实例图解简并引物设计

代码 Y S
碱基 C, T G, C
基M
A, C W
A, T
代B
G, C, T V
A, G, C
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码D
A, G, T H
A, C, T
3. 质量评估
•（1）参数评估
将初步得到的引物序列，粘贴入Oligo Calc 的文本框内， 按下“Calculate”按钮，得到引物的相关参数，如：长 度、GC 含量、Tm 值等信息。
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八、详细图解
1. 序列准备： •（1）GenBank 下载PVY 全基因组序列； •（2）由于基因序列比较大，且数量多，推荐用MAFFT 多重序列比对； •（3）扩增片段区域选择，CP 基因长度及位置如下图所示：
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• 先将光标定位在第一条序列任意位置，然后在左下角"Site"处直接输 入 CP 基 因 上 游 分 界 点 位 置 （ 8391 ） 后 回 车 。 接 着 点 击 “Speicaes/Abbrv”和8391 那一列的交界点时按下键盘上“Shift” 不放，移动光标到“1”那一列，此时点击鼠标右键“Delete”删8 除 冗余序列。
二、相关工具
1. MEGA5-多重序列比对、选取基因区域、序列编辑；
2. DNAMAN8-检测两引物的互补性；
3. Oligo Calc-评估引物的属性；
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4. Web Logo 3-直观显示简并碱基。
三、基本原则
设计一对好的引物，归结起来就是 5′端引物、3′端引物之间 以及两者与模板的关系处理得恰到好处：
• 裁切后得到CP 基因编码区序列，“Export Alignment” 导出CP 基因序列（推荐fasta 格式）。
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2. 引物设计
推 荐 先 设 计 3′ 端 引 物 ， 至于原因，上面的【特 别注意】中已提到，这 里不再赘述。
（1）选择引物序列 综合考虑引物设计原则 及特别注意，在CP 基因 3' 端 位 置 选 取 一 段 合 适 的 序 列 （ 784-803bp ） ， 804bp 位置为A 且是第 三个密码子位置，所以 弃去末位的 A 碱基。
1. 两引物的序列要与模板的序列紧密互补；
2. 两引物不能在模板的非目的位点发生错配；
3. 两引物之间尽量减少二聚体或发夹结构生成。
四、延伸原则
1. 引物长度：常用为 18-27bp，最大不可超过 38bp，否 则容易导致延伸温度过高，不适合 DNA 聚合酶反应；
2. GC 含量：一般介于 40%-60%之间，且两个引物之间的 GC 含量相差不能过于悬殊；
1. 不要终止于密码子的第 3 位；
2. 末位碱基避免使用碱基 A；
3. 避免出现3 个以上连续的G 或C，如GCG 或CCC 或GGG；
4. ΔG 的绝对值不可超过 9；
5. 与非特异扩增的序列同源性不能超过70%或有连续8 个互补碱基 源；
6. 不能进行任何修饰。
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六、设计流程
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七、示例背景
3. 碱基分布：随机分布最佳，但避免连续的 GC，GC 富集
区容易导致错误引发反应。
3
五、特别注意
5′端引物的作用主要限定 PCR 产物的长度，对扩增特异性影响不大； 引物的延伸是从3′端开始的，所以 3′端引物是影响特异性扩增的 最关键因素，因此，在实际设计过程中，设计3′端引物时，需要 综合考虑以下几个内容：
马铃薯Y 病毒（Potato virus Y，PVY）是侵染马铃薯、
烟草、辣椒等茄科作物并造成严重危害的病毒之一，广 泛分布全球各马铃薯种植区。RT-PCR 技术具有高度的特 异性和灵敏性等特点，已经成为 PVY 检测最常见的方法。 但由于PVY 株系分化严重，不断有新的重组株系产生， 单一的特异性引物无法适应PVY 不同株系的检测需求， 需要设计一对简并引物以能够满足生产上的检测需求。
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实例图解简并引物设计
一、序言
设计一对合适的引物是PCR 扩 增目的基因成功的关键 ，但许多人往往过度依赖 Primer Premier（以下简称PP）或Oligo 等引物设计软件，有时候引物没设计成， 却身陷软件之中无法自拔。其实，不论特异性引物或简并引物，只要掌握了几个 关键点，手动也可以设计出一对好引物。如果不是大批量设计引物或设计复杂的 引物序列，下面的四个常用工具即可轻松胜任引物设计任务。下文以马铃薯Y 病 毒CP 基因简并引物设计为示例，分享一些个人经验，希望对初学者能起个抛砖引 玉作用。受专业领域及水平所限，文中有不当之处，敬请各位同仁、同学批评指 正。
并碱基代码表（下图），可知C/T/G=B，G/A=R，
简 并 度 =3 ×2 =6 ， 整 理 后 3′ 端 序 列 为
CTTGGAGTBAARAACATGTG，故而需要合成的3′
端引物序列： CACATGTTYTTVACTCCAAG （与
原序列是反向互补关系）。
简 并 碱
代码 R K
碱基 A, G G, T
•（2）自身互补性（Check Self-Complementarity）
点击“Check Self-Complementarity”，检测引物自身 互补性，主要查看“Potential hairpin formation”、 “ 3’ Complementarity ” 、 “ All potential selfannealing sites are marked in red (allowing 1 mismatch)”下方显示内容，如果三项均为“none”，则说 明引物自身不会形成发夹结构且引物自身不会互补，引
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• PS ： 是 否 位 于 密
码子的第3 位，可
以
通
过来自百度文库
“
Tranlated
Protein
Sequences ” -
“
DNA
sequences”切换
查看，如右图，
CP 基 因 的 末 端 3
个碱基是终止密码
子所在的位置，A
是第三位密码子。
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（2）生成 Seq Logo
选定序列后，参考上述步骤，删除冗余序 列，保留CP 基因3‘端序列，同样导出为 Fasta文件，将序列粘贴入Web Logo3的 文本框内或直接上传序列文件，设置相关 参数后点击“Create”生成 Seq Logo 格 式的文件CP-3.fas。
参数设置： “Output format”（输出格
式）推荐用“PDF”，“Color scheme”
（颜色方案）推荐用“Classic (NA)”，
设 置 完 毕 ， 点 击 右 下 角 “ Create
Logo“即可得下图的Seq
Logo
格式文件。 12
到
3'
端
序
列
为
CTTGGAGT(C/T/G)AA(G/A)AACATGTG ， 查 询 简