引物设计原则
设计pcr引物遵循的原则
设计pcr引物遵循的原则
聚合酶链反应（PCR）引物的设计是PCR实验成功的关键因素之一。以下是一些设计PCR引物时应遵循的原则：
1. 特异性：引物应具有高度特异性，以确保它们只与目标DNA序列结合，而不与其他非目标序列结合。这有助于避免非特异性扩增产物的形成。
2. 长度：引物的长度通常应在18到25个碱基对之间，过长或过短的引物可能导致扩增效率降低。引物长度的一般建议是20-22个碱基对。
3. GC含量：引物的GC含量应在40-60%之间。这有助于确保引物的熔解温度适中，提高引物的特异性。
4. 熔解温度（Tm）：引物的Tm是引物与模板DNA结合和解离的温度。引物的Tm应该在50-65°C之间，以确保在PCR循环中引物能够特异性结合到模板。
5. 避免自相互或异相互二聚体：引物的设计应防止引物之间或引物与模板之间发生意外的二聚体形成，这可能导致PCR反应的不稳定性。可以使用在线工具预测引物之间和引物与模板之间的二聚体。
6. 避免重复序列：引物应避免含有重复序列，以防止非特异性扩增。
7. 避免剪切位点：引物不应该包含酶切位点，以防止在PCR扩增过程中被酶切。
8. 引物对的选择：在PCR反应中，通常需要一对引物。这对引物应该相互配合，以确保它们在同一温度下工作，并且扩增产物大小符合实验要求。
9. 考虑引物的位置：引物应设计在目标序列内部，而不是在末端。这有助于确保扩增产物包含目标区域的完整信息。
10. 检查SNP和突变：引物的设计需要考虑可能存在的单核苷酸多态性（SNP）或突变。确保引物能够区分目标序列中的变异。
引物设计基本原则
引物设计基本原则
引物设计是指在引导读者进入文章主题或者吸引读者注意力的过程中，通过恰当选择和运用引言来达到预期效果的设计过程。引物的设计不仅能
够引导读者入文、稳定读者情绪，还能提高文章的可读性和吸引力。下面
是引物设计的几个基本原则：
第一，引物设计要与文章主题相关。引物在一定程度上是文章的立意
之所在，它几乎决定了读者是否会继续阅读。因此，引物与文章主题要密
切相关，能够准确传达出文章的核心思想和信息。引物与文章主题的相关
性是一个引物是否成功吸引读者的关键因素。
第二，引物设计要具有足够的吸引力。引物要能够立刻吸引读者的注
意力，使其对文章产生兴趣。可以通过新颖的观点、有趣的故事、强烈的
情感或者悬疑的描述等方式来增加引物的吸引力。同时，引物要注意与读
者的背景和兴趣相关，尽量选取读者感兴趣的内容，以便更好地吸引读者。
第三，引物设计要具有引导性。引物不仅要吸引读者，还要能够引导
读者进入文章的主题或内容。可以通过提出问题、引用权威观点、展示案
例等方式来引导读者产生思考或者兴趣，从而使其进一步阅读下去。引物
的引导性在一定程度上决定了读者是否会对文章产生深入的理解和共鸣。
第四，引物设计要与写作目的相一致。不同的写作目的对引物的要求
也不同。如果是科普文章，引物可以采用生活常识或者实验事实等方式；
如果是讲故事的文章，可以使用引人入胜的故事片段或者引用名人的话语
等方式。引物与写作目的的一致性能够更好地达到写作的目的，并且使读
者在读者的过程中不会产生迷惑或者矛盾感。
第五，引物设计要注意其长度和位置。引物的长度要适当，过长容易让读者感到疲惫，过短则不足以吸引读者的注意力。同时，引物一般放在文章的开头或者段落的开头，这样能够更好地引导读者进入文章，提高文章的连贯性和阅读流畅性。
引物设计原则(必看)
mi 引物设计原则
1、引物得长度一般为15-30 bp,常用得就是18-27 bp,但不应大于38,由于过长会导致其延长温度大于74℃,不适于Taq DNA 聚合酶进展反响。
2、引物序列在模板内应当没有相像性较高,尤其就是3’端相像性较高得序列,否则简洁导致错配。引物3’端消灭 3 个以上得连续碱基,如GGG 或CCC,也会使错误引发机率增加。
3、引物3’端得末位碱基对Taq 酶得DNA 合成效率有较大得影响。不同得末位碱基在错配位置导致不同得扩增效率,末位碱基为 A 得错配效率明显高于其她 3 个碱基,因此应当避开在引物得3’端使用碱基A。另外,引物二聚体或发夹构造也可能导致PCR 反响失败。5’端序列对PCR 影响不太大,因此常用来引进修饰位点或标记物。
4、引物序列得GC 含量一般为40-60%,过高或过低都不利于引发反响。上下游引物得GC 含量不能相差太大。
5、引物所对应模板位置序列得Tm 值在72℃左右可使复性条件最正确。Tm 值得计算有多种方法,如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T),在Oligo 软件中使用得就是最邻近法(the nearest neighbor method)。
6、ΔG值就是指DNA 双链形成所需得自由能,该值反映了双链构造内部碱基对得相对稳定性。应中选用3’端ΔG值较低(确定值不超过9),而5’端与中间ΔG值相对较高得引物。引物得3’端得ΔG值过高,简洁在错配位点形成双链构造并引发DNA 聚合反响。
7、引物二聚体及发夹构造得能值过高(超过4、5kcal/mol)易导致产生引物二聚体带,并且降低引物有效浓度而使PCR 反响不能正常进展。
引物设计原则及酶切位点选择和设计
引物设计原则及酶切位点选择和设计
1.引物长度：引物长度通常在15-30个碱基对之间，过短的引物可能
无法在目标DNA上特异性结合，而过长的引物则会增加非特异性杂交的风险。
2.引物GC含量：引物应具有适度的GC含量，一般在40-60%之间，
以确保引物的稳定性和特异性结合能力。
3.引物互补性：引物对的互补性应满足一定的要求，即引物内部无内
部连续互补序列，以免引物产生二次结构或引发非特异性杂交。
4.引物末端设计：引物设计时应考虑5'端和3'端的碱基配对，确保
引物在目标序列上合理附着并提高扩增效率。
5.引物目标区域选择：引物的目标区域应在目标序列上具有充分的特
异性，尽量避免引物与非目标序列相互作用。
酶切位点选择和设计：
1. 利用enzyme切割DNA是一种常见的分子生物学技术，合理选择和
设计酶切位点十分重要。酶切位点应在目标序列中具有充分的特异性，尽
量避免位点在非目标序列中出现，以避免非特异性切割。
2.酶切位点的选择应考虑应用的需求，例如PCR扩增、限制性酶切鉴
定等。对于PCR扩增，可根据目标序列设计引物，保证引物包含酶切位点，同时也满足引物设计的原则；对于限制性酶切鉴定，应选择与限制性酶切
位点有相关性的序列。
3.酶切位点的设计还应注意酶切位点周围的序列，避免引物或其他片
段在PCR扩增过程中产生不必要的相互作用。
4.酶切位点的设计还需注意所选择的酶切酶的酶切活性，以确保酶能
够切割目标序列，并尽量减少切割非目标序列的风险。
5.在实验设计中，还需考虑酶切位点的数量以及其相对位置，尽量避
免多个位点靠得太近或相互重叠，以减少酶切产生的DNA片段数目和长度。同时还需注意位点之间的横向特异性，以避免相同或相似的位点出现在非
引物设计原则
引物设计原则
1.合适的引物长度：引物长度通常在18-30个碱基对之间，过长或过
短的引物都不利于PCR扩增的稳定性。
2.适当的引物GC含量：引物的GC含量应在40%-60%之间，过高或过
低的GC含量都会影响引物和模板DNA的特异性结合。
3.引物特异性:引物应具有高度特异性，可以通过引物序列在数据库
中进行BLAST分析来评估引物的特异性。
4.避免引物自身的二聚体和结构性：引物序列中要避免出现自身二聚
体和结构性，这会干扰PCR扩增的效果。
5.选择高峰结构引物：在引物设计时，优先选择会形成高峰结构的引物，这有助于提高扩增效率。
6.引物末端碱基的特异性：在引物末端碱基选择时，尽量使用能够增
强特异性和避免非特异性扩增的碱基。
7.引物的熔解温度（Tm）：引物的熔解温度直接影响PCR扩增反应的
特异性和效率，应根据目标DNA的长度和序列来确定引物的Tm。
8.避免引物之间的交叉杂交：在多引物PCR反应中，引物之间的交叉
杂交会干扰扩增效果，可以通过软件模拟或实验确认引物之间没有相互杂交。
9.引物序列中避免多个重复碱基：引物序列中的多个重复碱基可能导
致非特异性扩增，应避免在引物序列中出现连续的多个重复碱基。
10.引物设计的可操作性和经济性：引物设计时，要考虑到引物合成
的成本和操作的方便性，选择价格适中的合成方法，并确保引物容易操作。
以上是引物设计的原则和考虑因素，通过合理设计和优化引物序列，可以提高PCR扩增实验的特异性、敏感性和效率，从而获得准确和稳定的实验结果。
引物设计的原则
引物设计的原则
①总原则：引物序列应具有高度的特异性，与非扩增区的同源性越
低越好。
②引物的长度：引物中与模板互补的序列应该为15~25个核苷酸长
度，上下游引物长度的差别不宜大于3bp。
③引物中四种碱基含量及分布：引物中G+C含量最好在40% ~ 60 %
/40% ~ 75%之间，四种碱基应尽可能随机分布，避免出现多聚嘌呤、多聚嘧啶和二核苷酸重复序列。引物内部特别是引物末端不能有大于3bp的反向重复序列或自身互补序列，以避免形成发夹结构。
④上下游引物之间的互补性：上下游引物之间特别是3´应避免出现
互补序列。作为一条经验性的规律，一条引物上不应该含有3个连续的与另一条引物互补的核苷酸。
⑤解链温度（Tm）：计算出来的两个引物的Tm值相差不能大于5℃。
扩增产物的Tm值与引物的Tm值相差不能大于10℃，以保证扩增产物在每个PCR循环可以有效的变性。
⑥引物3´末端的碱基：如果可能的话，每个引物的3´末端碱基应为
G或C,然而并不推荐使用3´端有……NNCG或NNGC序列的引物/一般PCR反应中，引物3´端的碱基最好不选A。引物3´端应为保守氨基酸序列，即采用简并密码少的氨基酸如Met、Trp，且要避免三联体密码第3个碱基的摆动位置位于引物的3´端。
⑦向引物的5´端添加限制性酶切位点、启动子或GC夹子等序列：
如果要向引物的5´端添加限制性酶切位点，引物应当超出限制性内切酶识别位点至少3个碱基。另5´端应再加2～4个无关碱基（保护碱基），以确保产物的酶切效果。/5´端最多可加10个碱基而对PCR反应无影响。
引物设计原则[必看]
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mi引物设计原则
1. 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38,因为过长会导致其延伸温度大于74C，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。
2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3'端相似性较高的序列，
否则容易导致错配。引物3'端出现3个以上的连续碱基，如GG(或CCC也会使错误引发机率增加。
3. 引物3'端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位
碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3
个碱基，因此应当避免在引物的3'端使用碱基A。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5'端序列对PCF影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。
4. 引物序列的GC含量一般为40-60%,过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。
5. 引物所对应模板位置序列的Tm值在72E左右可使复性条件最佳。Tm值的计
算有多种方法，如按公式Tm= 4(G+C)+ 2(A+T)，在Oligo软件中使用的是最邻近法(the n earest n eighbor method) 。
6. AG值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3'端4G值较低(绝对值不超过9)，而5'端和中间
△ G值相对较高的引物。引物的3'端的4G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。
7. 引物二聚体及发夹结构的能值过高(超过4.5kcal/mol )易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。
引物设计知识点总结
引物设计知识点总结
引物是在分子生物学和遗传学研究中广泛使用的一种技术。它主要
用于DNA或RNA的扩增、测序和检测等实验。引物设计的质量和准
确性对实验结果有着重要的影响。本文将对引物设计的知识点进行总
结和讨论。
一、引物设计的基本原则
引物设计需要考虑以下几个基本原则：
1. 引物长度：引物的长度一般在18-30个碱基对之间。过短的引物
可能导致扩增效率低下，过长的引物则可能增加非特异性扩增的风险。
2. 引物温度：引物的熔解温度（Tm）应在50-65摄氏度之间。引物
的Tm过高可能导致非特异性扩增，而过低则可能导致扩增效率下降。
3. 引物结构：引物的序列应避免高度互补部分，以减少二次结构的
形成。此外，引物的3'端应尽量避免含有GC丰富序列，以减少引物自身的二聚体形成。
二、引物序列的选择
在引物设计中，需要根据具体的实验目的和DNA序列来选择引物
的序列。以下是常见的引物序列选择策略：
1. 引物长度：引物的长度一般为18-30个碱基对。对于较短的DNA
序列或需要快速扩增的实验，可以选择较短的引物；对于复杂的基因
或需要高度特异性扩增的实验，可以选择较长的引物。
2. 引物位置：引物应位于目标序列的末端，以提高特异性。通常，
引物应位于目标序列的保守区域，并避免位于变异或多态性较高的区域。
3. 引物序列：引物的序列应避免高度互补部分，以减少二次结构的
形成。此外，引物的GC含量应适中，避免过高或过低。
三、引物设计工具
为了帮助科研人员进行引物设计，许多在线工具和软件被开发出来。以下是一些常用的引物设计工具：
1. Primer3：Primer3是一个广泛使用的引物设计工具，可以根据用
引物的设计原则
1、引物长度一般为15-30bp，常用的为18-27bp，但不能大于38bp；
2、引物GC含量一般为40%-60%，以45-55%为宜，上下游引物GC含量和Tm值要保持接近；
3、引物所对应的模板序列的Tm值最好在72℃左右，至少要在55-80℃之间，Tm值曲线以选取72度附近为佳，5'到3’的下降形状也有利于引物与模板的结合；
4、ΔG值（自由能）反应了引物与模板结合的强弱程度，3'端的ΔG值相对要低，且绝对值不要超过9，否则不利于正确引发反应，3'末端双链的ΔG值在0--2kcal/mol时，PCR产量几乎达到百分之百，但在-6时只达到40%，-8时少于20%，-10时接近于0；
5、错配率一般不要超过100，否则会出现非目的条带。但对于某些特定的模板序列，还应结合比较其在正确位点的引发效率。如果两者相差很大，比如在正确位点的引发效率为340以上，而在错误位点的引发效率为110，并且不好找到其他更合适的引物，那么这对引物是可以接受的；
6、Frq曲线为Oligo6软件新引进的一个指标，解释了序列片段存在的重复几率大小，选取引物时，应该用Frq值相对较低的片段；
7、引物二聚体及发卡结构的能量的绝对值一般不要超过4.5，否则容易产生引物二聚体而且会降低引物浓度从而导致PCR不能正常发生；
8、3'端最好不要是连续碱基，GGG或CCC会导致错误的引发，同时3'端最后一个碱基最好不要是A或T，若是，会导致错配；
9、以公式Tm=4*（G+C）+2*（A+T）-5计算Tm值，也就是退火温度。选择较低Tm值的引物的退火温度为反应的退火温度，最好保证每个引物的Tm值相匹配，且在70-75℃范围内；
引物设计原则是什么？
引物设计原则是什么？
1、引物长度一般在15-30bp。常用的为18-27bp，但不应大于38bp，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应；
2、引物GC含量一般为40%-60%， 45-55%为宜，GC含量过高或过低都不利于引发反应。上下游引物GC含量和Tm值要保持接近；
3、引物所对应的模板序列的Tm值最好在72℃左右。至少要在55-80℃之间。
4、引物3’端的碱基一般不用A。A在错误引发位点的引发效率相对比较高。引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，或者引物3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。
5、碱基要随机分布，且引物自身和引物之间不能有连续4个碱基的互补。
6、尽量在Exon junction上设计引物，限制基因组DNA扩增。
7、使用BLAST检索，确认引物特异性
引物设计的原则
引物设计的原则
引物设计的原则
1. 引物3’端的碱基一般不用A，因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高。另外引
物间3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5’端序列对PCR影响不大，因此常用来引进修饰位点或标记物。
2. 引物的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含
量不能相差太大。
3. ΔG值(自由能)反映了引物与模板结合的强弱程度。一般情况下，引物的ΔG值最好呈
正弦曲线形状，即5’端和中间ΔG值较高，而3’端ΔG值相对较低，且不要超过9（ΔG值为负值，这里取绝对值），如此则有利于正确引发反应而可防止错误引发。
4. 引物二聚体及发夹结构的能量一般不要超过4.5，否则容易产生引物二聚体带而且会降
低引物浓度从而导致PCR正常反应不能进行，与二聚体相关的一个参数是碱基的分布，3’端的连续GGG或CCC会导致错误引发。
5. 对引物的修饰一般是增加酶切位点，应参考载体的限制酶识别序列确定，常常对上下游
引物修饰的序列选用不同限制酶的识别序列，以有利于以后的工作。
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引物设计原则（必看）
引物设计原则（必看）
mi引物设计原则
1. 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。
2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加。
3. 引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A 的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。
4. 引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。
5. 引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo软件中使用的是最邻近法(the nearest neighbor method)。
6. ΔG值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端ΔG值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间ΔG
值相对较高的引物。引物的3’端的ΔG值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。
7. 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。
引物设计原则（必看）
引物设计原则（必看）
mi引物设计原则
1. 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。
2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加。
3. 引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A 的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。
4. 引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。
5. 引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo软件中使用的是最邻近法(the nearest neighbor method)。
6. ΔG值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端ΔG值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间ΔG 值相对较高的引物。引物的3’端的ΔG值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。
7. 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。
引物设计原则最全汇总
引物设计原则最全汇总
1.特异性：引物应与所需扩增的目标序列特异性结合，避免与非目标序列发生非特异性结合，以确保产生准确结果。
2.高GC含量：引物的GC含量应高于50%，以增加引物与目标序列的稳定性和特异性。
3.避免酶切位点：在引物设计过程中，应避免引物与目标序列中的酶切位点重叠，以防止扩增产物的酶切降解。
4.引物长度：引物的长度通常在18至30个核苷酸之间，过长的引物会降低特异性，而过短的引物则可能导致非特异性扩增。
5.引物的Tm值匹配：引物的熔解温度（Tm）应在同一PCR反应中保持一致，以确保引物能同时结合于目标序列并发挥作用。
6.避免互补性：在引物设计过程中，应避免引物之间存在互相互补的情况，以防止互补引物之间的杂交，从而导致错误的扩增结果。
7.引物末端修饰：常用的引物末端修饰包括磷酸化、末端标记和引物的截断，通过这些修饰可以提高引物的选择性和特异性。
8.引物的GC平衡：引物的GC含量应在一定范围内均衡，以避免在PCR反应中产生二聚体或无效的扩增。
9.引物序列的重复性：引物设计中应避免引物序列的重复性，以防止引物产生二聚体或与非目标序列互补结合。
10.引物的独特性：在引物设计中，应确保引物序列在目标基因组中的唯一性，避免与非目标序列存在相似区域。
11.引物的结合位点：引物的结合位点应尽可能位于目标序列的保守
区域，以增加引物与目标序列的稳定性和特异性。
12.引物的交叉反应：在引物设计中，应避免引物之间存在交叉反应，即两个不同引物同时与同一目标序列结合。
13.引物与模板序列的一致性：在引物设计过程中，应将引物与目标
引物设计原则 -回复
引物设计的原则
引物设计是分子生物学实验中的重要环节，优良的引物设计可以提高基因扩增的特异性和效率，减少非特异性扩增和假阳性结果。本文将详细解析引物设计的原则，包括特异性、长度、G/C含量、引物自身互补、引物之间互补、引物与模板的结合、引物端部的选择以及引物设计的软件辅助等方面。
1. 特异性
引物设计的首要原则是确保其具有特异性。引物应与模板DNA序列互补，且只与目标基因特异性的区域结合，避免与非目标基因或非特异性区域结合。特异性取决于引物的序列和长度，一般推荐使用具有20-24个核苷酸的引物。
2. 长度
引物的长度也是设计时需要考虑的因素。引物长度太短会降低特异性，而太长则可能导致结合不稳定和定量不准确。根据扩增体系和目标基因的特点，选择合适的引物长度，通常在18-28个核苷酸之间。
3. G/C含量
G/C含量是指嘌呤（G、A）与嘧啶（C、T）之间的比例。不同生物体内的基因G/C含量存在差异，因此设计引物时应考虑这一因素。一般来说，G/C含量在40%-60%之间可以获得较好的扩增效果。
4. 引物自身互补
引物自身互补是指两条引物之间形成二聚体或发夹结构的能力。这种互补结构会干扰引物与模板的结合，导致扩增失败或效率降低。因此，设计引物时应避免引物自身互补，选择反向互补的两条引物。
5. 引物之间互补
除了引物自身互补外，两条引物之间也可能形成互补结构。这种互补结构也会干扰扩增反应，因此设计引物时应避免这种情况。可以通过软件辅助设计，使两条引物的互补程度降到最低。
6. 引物与模板的结合
引物与模板的结合是扩增反应的关键环节。结合时应考虑到引物的解链温度（Tm），Tm过低会导致结合不稳定，而过高则可能导致结合困难。设计引物时应选择与模板具有适当Tm值的引物。
引物设计原则(必看)
mi引物设计原则
1. 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。
2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加。
3. 引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。
4. 引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。
5. 引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo软件中使用的是最邻近法(the nearest neighbor method)。
6. ΔG值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端ΔG值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间ΔG 值相对较高的引物。引物的3’端的ΔG值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。
7. 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。
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1. 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。
2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加。
3. 引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。
4. 引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。
5. 引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo软件中使用的是最邻近法(the nearest neighbor method)。
6. ΔG值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端ΔG值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间ΔG值相对较高的引物。引物的3’端的ΔG值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。
7. 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。
8. 对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR 产物的载体的相应序列而确定。
引物序列应该都是写成5-3方向的，
Tm之间的差异最好控制在1度之内，
另外我觉得扩增长度大一些比较好，500bp左右。
要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。如这一段不能形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。
① 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。② 产物不能形成二级结构。
③ 引物长度一般在15~30碱基之间。④ G+C含量在40%~60%之间。⑤ 碱基要随机分布。⑥ 引物自身不能有连续4个碱基的互补。⑦ 引物之间不能有连续4个碱基的互补。⑧ 引物5′端可以修饰。⑨ 引物3′端不可修饰。⑩ 引物3′端要避开密码子的第3位。
1.引物的特异性引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。
2.避开产物的二级结构区某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。
3.长度寡核苷酸引物长度为15~30bp，一般为20~27mer。引物的有效长度：Ln=2（G+C）+（A+T），Ln值不能大于38，因为>38时，最适延伸温度会超过Taq DNA 聚合酶的最适温度（74℃),不能保证产物的特异性。
+C含量 G+C含量一般为40%~60%。其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度，有效启动温度，一般高于Tm值
5~10℃。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm 为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。
5.碱基础随机分布引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。
6.引物自身引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于3bp。
7.引物之间两引物之间不应不互补性，尤应避免3′端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。
8.引物的3′端引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰。3′端也不能有形成任何二级结构可能，除在特殊的PCR（AS-PCR）反应中，引物3′端不能发生错配。在标准PCR反应体系中，用2U Taq DNA聚合酶和800μmol/L dNTP （四种dNTP各200μmol/L）以质粒（103拷贝）为模板，按95℃，25s；55℃，25s；72℃，1min的循环参数扩增HIV-1 gag基因区的条件下，引物3′端错配对扩增产物的影响是有一定规律的。A∶A错配使产量下降至1/20，A∶G和C∶C 错七下降至1/100。引物A：模板G与引物G：模板A错配对PCR影响是等同的。
9.引物的5′端引物的5′端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。 10.密码子的简并如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。
Hairpin 发卡结构
如果自由能值大于0 则该结构不稳定从而不会干扰反应如果自由能值小于0 则该结构可以干扰反应
二聚体可以在序列相同的两条引物或正反向。引物之间形成如果配对区域在3 末端问题会更为严重3 末端配对很容易引起引物二聚
体扩增使
Pair Rating 匹配度评分匹配度低的引物对常常不太有效是因为在同样退火温度下Tm低的引物决定扩增的特异性而Tm高的引物更易于形成非特异性结合而造成错误的起始
【1】引物的长度以15－30bp为宜，否则会影响扩增的特异性。
【2】】碱基尽可能随机分布，避免相同的碱基成串排列，引物的G+C含量在40％－60％之间，若G+C含量太低，可在5'端加上一些G或C，若G＋C含量太高，可在5'端加上一些A或T。
【3】应避免每条引物内部形成二级结构及两条引物的3'端互补形成引物二聚体，避免在引物的3'端有3个G或3个C成串排列，3'端的末位碱基最好选T、C、G,而不选A，也有建议在引物的两端用1－2个嘌呤碱基。