培养条件下酶活达到40 U。
关键词：纤维素降解菌；筛选；纤维素酶活；鉴定Separation, screening and enzymatic activity of cellulase producedby fungiAbstractMicrobial fermentation of cellulose micro-organisms, especially fungi in the conversion of cellulose into renewable resources and improve utilization of livestock feed, compost use and environmental pollution has a high application value. And efficient cellulose degradation bacteria can provide useful help in this regard. In this study, selective medium CMC medium, Shaoyang University straw isolated six soil fungi degrade cellulose. They have a strong ability of cellulose degradation, particularly in the number of paper green and White River the highest activity. And the 6 strains with a high activity were morphological, physiological and biochemical identification. Key Words: Cellulose degrading bacteria; Filter; Cellulase activity; Identification.目录摘要 (I)ABSTRACT (II)1前言 (1)1.1纤维素概述 (2)1.2纤维素酶 (2)1.3 纤维素分解菌类 (4)1.4本文研究的目的与意义 (6)2 实验部分 (7)2.1材料 (7)2.2主要试剂与仪器 (7)2.3培养基 (8)2.4菌种的分离与筛选 (9)2.5纤维素酶活性测定 (10)2.6形态特征观察 (12)2.7生理生化特性鉴定 (13)2.8菌种保藏 (14)3 结果与讨论 (14)3.1初筛选得到的各菌株的菌落形态特征描述 (14)3.2复筛获得的菌株图片 (14)3.3葡萄糖标准曲线的绘制 (16)3.4各菌的酶活力测定结果 (17)4 结论 (18)参考文献 (19)致谢 (20)1前言纤维素是自然界中存量最大的一类可再生资源。
纤维素酶产生菌的分离和筛选方案
纤维素酶产生菌的分离和筛选方案目标：从自然界采用选择性分离的方法，获得纤维素酶的高产菌株。
意义：把含纤维的自然资源及纤维废料加以充分利用，转化成糖类作为食品工业和发酵工业的原料或制成优质饲料，具有深远的现实意义。
1.材料与方法1.1材料与仪器1.1.1原辅料土壤品来自南阳理工学院以下各处离地表3-8cm深处泥土装入塑料瓶中，带回实验室处理。
（1）新校区竹林腐叶下的土壤（2）校门口东边的松树林腐叶子下的土壤（3）老操场草坪下的土壤（4）2号教学楼后面花园的土壤1.1.2试剂羧甲基纤维素CMC、NaCl、MgS04·7H20、KH2P04、酵母浸粉、蛋白胨、蒸馏水、琼脂、Na2HP04、酵母膏、刚果红试剂。
1.1.3仪器小铁铲和无菌纸或袋（可省）、小烧杯、100ml量筒、滤纸、漏斗、棕色试剂瓶、三角烧瓶5个、高压蒸汽灭菌锅、培养皿6个、载玻片、盖玻片、普通光学显微镜、量筒、滴管、吸水纸、无菌水试管5支（每支4.5mL水）、烧杯3个、电炉、玻璃棒、接种环、镊子、恒温培养箱、高温灭菌锅、移液枪（枪头10个）、天平、pH试纸等。
1.2培养基及试剂的配制1.2.1培养基配制初筛培养基A：羧甲基纤维素CMC 20g、NaCl5．0g、MgS04·7H20 0．2g、KH2P04 1．0g、酵母浸粉 5.0g、蛋白胨10g、蒸馏水1000mL、琼脂20g，pH自然，121℃湿热灭菌20min。
复筛培养基B：CMC 20g、Na2HP042．5g、KH2P041．5g、MgSO4·7H2O 0.2g、蛋白胨2．5g、酵母膏O．5g、蒸馏水1000mL、琼脂20g，pH自然，121℃灭菌20min。
2.2.2试剂配制1％刚果红试剂：称取刚果红试剂1g于干净的小烧杯中，用量筒量取蒸馏水100ml使之溶解，过滤，贮于棕色试剂瓶中。
2.3方法2.3.1初筛的方法步骤(1)配初筛培养基A，灭菌，倒平板。
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(7) .测定诱变后菌株的透明圈并将其菌株发酵测其酶活 力。
(8).菌株生长及产酶特性测定:活化菌株接种CMC发酵培 养基，接种量5％，30℃、200rpm下培养，定时取样测定 培养液的OD600和CMC酶活力，观察菌株生长和产纤维素 酶情况，绘制菌株生长曲线与产酶曲线图。优化菌株的 培养条件，对3-12的pH值条件以及25-37℃温度条件下菌 株生长也进行观察。
二.试验目的
目前，酸性纤维素酶主要用于纤维素的水解糖化， 而碱性纤维素酶则广泛用于洗涤工业。不过，至 今所研发的纤维素酶仍存在酶活力不足等问题， 有必要挖掘新的酶资源。
三. 技术路线
产纤维素酶菌株的初筛
产纤维素酶菌株的复筛
诱变育种 测其透明圈及酶活力
优化产酶菌株的培养条件
制备酶液
产高活性纤维素酶菌株的鉴定
(5).菌株生化鉴定:采用Biolog 微生物鉴定系统进行。操作按仪 器的说明书进行。
(6).诱变育种：
●制备孢子悬液：取试管斜面，用无菌水洗下孢子，装入带 玻璃珠的三角瓶中，27℃振荡2-3h，用脱脂棉过滤后，以10倍 稀释法作一系列稀释，挑选一个稀释度，用移液管移l ml饱子 悬液到小塑料离心管中，待用。
研究进展：
该类酶上世纪40年代首次被发现。早期发现的纤维素 酶主要由丝状真菌的木霉、根霉等菌种产生，通常为酸 性 酶其最适作用pH值在3-5，在碱性条件下基本没有酶 活或活力很低。上世纪70年代，在嗜碱性的枯草芽孢杆 菌(Bacillus sp. N-4 和 Bacillus sp.1139 菌株)中发现了最 适作用pH在碱性范围的纤维素酶，即碱性纤维素酶。随 后发现芽孢杆菌属(Bacillus)和链霉菌属(Streptomyces) 的数十株嗜碱性菌株均能够产生碱性纤维素酶，此外， 动物源碱性纤维素酶开始被报道，并成为开发碱性纤维 素酶的重要方向。
(9). 酶液制备:活化菌株接种CMC发酵培养基30℃、200 rpm培养48 h，取培养液，4℃，4000 rpm离心10 min，取 上清，55%(NH4)2SO4溶液沉淀粗蛋白,4℃，10000 rpm离 心10 min，收集沉淀，加入培养液同体积的pH值8.0，0.1 mol/L的Tris-HCL缓冲液溶解，４℃保存，用于测定酶的 活力，2 d内使用。
(3).仪器:菌种鉴定96孔板
2.方法
(1).菌株初筛：取样品1 g，加10 mL无菌蒸馏水，充分 振摇，静止30 min，取上清液稀释105倍，涂布接种 CMC-刚果红平板筛选培养基，30℃培养72 h至菌落长 出，挑取透明水解圈较大的菌落。
(2).菌株复筛：挑取透明水解圈较大的菌落，接种 CMC液体发酵培养基，37℃、200rpm摇瓶培养24 h， 测定培养液的碱性CMC酶活力，选取活力最高的培 养瓶，取菌液划线接种CMC-刚果红平板筛选培养基 培养，纯化菌种３次，最后得到产碱性纤维素酶的 高产菌株，命名，斜面和冷冻干燥保藏。
(11).比较诱变菌株与原菌株的酶活力。
(12).绘制菌株生长曲线与产酶曲线图:以最适的pH, 温度 条件培养产酶菌株，每隔4 h 取一次发酵液，测定OD600 值与纤维素酶活力，绘制菌株生长曲线与产酶曲线图。
(10).酶活力测定:以CMC钠盐为底物，测定CMC酶活力。 酶 反应体系 含粗酶液 0.5mL， CMC钠 盐 1%(g/ mL)， 0.1mol/L的Tris-HCL(pH值为8.0)缓冲液2.0 mL。50℃水 浴反应60 min，立刻用DNS法测定CMC水解所释放的葡 萄糖量。以作用CMC钠盐底物1min释放1 mg葡萄糖所 需的酶量定义为１个酶活力单位。
●紫外(UV)诱变方法：距离紫外灯30cm左右照射60s、70s、 80s、90s、100 s，并不断摇动。
● 硫 酸 二 乙 酯 (DES) 诱 变 方 法 : 分 别 吸 取 1ml 孢 子 悬 液 10ulDES(终浓度为1%)和30ul乙醇溶液于一小塑料离心管中， 于30℃水浴振荡45min、60min、75min，处理完毕后加入30ul 25%的硫代硫酸钠溶液终止反应。
测定酶活力
比较两种菌株酶活力 菌株形态观察 菌株分子鉴定 菌株生化鉴定
绘制菌株生长曲线和产酶曲线图 确定产纤维素酶菌株的属种
测定CMC酶的最适作用条件
四.试验方法
1. 材料和仪器
(1).用于菌株分离的样品采自畜禽堆肥。
(2).所用培养基：LB培养基、CMC-刚果红平板筛选培
养基、CMC液体发酵培养基、Bug培养基
主讲人：何 园 学 号：2014103015 时 间：2014.11.13
1. 研究背景
讲 2. 试验目的
解 3. 技术路线
内 容
4. 试验方法 5. 预期效果
6. 参考文献
一.研究背景
纤维素作为地球上最丰富的可再生有机资源，其转化和 利用对解决能源危机、粮食短缺、环境污染等问题具有 十分重要的意义。纤维素酶是能够作用于纤维素底物β1,4葡萄糖苷键的一类生物酶的总称。由于开发利用木质 纤维资源对人类社会的今后发展具有重大意义，而纤维 素酶对纤维素资源的开发起到极为关键的作用，对其研 究一直是国内外的热点。纤维素代谢也是地球生物圈碳 素循环的重要组成部分，寻找和开发高产纤维素酶菌种 ，是充分利用纤维素资源的关键。
(3).菌株的形态观察：LB培养基培养的菌体用革兰 氏染色，显微镜观察菌株形态。
(4). 分 子 鉴 定 ： 提 取 菌 体 DNA(CTAB 法，PCR扩增菌株的 16SrRNA序列。PCR产物用琼脂糖凝胶电泳检测、分离， 然后用Agarose Gel DNA Purification Kit 试剂盒切胶回收， 用T4 ligase连接到Pmd-18T载体上。将带有目的片段的载 体通过转化E.coli DH 5α菌株扩增培养后，选择阳性克隆 提取质粒测序。将测序得到的16S rRNA序列用NCBI的 BLAST2.0进行同源分析，搜索Genebank核酸数据库，根 据比对结果对菌株进行分子鉴定。